3贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同
叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。
6叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。
答：（一）悬浮生长细胞的传代：有以下两种方法：
1、直接传代法：①悬浮细胞自然沉淀瓶底；②用吸管吸去上清1/2～2/3；③轻轻吹打成细胞悬液；④等分装入数个培养瓶（皿）
2、离心传代法：①将细胞悬液转移到离心管内；②800～1000r/min离心5min，弃上清；③加新的培养液到离心管内；④吸管吹打成为细胞悬液；⑤分瓶（皿）培养。
（二）半贴壁细胞和贴壁细胞的传代：采用消化法。
消化液是：0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA、二者混合液、最好在37℃或室温（25℃以上）环境进行。
其操作步骤（以25ml培养瓶为例）: （1）弃去旧培养液；（2）漂洗：加入2mll 无Ca2+、Mg2+的PBS，漂洗1次后倒掉；（3）消化：加入消化液，使之铺满细胞表面（待肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，残液继续作用2~3min，轻轻摇动，细胞层可随残液呈片状脱落下来，显微镜下发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时立即终止消化）；（4）吹打：加入完全培养基5mll，用吸管按顺序进行反复吹打瓶壁，吹打时不要用力过大。
（5）调整至合适细胞浓度，分瓶培养。
贴壁细胞和悬浮细胞
聚苯乙烯结构式
每个单位生产的培养瓶的处理方法均 不同，左图为Coning公司的处理方 法。
贴壁细胞在体外培养为什么要贴壁？
重力作用
自然属性
细胞下沉
贴
至瓶底
壁
过
程
分泌细胞外基质 和粘附分子
主要原因
贴壁
细胞外基质和粘附分子
• 英文名： extracellular matrix& cell adhesion molecules, ECM&CAM • 定义：细胞粘附分子是众多介导细胞间 或细胞与细胞外间相互接触和结合分子 的统称； 细胞外基质：是由动物细胞合成并分泌到 胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子。
• 接触抑制的原理：细胞膜上有糖类和蛋白质共同构成的糖蛋白,也叫做糖被,它在 细胞上起识别作用. 当细胞增殖到一定程度,也就是互相挨在一起的时候,糖蛋白 识别了这种信息,就会使细胞停止继续繁殖。
贴壁细胞的单层生长
• 一般认为接触抑制是细胞间的一种识别作用，对多细胞动物的形态形成与稳定 具有重要性的作用。关于细胞的增殖，也有接触抑制的问题，进行单层培养的 细胞，在培养器的底部形成一层后，在它的上面就会看到增殖停止，而不会形 成多层。
二者大多数均为糖蛋白，因此具有较强的 亲水性——因此能不能贴壁不仅仅关乎细 胞是否有这种能力，也与有无合适的底物 （培养瓶）相关。
培养瓶的材质
• 最早的细胞培养器皿是由玻璃制作的，由于玻璃的表面是亲水的，不经过特殊 的处理，普通的细胞就可以贴附生长。 思考：玻璃的培养瓶有哪些缺点？
贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同培训
贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同培训
首先，在细胞生长形态上，贴壁细胞通常呈现典型的单层或多层附着
细胞的形态，细胞扩张生长速度较慢，细胞形态变化较小。
而悬浮细胞则
以单个细胞或细胞集合体的形式存在于液体培养基中，生长速度较快，细
胞形态较为多样化。
其次，在培养条件上，贴壁细胞需要在培养基中添加黏附分子或包袋
来增加其附着能力，以保持细胞在培养皿底部的黏附和生长。
而悬浮细胞
则需要在培养基中添加抗聚集剂或搅拌设备来避免细胞结块，以保持细胞
的均匀悬浮和生长。
再次，在传代方法上，贴壁细胞传代通常采用单层脱离法或酶消化法。
单层脱离法利用细胞与培养皿表面的非共价键结合进行脱离，可通过物理
刮擦或液体冲击等方法将细胞从培养皿上收集下来。
酶消化法则通过加入
蛋白酶等酶类物质分解黏附细胞与基质之间的胶原纤维等结构，使细胞能
够从培养皿表面脱离。
而悬浮细胞传代则更为简单，通常只需要将培养基
中的细胞离心沉淀后，将上清液中的细胞重新悬浮于新的培养基中即可。
此外，在培养基的选择上，贴壁细胞通常需要使用固体培养基，例如
含有胶原蛋白、明胶或滤纸等的培养基。
而悬浮细胞则需要使用液体培养基，例如含有血清或植物基因表达培养基等。
最后，在细胞应用方面，贴壁细胞通常用于细胞粘附、增殖和分化等
研究领域，如肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞等。
而悬浮细胞则常用于
细胞悬浮培养、蛋白质表达和病毒培养等研究领域，如白细胞、骨髓细胞
和病毒感染细胞等。
细胞传代培养实验
实验步骤
注意事项
