动物转基因技术的研究现状与应用

动物转基因技术的研究现状与应用

课程：基因工程姓名：迪丽努尔·尼扎木墩学号：2013081605

摘要转基因动物就是指通过人工的方法将外源基因导人动物染色体基

因组，使之稳定表达并能遗传给后代的一类动物。转基因技术的一般方法有原核期胚胎的显微注射法（Microjection）、逆转录病毒载体法、精子载体法、体细胞核移植技术、胚胎干细胞介导的基因转移，这几种方法各有其公优缺点，在动物转基因上均有不同的应用，目前在动物抗病育种、建立诊断和治疗人类疾病的动物模型、利用转基因动物生产药用蛋白质等方面应用越来越广泛。

关键词转基因技术方法研究现状

转基因动物（transgenicanimal）指通过基因工程技术将目的基因导入生殖细胞、早期胚胎干细胞和早期胚胎，并整合到受体细胞的基因组中，它们经过各种发育途径形成所有细胞都包含目的基因的个体，称转基因动物（也称个体表达系统）。导入的基因称为转入基因（transgene），而整个技术则称为转基因技术（transgenictechnology或transgenesis）[1]。现代转基因动物（tx-ansgenicanimal）研究始于20世纪80年代以后,1980年，Gordon等首次获得转基因小鼠目前除转基因小鼠外，转基因兔、绵羊、猪、牛及转基因山羊、转基因鸡、转基因大鼠、转基因猴等陆续育成[2，3]。本文将从转基因动物的原理、主要方法和应用等方面作一综述。

1转基因技术的一般方法

能否将在细胞中进行的遗传修饰过渡到整体以及实现向后代的传递，主要取决于所进行修饰的细胞类型和与其相应的育种技术。迄今为止，能够被有效地用来进行转基因动物研究的途径主要有以下几种[4]：

1.1原核期胚胎的显微注射法（Mi-crojection）

该法由美国人Gordon发明，其主要步骤包括：（1）分离、克隆和重组外源基因，构建载体；（2）将融合基因注入受精卵的原核（一般是雄原核）；（3）将微注射后的受精卵移入假孕母畜的输卵管继续发育。Palmiter等（1982）将带有小鼠金属硫蛋白I基因启动子的大鼠生长激素基因导入小鼠的受精卵，获得“巨型小鼠”，在生命科学领域引起了不小的轰动。按照转基因小鼠的思路，转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因山羊都相继成功。显微注射方法相对简单，整合率高，是目前应用比较广泛，效果比较稳定的制作转基因动物的方法之一。但该方法的整合位点随机，整合一般是多拷贝首尾串联相接，不利于研究基因的结构、功能及表达调控。

1.2逆转录病毒载体法

1.2.1逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎：该方法主要利用逆转录病毒的长末端重复序列（longtermi-nalrepeats，LTRs）区域具有转录启动子活性以及逆转录病毒可以直接整合到宿主染色体上的特点，将外源基因连接到LTRs下部，构建重组载体，直接感染受精卵或微注入囊胚腔中。达到外源基因在宿主染色体上的整合、表达。Salter和Haskell等分别用此方法作出了转基因鸡和牛[5]。

1.2.2逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞：Anthony等[6]（1998）对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎的方法进行了改进。他认为逆转录病毒载体介导的基因整合的关键在于细胞分裂时出现核膜分解。有丝分裂时核膜降解的时间很短。细胞分裂完成后，核膜很快重新形成。而处于减数分裂中期（MⅡ）的卵母

细胞无核膜的时间远长于处于有丝分裂M期的细胞。这为逆转录病毒载体介导的基因插入提供了更大的可能性。研究者利用该方法生产出了4头转乙肝表面抗原基因牛，外源基因在宿主基因组中整合的成功率为100%。逆转录病毒载体法导入外源基因的感染率高，宿主范围广，而且最重要的是外源基因在宿主染色体上以单拷贝整合，有利于研究基因的结构、功能及表达调控。目前，这一特性已被广泛应用于基因定位整合等方面的研究中。

1.3精子载体法

该方法由Brackett最早提出，其要点是精子直接与外源DNA混合培养，外源基因可以进入精子头部，受精后能发育成转基因动物[7]。该方法简单，但其整合率低，已采用脂质体包埋法对其进行了改进。其改进方法是将外源DNA在与精子共同孵育之前用脂质体包埋，脂质体与DNA相互作用形成脂质体-DNA复合体。这种复合体借静电作用吸附于精子表面，与细胞膜融合，将外源基因导入细胞并获得表达[8]。这二种方法都是通过人工授精将外源DNA导入卵母细胞，产生转基因动物。Anthony等[9]尝试了一种新方法：预先将小鼠精子进行破膜处理，再与外源基因共孵育1min，然后将精子的头部显微注入MⅡ期的小鼠卵母细胞，在出生的后代小鼠中转基因阳性率可达20%以上。该项研究揭示，精子膜破损后外源DNA穿过外膜吸附于内膜，更有益于转基因动物的获得。

1.4体细胞核移植技术

世界首例体细胞核移植哺乳动物克隆羊Dolly的诞生，是转基因动物研究史上的又一重大突破。1997年英国PPI公司与罗丝林研究所的科学家联手通过体细胞核移植技术制作了转基因绵羊[10]。研究者们用人凝血因子IX基因和新霉素抗性基因共同转导绵羊胎儿成纤维细胞，然后用G4l8筛选和DNA杂交的方法鉴定其中同时整合了上述两个基因的细胞，以同时整合了两个基因的绵羊胎儿成纤维细胞

作核供体，获得了3只转基因绵羊。Alexan-der等[11]用非转基因母羊与转基因公羊精子人工授精后怀孕40d的胎儿成纤维细胞作核供体，获得了3只转人抗胰蛋白酶基因的奶山羊。毫无疑问体细胞核移植技术可以实现转基因的目动物转基因技术的研究现状与应用2010年10月畜禽业总258期育种繁殖的，并且出生的后代个体100%为转基因个体。这是因为用作核供体的细胞是确证整合了某一外源结构基因的细胞。一旦核移植成功，就意味着得到了转基因动物。

1.5胚胎干细胞介导的基因转移胚胎干细胞（EmbryonicStemCells，ES细胞）是动物早期胚胎（桑葚胚或囊胚）或原始生殖细胞（Primor-dialGermCells，PC-Cs）在体外经分化抑制培养并传代而筛选出来的具有发育全能性的细胞。ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的高度分化潜能，当被注入囊胚腔后可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成。将目的基因转移入ES细胞重新导入囊胚或经筛选后对转入外源基因的ES细胞进行克隆，可培育转基因个体。目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。

2转基因技术的应用

转基因动物是指通过转基因技术将外源基因导入动物生殖细胞,由此稳定整合到动物基因组,并能遗传给后代的动物。目前,转基因动物的研究主要包括三个方面:(1)利用转基因技术进行动物生产改良,培育新品种和提高生产性能,进行基因治疗。(2)利用转基因动物制造具有生物活性的产物,包括器官移植和生物反应器。

(3)利用转基因动物确定研究手段,包括建立疾病模型和发育调控。

2.1在基础理论方面的应用

由于外源动物基因可在转基因动物细胞中整合、表达，并制约于受体基因背景的调控，因此，可把转基因本身当作一个理想的功能标记，进而在理论实践方面得