基因定点突变全攻略

基因定点突变全攻略

一、定点突变的目的

把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。

二、定点突变的原理

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。

通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。

三、引物设计原则

引物设计的一般原则不再重复。

突变引物设计的特殊原则：

（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。

（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC 含量应大于40%）。

（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。

（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。

（5）最好使用经过纯化的引物。

Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5

注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。

四、引物设计实例

以G CG→A CG为例：

5’-CCTCCTTCAGTATGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’

（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。

Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’

Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’

（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通过计算可以看出其Tm低于78℃，这样的引物是不合适的，所以必须调整引物长度。

（3）重新调整引物长度。

Primer #1: 5’-CCT CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC GG-3’

Primer #2: 5’-CC GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG AGG-3’

在引物两端加5mer（斜体下划线处），这样引物的GC含量为45.7%，L值为35，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm为80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），这样的引物就可以用于突变实验了。

五、突变所用聚合酶及Buffer

引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。

除了使用基因定点突变试剂盒，如Stratagene和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTAR TM HS DNA polymerase。

六、如何去掉PCR产物

最简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。

DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。

七、如何拿到质粒

直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序，验证突变结果。

八、图示

九、定点突变操作步骤

[A] 诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-di rect™酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。

1. 设计点突变引物。

[注]参考引物设计指导

2. 准备模板质粒DN A

[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌。在end+型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率没有影响。提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。

3. [选项]对照反应体系（50μl反应体系）

10×Reaction Buffer5μl

pUC18 control plasmid（10ng/μl，total

2μl

20ng）

Control primer mix（20pmol/μl）2μl

dNTP mixture（each 2.5mM）2μl

dH2O 38μl

Muta-direct™ Enzyme1μl

4. 样品反应体系（50μl反应体系）