1. 吹打制悬：用吸管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2. 吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入 10 ml 离心管中。 3. 平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以 1 000 转/分钟离心 5 分钟。 4. 弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入 2 ml 培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬 液。 四、分装稀释细胞 1. 分装：将细胞悬液吸出分装至 2~3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的 5 生长，传代细胞的密度应该不低于 5×10 /ml，最后要做好标记。 五、传代培养 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入 CO2 培养箱中继续培养。传代细胞 2 小时后开始贴附 在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积 25%时为一个+，占 50%为++，占 75%时为+++。
（细胞培养技 术）实验方法 原理
培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。 贴壁生长的细胞用消化法传代； 部分贴壁生长的细胞 用直接吹打可传代； 悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代， 或用自然沉降法吸除上 清后，再吹打传代。
实验材料
细胞
试剂、试剂盒
D-Hanks 液小牛血清 RPMI1640 双抗胰蛋白酶 EDTANHClNaHCO3
收起
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
注意事项
1. 严格的无菌操作 2. 适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消 化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立 即终止消化。 附：0.25% 胰酶（胰蛋白酶，Trypsin） 配方：100 ml PBS，0.25 g 胰酶。 步骤：先配 100 ml PBS。 称胰酶 0.25 g。加入 PBS 中，低速搅拌。调 pH7.4。过滤，分装，-20℃ 保存，4℃短期内用完。 注意：低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。低温，防止酶失活；对难 消化的细胞，在上述配方中，加入 0.02 g 的 EDTA（0.02%） 根据细胞生长的恃点，传代方法有 3 种：悬浮生长细胞传代、半悬浮生长细胞传代（Hela 细胞） 、贴壁生长细胞传代。
贴壁培养与悬浮培养的区别
6 生长过程
潜伏期：悬浮,胞质回缩, 全部细胞 变为圆球形。贴附底物。有运动活 动,基本无增殖, 少见分裂相。 指数增长期：是细胞增生最活跃、 活力最旺盛的阶段培养物中细胞数 量呈指数增长,细胞群体均一。 停滞期：细胞数量达饱和密度后， 细胞遂停止增殖，进入停滞期。
7 传代培养
贴壁细胞 酶消化法传代：弃去培养液，加胰酶消化，加培 养液终止胰酶作用，离心，去上清，吹打成悬液， 分装传代。 悬浮细胞 离心法传代：离心，弃上清液，加新鲜培养基， 分装传代。 直接传代法：待细胞沉淀，倾去1/3-2/3培养液， 用吸管吹打形成细胞悬液再传代。
贴壁培养
悬浮培养
适合包括原代细胞在内的大多数细胞类 型
适合已适应悬浮培养的细胞以及其他一 些无粘附性的细胞
需要定期传代，但是易于通过倒置显微 镜观察。显微镜下观察形态多种。晃动 培养液时，细胞不动 利用酶或机械方法解离细胞 需要使用经过组织培养处理的容器
较易传代，但是需要每天进行细胞计数 和存活率测定。显微镜下观察呈圆形。 晃动培养液时，细胞也随着漂动 无需通过酶或机械方法解离细胞 可使用未经组织培养处理的容器，但需 进行搅动以便进行充分的气体交换 可批量收获产物，用于蛋白质的大量生 产及多种研究领域
可连续收获产物，用于细胞学研究等多 种研究领域
细胞生长受表面积限制
细胞生长受培养基中浓度的限制
悬浮细胞培养
温度
植物悬浮细胞系：23-27℃
pH
哺乳动物系：7.0-7.4 成纤维细胞系：7.4-7.7
植物细胞：5.6-6.0
培养基
需血清
悬浮培养基可不需血清
5 细胞形态
贴壁培养细胞：成纤维细胞型 上皮细胞型 游走细 胞型 多型细胞型 悬浮培养细胞：悬浮型
生物选择性必修三生物技术与工程第三章动物细胞工程【1】细胞培养是动物细胞工程的基础
探究点二 动物细胞培养的技术流程
下图是动物细胞培养的基本 流程图。据图回答下列问题。
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较,分化程度低的细胞与分化程度 高的细胞比较,哪些细胞更易于培养?为什么? 提示 幼龄动物的细胞和分化程度低的细胞更易培养,原因是这些细胞的分 裂能力强。 2.进行动物细胞培养时,常用胰蛋白酶分散细胞,这说明细胞间的物质除了 水以外主要是什么?能否使用胃蛋白酶处理?为什么? 提示 蛋白质。不能使用胃蛋白酶处理,因为胃蛋白酶的最适pH是1.5左右, 而动物细胞培养液的pH为7.2~7.4,在此环境下,胃蛋白酶无活性。
[探究应用] 1.动物细胞培养需要满足一定的气体环境,下列相关叙述错误的是( ) A.O2的作用是为细胞需氧呼吸提供原料 B.CO2的作用是维持培养液的pH C.通常采用培养皿或松盖培养瓶培养 D.CO2培养箱内应含有95%的O2和5%的CO2 答案 D 解析 CO2培养箱内应含有95%的空气和5%的CO2,D项错误。
2.在进行动物细胞培养时,需要( ) A.用胃蛋白酶处理以获得细胞悬液 B.充入5%的CO2以刺激细胞正常呼吸 C.加入经高压蒸汽灭菌的血清以提供营养 D.定期更换培养液以清除代谢产物
答案 D 解析 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理以获得细胞悬液,A项不符合题意;充入 5%的CO2是为了维持培养液的pH相对稳定,B项不符合题意;加入血清为动 物细胞培养提供营养,高压蒸汽灭菌会破坏血清中的活性成分,C项不符合 题意;定期更换培养液以清除代谢产物,D项符合题意。
特别提醒动物细胞培养的注意事项 (1)动物细胞培养所用的通常是液体培养基,其并非完全的合成培养基,因 为还添加了动物血清等天然成分。 (2)在动物细胞培养过程中,应该对培养液和培养用具进行灭菌而非消毒。 (3)动物细胞培养时,二氧化碳培养箱内应含有5%的CO2和95%的空气,而非 5%的CO2和95%的O2。
细胞传代
贴壁细胞：弃去培养液，加胰酶消化，加培养液终止胰酶作用，吹打成悬液，分装传代。
由于贴壁细胞贴壁生长，接触抑制，长满一瓶后贴壁较紧，不易取出。
这时必须用胰蛋白酶或者胶原蛋白酶处理，使其分散开后取出，然后在放入新的培养瓶中培养。
悬浮细胞：离心，弃上清液，加新鲜培养基，分装传代。
悬浮细胞其实也有贴壁现象，只是贴壁不牢。
可以直接用吹打发是细胞掉落下来，进行传代。
传代培养中的细胞传代培养（subculture），当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。
此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。
这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。
对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
传代方法1．悬浮生长细胞传代传代培养中的细胞离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。
2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
3．贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。
常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。
培养材料1、无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS,GibcoBRL21600-010)传代培养中的细胞2、trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：以10ml分装于15ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。
3、新鲜培养基4、无菌吸管/离心管/培养瓶编辑本段培养步骤1、附着型胞(adherentcell)（1）吸掉旧培养液。
悬浮细胞培养
悬浮细胞培养介绍悬浮细胞培养是一种将细胞以悬浮状态培养的方法。
相对于贴壁细胞培养，悬浮细胞培养能够更好地模拟细胞在体内自由悬浮的环境，适用于许多细胞类型的培养和研究。
悬浮细胞培养技术在生物学、医学和生物工程领域得到了广泛应用。
本文将介绍悬浮细胞培养的基本原理、培养条件和常用的培养方法。
基本原理悬浮细胞培养的基本原理是将细胞以悬浮状态培养在培养基中，培养基提供了细胞生长所需的营养物质和环境因素。
在悬浮培养中，培养基通常包含以下主要组分：1.基础培养液：如DMEM（Dulbecco’s Modified EagleMedium）或RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640），提供细胞生长所需的营养物质，如糖类、氨基酸和维生素等。
2.补充物：根据细胞类型的不同，可以添加血清、生长因子、细胞因子等，以促进细胞生长和增殖。
3.pH缓冲剂和非酶性胎牛血清：用于稳定培养基的pH值和提供额外的营养和辅助因子。
在悬浮细胞培养过程中，细胞应保持以单个细胞的形式悬浮在培养基中，以避免细胞聚集和堆积。
为了实现这一点，通常需要采取一些措施，如定期的细胞传代、培养器皿的选择和培养条件的调节等。
培养条件悬浮细胞培养需要适宜的培养条件来维持细胞的健康生长和增殖。
以下是一些常见的悬浮细胞培养条件：1.培养温度：通常在37°C下培养，但也有一些细胞需要较低的温度，如4°C或30°C。
2.CO2浓度：大多数悬浮细胞培养需要保持适宜的CO2浓度，通常在5%左右。
CO2能够调节培养基的pH 值，提供适宜的细胞生长环境。
3.氧气浓度：氧气浓度对悬浮细胞的生长和代谢有重要影响。
不同类型的细胞对氧气浓度的要求有所不同，一些细胞需要低氧（如2-5%）环境才能生长，而另一些细胞则需要高氧环境。
4.搅拌：悬浮细胞培养过程中需要进行适当的搅拌来保持细胞的均匀分布和培养基中氧气、营养物质的均匀分布。
有关贴壁型细胞与悬浮型细胞的介绍
有关贴壁型细胞与悬浮型细胞的介绍体外培养大多培养在瓶皿等容器中，按照它们是否能贴附在支持物上生长的特性，可分为悬浮型和贴壁型两大类。
（一）悬浮型细胞简称悬浮细胞。
在体外培养时，这些细胞属于非贴壁依靠的细胞，这些细胞的细胞质膜也会与培养液底发生黏连，但最多不超过5％的表面与培养液底发生类似于细胞衔接样的黏连，显微视场下细胞往往呈球形。
悬浮型细胞主要是来源于血液、淋巴组织的细胞，骨髓瘤构建的各种杂交瘤细胞，某些肿瘤细胞和转化细胞。
细胞呈圆形，普通不贴于支持物上，呈悬浮生长。
这类细胞简单大量繁殖。
体外培养的细胞类型中，少数细胞种类在培养时不贴附于支持物上，而以悬浮状态生长，包括一些取自血、脾或骨髓的原代细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞。
某些来源于此类细胞的细胞株或细胞系也呈悬浮状态生长。
细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小的细胞团，胞体为圆形。
其优点是在培养液中生长，生存空间大，允许长时光生长，便于大量繁殖。
属于悬浮型细胞频繁的细胞株系有小鼠腹水瘤S180、小鼠瘤NS1和SP2/0，人造血系肿瘤细胞U937、HL60、K562等。
（二）贴壁型细胞简称贴壁细胞。
在体外培养时，贴壁型细胞就是那些贴壁依靠的细胞，在汇集成单层生长以前，它们的细胞质膜超过30％的表面与培养液底发生类似与细胞衔接样的黏连，显微视场下细胞普通为扁平状的各种形态。
需要注重的是，贴壁型细胞汇集生长形成单层以后，失去接触抑制的那些细胞株或细胞系的细胞培养物中，经常可见或多或少的悬浮样细胞浮现。
贴壁型细胞包括大多数哺乳动物的淋巴和血液以外的组织细胞，以及多数肿瘤细胞。
需要贴附在带适量正电荷的固体或半固体表面才干正常生长和分裂。
大多数培养细胞均为贴壁型，它们必需贴附在支持物表面生长，这类细胞在体内时各自具有其特别的形态，但在体外培养时贴附于支持物后形态上表现单一化而失去体内原有的某些特征，多呈上皮样或成纤维细胞样。
正常贴壁型细胞具有接触抑制和密度抑制的双重特性，细胞互相接触后可抑制细胞的运动，因此细胞第1页共2页。
思考题 中山大学考研细胞学
第一章：1. 根据细胞生物学研究的内容与你所掌握的生命科学知识,客观地、恰当地估价细胞生物学在生命科学中所处的地位以及它与其它生物科学的关系。
2. 从细胞学发展简史，你如何认识细胞学说的重要意义?3. 试简明扼要地分析细胞生物学学科形成的客观条件以及它今后发展的主要趋势。
4. 当前细胞生物学研究的热点课题中你最感兴趣的是哪些？为什么？第二章：1. 简述各种实验方法的基本原理。
2. 简述各种实验方法在研究工作中的应用。
第三章：生物膜的基本组成和结构特征是什么? 这些特征与膜的功能有哪些相?从生物膜结构模型的演化谈谈人们对生物膜结构的认识过程?细胞表面有哪几种常见的特化结构?跨膜运输的主要方式有哪些？比较主动运输与被动运输的特点及其生物学意义。
动物细胞间有哪些连接方式?胞间连丝的基本结构与作用是什么？胞外基质的组成、分子结构及主要生物学功能是什么？第四章：1.比较粗面内质网和光面内质网的形态结构与功能。
2. 细胞内蛋白质合成部位及其去向如何?3. 粗面内质网上合成哪几类蛋白质，它们在内质网上合成的生物学意义是什么?4. 指导分泌性蛋白在粗面内质网上合成需要哪些主要结构或因子?它们如何协同作用完成肽链在内质网上的合成。
5. 结合高尔基体的结构特征，谈谈它是怎样行使其生理功能的。
6.溶酶体是怎样发生的? 它有哪些基本功能?7.过氧化物酶体与溶酶体有哪些区别? 怎样理解过氧化物酶体是异质性的细胞器?8.图解说明细胞内膜系统的各种细胞器在结构与功能上的联系。
9.何谓蛋白质的分选？已知膜泡运输有哪几种类型？第五章：1．准确描述线粒体的结构2．线粒体中电子传递链的主要成员有哪些？3．解释ATP合成的化学渗透学说4．何谓线粒体的半自主性5．准确描述叶绿体的结构6．光系统Ⅰ和光系统Ⅱ在光合作用中的作用7．叶绿体的半自主性第六章：1. 通过细胞骨架一章的学习，你对生命体的自组装原则有何认识?2. 除支持和运动外，细胞骨架还有什么功能? 怎样理解“骨架”的概念?3. 试述微管在体外组装的条件以及微管的主要功能。
细胞培养复习题(含答案)
1.体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种? 按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型?⑴按生长方式分为二型:粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。
悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面, 而在悬浮状态下即可生长的细胞。
（绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。
）⑵可分四型: (1)上皮型细胞 (2)成纤维型细胞 (3)游走型细胞 (4)多形型细胞2.简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程⑴通常, 体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段:①原代培养期: 也称初代培养, 是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。
此期的细胞呈现出活跃移动的特点, 可见细胞分裂, 但不旺盛。
处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。
细胞群具有明显的异质性, 细胞间的相互依存性强, 在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。
②. 传代期：通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期, 原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系。
一般情况下, 正常体细胞在传代10-50次左右后, 细胞分裂的能力就会逐渐减弱, 甚至完全丧失, 细胞便进入衰退期。
③衰退期：处于衰退期的培养细胞, 增殖速率已经变得很慢或不再增殖, 直至最后衰退死亡。
以上特点, 主要是针对体外培养的机体正常细胞, 对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言, 永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力, 这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。
⑵每代贴附生长细胞的生长过程：①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态, 也称悬浮期。
此时细胞质回缩, 胞体呈圆球形。
时间：10分钟一4小时②贴壁期：细胞附着于底物上, 游离期结束。
底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等③潜伏期：此时细胞有生长活动, 而无细胞分裂。
细胞株潜伏期一般为6～24小时。
④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长, 活力最佳, 最适合进行实验研究。
细胞的传代培养
实验二细胞的传代培养【实验目的】1. 掌握贴壁细胞换液和细胞传代的方法。
2. 了解细胞传代培养的意义。
【实验原理】细胞在培养瓶里的生长，分为贴壁生长和悬浮生长。
贴壁生长细胞在培养瓶中生长数天后，就会在培养瓶底部长满，如果不进行处理，就会继续生长而产生堆积，最后因缺乏营养供给而死亡。
因此当细胞生长贴满瓶底时，就需要将细胞消化下来，并接种成多瓶细胞，使细胞继续生长。
这一处理接种的过程就叫传代，每接种一次就叫做传一代。
细胞传代培养使得细胞增殖，可获得大量细胞供实验所需。
传代培养是组织培养常规保种方法之一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。
接种后的细胞放在培养箱里静置培养，培养的温度视动物种类而定。
一般，温水性鱼类细胞的最适培养温度为25℃，热带鱼类细胞为30℃，冷水鱼类细胞为20℃，哺乳动物细胞为37℃。
细胞培养过程中常出现培养基营养缺乏、代谢产物增多、变酸等不适宜细胞生长因素，而此时细胞还未生长达到饱和密度（没有贴满底部），仍需继续培养，因而需要更新营养液来更新营养成分，以满足细胞继续生长繁殖的需要，这一过程叫换液。
单纯换液不需要接种细胞。
【试剂、材料与仪器】试剂：生长培养基（PRMI-1640 或MEM，添加10% 小牛血清或胎牛血清），0.25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL、10 mL），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
【实验步骤】工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30 分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。
在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶等。
1．观察细胞：倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代，当细胞长满瓶底时可以传代；2．超净工作台准备：将试剂瓶、培养瓶等培养用具用酒精喷洒，用消毒纱布擦净，置于超净工作台酒精灯左侧；3．开盖：旋开细胞培养瓶瓶盖，将瓶盖侧立于（严禁倒扣放置）酒精灯旁，培养瓶瓶口、瓶盖均需过酒精灯火焰后再盖好；4．清洗细胞表面：打开移液管盒，用普镊捏住移液管（5mL）后部从盒子中拖出（注意移液管的管壁和管口不能碰到其他物品），安装好加液枪，移液管管口和管壁均过酒精灯火焰。
[课件]贴壁细胞和悬浮细胞PPT
![[课件]贴壁细胞和悬浮细胞PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/d284822979563c1ec5da7167.png)
的处理，普通的细胞就可以贴附生长。
思考：玻璃的培养瓶有哪些缺点？
• 随着有机化学工业的发展，人们合成了聚苯乙烯（Polystyrene），简称PS。
此后每次看到别人说PS……，我都会想到聚苯乙烯，o(╯□╰)o。
• PS： PS透光性能好，具有较好的强度和易塑性，并且没有毒性。
因此有一天一个学生物的孩子突发奇想，这聚苯乙烯做成培养瓶岂不刚好？
贴壁细胞在体外培养为什么要贴壁？
重力作用
自然属性 贴 壁 过 程细胞下沉 至瓶底源自分泌细胞外基质 和粘附分子
主要原因
贴壁
细胞外基质和粘附分子
• 英文名： extracellular matrix& cell adhesion molecules, ECM&CAM • 定义：细胞粘附分子是众多介导细胞间
化学帝：你有机化学是体育老师教的吧。。。。
聚苯乙烯
• 聚苯乙烯结构表明了它是疏水的，即不具有亲水性，所
以未经过特殊处理的聚苯乙烯培养瓶不能使贴壁细胞正
常贴壁。
• 生物控表示很伤心，化学帝很淡定的笑了笑：哥可以改
造它。于是就有了今天广泛使用的聚苯乙烯培养瓶。
• TC处理（ Tissue Culture Treated ）： TC处理表示该
贴壁细胞和悬浮细胞
悬浮细胞
• 英文名：Suspension Cell
• 定义：细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，这类细胞称
为悬浮细胞。
• 悬浮培养的细胞一般为淋巴细胞等血液系统来源的
细胞，这种细胞体积小，它们天生就生活在悬液 （血液中）。由于缺乏粘附分子的表达，在培养基 中便自然呈现悬浮状态，细胞大体呈球形或椭球形。
细胞传代培养
细胞传代培养1.细胞传代概念传代即去除原培养基并将细胞从原培养体系转移到新鲜的生长培养基中，该过程可使细胞系或细胞株进一步增殖。
接种后培养细胞的生长将从延滞期进入对数期，即：细胞呈指数增殖。
当贴壁培养的细胞已占据所有可用基质、没有扩增空间，或者悬浮培养的细胞已超过培养基所能支撑的能力，无法进一步生长时，细胞增殖速度将大大降低甚至完全停止(参见下图)。
为了将细胞密度维持在最佳水平，以便细胞继续生长，并且刺激其进一步增殖，必须将培养物分成若干部分，并添加新鲜培养基。
2.细胞传代标准（1）细胞密度哺乳动物细胞：贴壁培养细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时即应进行传代。
正常细胞达到汇合状态时会停止生长(接触抑制),重新接种后需要较长时间才能恢复。
转化细胞即使达到汇合状态也能继续增殖，但是在经过大约两个倍增时间后通常会变质。
类似地，悬浮培养的细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时也应进行传代。
到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。
昆虫动物细胞：昆虫细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时应进行传代。
牢固贴壁的昆虫细胞达到汇合状态时也可传代，虽然此时细胞更容易从培养容器上解离下来，但是如果反复将昆虫细胞在密度超过汇合的状态下传代，细胞的倍增次数会减少，活力会降低，贴壁能力也会下降。
另一方面，将贴壁培养的昆虫细胞在达到汇合状态前传代要较大的机械力，才能使细胞从单细胞层中脱离。
反复在达到汇合状态前传代，会导致细胞倍增次数减少，活力降低，健康度较差。
（2）培养基耗竭哺乳动物细胞：生长培养基pH 值降低通常表示乳酸蓄积，乳酸是细胞代谢的副产物。
乳酸有细胞毒性，而且pH值降低也是细胞生长的不利因素。
pH值改变的速度通常取决于培养体系中的细胞浓度，细胞浓度越高，培养基耗竭的速度越快。
如果发现 pH 值迅速降低(>0.1-0.2 pH 单位),同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。
昆虫细胞：用于昆虫细胞培养的生长培养基通常比哺乳动物细胞培养基酸度大。
常用细胞培养技术 传代1原代培养细胞的首次传代
12
4.反复贴壁法
– 成纤维细胞：贴壁快（10-30min）； – 上皮细胞：短时间不能附着或附着不稳定，
稍振荡即浮起
据此纯化细胞。
方法： – 镜下观察，部分细胞贴壁后 – 摇荡培养基，倒掉 – 反复多次，达到去除上皮细胞的目的。
2023/10/18
2023/10/18
13
5.克隆法
• 稀释细胞，使单个细胞在体外增殖6代以上，形成的细胞群称 作克隆。每个克隆含50个以上细胞，一个克隆起源一个细胞，
2、生长的密度抑制。
2023/10/18
3
贴壁细胞的消化传代步骤
(1)吸除旧培养基 (2)加2mLPBS（无钙、镁），漂洗一次 (3)加1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混
合液）
(4)轻摇培养瓶，消化液铺满细胞表面
2023/10/18
2023/10/18
4
(4) 镜下见细胞回缩，细胞间隙增大，倒掉消化
2023/10/18
2023/10/18
16
(4) 镜下见细胞回缩，细胞间隙增大，倒掉消化液，再继续
作用2～3分钟。
(5)镜下见变圆，立即终止消化。 (6)加完全培养基，反复吹打；
– 吹打按顺序进行，确保所有瓶壁均吹到 – 吹打要轻柔，不要出现泡沫，避免机械损伤
(7) 计数，调整浓度，分瓶培养。
2023/10/18
抑制其他细胞生长。
主要有以下5种方法：
2023/10/18
2023/10/18
10
1.培养基限定法：细胞生长过程中，必须存在或去
除某种物质，否则无法生长，而其他细胞与之相反。
– 例如加入特殊的细胞因子而纯化出只依赖于这种细胞因子 生长的细胞系。
3贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同
10.细胞瓶口靠近火焰翻开瓶盖并在酒精灯上烧口消 毒，倒掉或吸出培育基〔对于小口的培育瓶可承受 倾倒方法,对于培育皿,必需用吸管吸出〕 11.加一滴管胰酶轻轻漂洗一下细胞，弃胰酶，再参 加一滴管或两滴管胰酶〔以盖住细胞量为准，转动 培育瓶，使其潮湿整个细胞层，盖好瓶盖。 12.显微镜下观看细胞的消化状态，待细胞大局部收 缩、突起、一半变圆，细胞边界清晰时，即可立起 或翻转培育瓶停顿消化，在超净台内靠近火焰处弃 胰酶
一、试验原理 细胞贴壁过程
培育细胞一代生长过程
什么时候传代？
细胞消化的最正确程度
要求 冻存条件 操作要点
细胞冻存
二、试验目的
把握无菌操作技术。
把握传代细胞的培育的一般方法与步 骤。
把握培育细胞的消化方法。
了解在倒置相差显微镜下观看培育细 胞的形态和生长状况。
三、试验材料及设备 1. 细胞
5.点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸 管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试 管内。
6.将培育用液〔90mL) 瓶口用75%酒精消毒，过酒精 灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
7. 翻开血清〔10.5mL) 瓶，瓶口过酒精灯火焰后斜置 于酒精灯旁的架子上。
8. 无菌吸取10mL血清参加到培育液〔90mL)中，用 微量移液器参加双抗100μL轻轻混匀，配置完全培 育基。
13. 加两滴管〔约1.8-2mL〕冻存液既全面吹打细胞瓶 壁,吹打均匀，细胞浓度宜大，3×106个/mL左右。
将细胞悬液吸至冻存管中，拧好盖，封好胶布，并标 记好细胞种类，冻存时间，保存条件以及冻存者姓 名等〔悬浮细胞冻存将细胞离心后再加冻存液〕
生物技术制药第二版课后思考题及答案（全）
生物技术制药第二版课后思考题及答案（全）1. 生物技术制药分为哪些类型？生物技术制药分为四大类：（1）应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂。
（2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等（3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物（4）合成与部分合成的生物药物2．生物技术制药具有什么特征？（1）分子结构复杂（2）具有种属特异性（3）治疗针对性强，疗效高（4）稳定性差（5）基因稳定性（6）免疫原性（7）体内的半衰期短（8）受体效应（9）多效性（10）检验的特殊性3.生物技术制药中有哪些应用？应用主要有：（1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物（2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产物（3）酶工程制药（4）发酵工程制药4.基因工程药物制造的主要程序有哪些？基因工程药物制造的主要步骤有：目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验5.影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？（1）外源基因的计量（2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱b、核糖体的结合位点 c、SD序列和起始密码的间距 d、密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件6.质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。
质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。
提高质粒稳定性的方法如下：（1）选择合适的宿主细菌2）选择合适的载体（3）选择压力（4）分阶段控制培养（5）控制培养条件（6）固定化7.影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数？影响因素：（1）培养基（2）接种量（3）温度（4）溶解氧（5）诱导时机的影响（6）诱导表达程序（7） PH值8.什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L 影响因素：（1）培养基（2）溶氧浓度（3）PH (4)温度（5）代谢副产物实现高密度发酵的方法：（1）改进发酵条件：a、培养基 b、建立流加式培养基 c、提高供养能力（2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻断乙酸产生的主要途径 b、对碳代谢流进行分流 c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流d、引入血红蛋白基因（3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌9.分离纯化常用的色谱分离方法有哪些?它们的原理是什么?方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
13. 加两滴管（约1.8-2mL）冻存液既全面吹打细胞瓶 壁,吹打均匀，细胞浓度宜大，3×106个/mL左右。 14. 将细胞悬液吸至冻存管中，拧好盖，封好胶布，并 标记好细胞种类，冻存时间，保存条件以及冻存者 姓名等（悬浮细胞冻存将细胞离心后再加冻存液） 15. 在培养瓶(残余少量细胞）中加入5mL完全培养及， 盖好瓶盖（拧紧后并旋回半圈）。做好记录，倒置 相差显微镜下观察细胞的形态，放入CO2培养箱培 养。 16. 冻存管在4度以下存放30min，转放到－20度 1.5－ 2h，再转到－70度4－12h后即可转移到液氮内， 注意做好冻存记录。
10.细胞瓶口靠近火焰打开瓶盖并在酒精灯上烧口消 毒，倒掉或吸出培养基（对于小口的培养瓶可采用 倾倒方法,对于培养皿,必须用吸管吸出） 11.加一滴管胰酶轻轻漂洗一下细胞，弃胰酶，再加 入一滴管或两滴管胰酶（以盖住细胞量为准，转动 培养瓶，使其湿润整个细胞层，盖好瓶盖。 12.显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收 缩、突起、一半变圆，细胞边界清晰时，即可立起 或翻转培养瓶停止消化，在超净台内靠近火焰处弃 胰酶
1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是 关键步骤? 2.细胞胞传代培养的目的是什么? 3.贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同? 4.如何估计是否传代和传代的方式? 5.细胞冻存应注意的问题。
实验三、细胞的传代与冻存
1.细胞培养中为什么添加血清？
2.使用血清需注意哪些方面？
3.消化液胰酶的浓度是多少？
4.使用小滤器过滤要注意哪些？
针头滤器使用应注意的问题
1.拧紧滤器
2.注射器吸液体 3.注射器插好滤器 4.对着烧杯慢推压针芯看是否漏 5.如不漏对小瓶过滤。 6.滤器放在小瓶瓶口上，取下针头再吸液体， 反复多次，滤完。 7.检查滤器滤膜是否完好。
四、实验步骤
1.准备：超净工作台紫外线处理30分钟, 用肥皂洗手, 穿鞋套，用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。 2. 倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要 传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置室温下 预热。 3．关闭超净台紫外灯, 打开可见光灯开关,打开抽风 机清洁空气，除去臭氧。用75%酒精擦双手消毒 。 4. 正确摆放超净台内的实验用品：酒精灯、酒精棉 球、新洁尔灭纱布、试管架、滴管筒（头）、吸管 筒（头）、废液缸等。点燃酒精灯，准备好实验试 剂：DMEM培养基（其中血清含量10%）、 血清、 胰酶等。
5.点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸 管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试 管内。 6.将培养用液（90mL) 瓶口用75%酒精消毒，过酒精 灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7. 打开血清（10.5mL) 瓶，瓶口过酒精灯火焰后斜置 于酒精灯旁的架子上。 8. 无菌吸取 10mL 血清加入到培养液（ 90mL) 中，用 微量移液器加入双抗100μL轻轻混匀，配置完全培 养基。 9. 在血清中（剩余0.5mL) 加入4mL完全培养基轻轻 混匀，加入0.5mL DMSO（冻存保护剂），轻轻混 匀即为冻存液 。
一、实验原理
细胞贴壁过程
培养细胞一代生长过程
什么时候传代？
细胞消化的最佳程度
细胞冻存
要求
冻存条件
操作要点
Hale Waihona Puke 二、实验目的掌握无菌操作技术。
掌握传代细胞的培养的一般方法与步骤。
掌握培养细胞的消化方法。
了解在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和 生长状况。
三、实验材料及设备
1. 细胞 人宫颈癌HeLa 细胞 人胃癌BGC-823细胞 2. 试剂 胰酶、DMEM培养基、血清、DMSO、抗生素 3. 仪器 超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜 4.其它用品： 培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸， 75％酒精棉球，酒精灯
注意事项
把握好传代时机，80-90%汇合度阶段最好，过 早细胞产量少，过晚细胞健康状态不佳 消化时间要适度，过短细胞不易脱落，过长细胞 可脱落流失。 消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞 反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失。 不同细胞对消化反应不同。 贴壁不牢—直接吹下—细胞损伤
思考题