蛋白质组学与分析技术第二讲
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蛋白质组学PPT课件
代谢性疾病蛋白质组学研究通过对糖尿病、肥胖症等代谢 性疾病相关蛋白质的分析，发现了一些与代谢过程密切相 关的关键蛋白质。这些蛋白质涉及糖代谢、脂肪代谢等多 个方面，为药物研发和个体化治疗提供了新的思路和靶点 。同时，对代谢性疾病蛋白质组学的研究也有助于深入了 解疾病的发病机制，为疾病的预防和治疗提供科学依据。
蛋白质组学揭示基因表达 的复杂性
蛋白质组学研究关注基因表达的最终产物蛋白质，揭示了基因表达的复杂性和多样性 。蛋白质的表达和功能受到多种因素的影响 ，如翻译后修饰、蛋白质相互作用等，这些
因素在基因组学研究中难以全面考虑。
蛋白质组学与代谢组学的关系
代谢组学为蛋白质组学提供上下文
代谢组学研究生物体内小分子代谢物的变化，为蛋白质组学提供了上下文和背景。蛋白 质的功能和表达往往与代谢物的变化相互关联，了解代谢物的变化有助于更深入地理解 Nhomakorabea02
蛋白质组学研究技术
蛋白质分离技术
双向凝胶电泳技术
通过改变电泳的pH值和电场强度， 将复杂的蛋白质混合物分离成多 个有序的蛋白质带，以便后续的 鉴定和分析。
蛋白质芯片技术
将蛋白质固定在固相支持物上， 通过与特定的配体或抗体相互作 用，实现对蛋白质的快速、高通 量筛选和检测。
蛋白质免疫沉淀技
术
利用抗体与目标蛋白质的特异性 结合，将目标蛋白质从复杂的混 合物中分离出来，常用于蛋白质 相互作用的研究。
详细描述
癌症蛋白质组学研究通过对癌症细胞和正常细胞蛋白 质表达谱的比较，发现了一系列与癌症发生发展相关 的关键蛋白质。这些蛋白质涉及细胞信号转导、细胞 周期调控、细胞凋亡等多个方面，为癌症治疗提供了 潜在的药物靶点。
案例二：神经退行性疾病蛋白质组学研究
蛋白质组学全部全套ppt课件
1961 1966
Jacob 和Monod Nirenberg
乳糖操纵子模型 遗传密码
1966
Gellert
DNA连接酶
1970 1970 1972 1977 1981 1983 1984 1986 1989 1994 1997 2001
生命科学回顾（续）
Smith
限制性内切酶
Temin
逆转录酶
Berg
•其目的是阐明人类基因组30亿个碱基对的序 列，发现所有人类基因并阐明其在染色体上的 位置，从而在整体上破译人类遗传信息。
•该计划启动于1990年，原定15年完成，由 于技术的成熟与基因组测序的规模化运作，以 及来自商业竞争方面的压力，2000年6月26 日基因组序列草图测序完成。
基因组计划
遗传图 物理图
功能基因组学
转录组学 蛋白质组学 代谢组学 表型组学 相互作用组学 ……
• 功能基因组学采用一些新的技术，如转录组学应用微 阵列(Microarray)、DNA芯片(DNA chip）及 SAGE(Serial analysis of gene expression)等技术， 可对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因整 体水平上对基因的活动规律进行阐述，力求从细胞水 平上解决基因组问题，以建立对生命现象的整体认识。
序列图
这三条数据将提供此生物所有基因在染色体上的精确定位、 基因内部序列以及基因的间隔序列。
---原核生物或低等真核生物。
1/2 of all genes “identified” have no known function
人类基因组以及多种模式生物、重要生物
基因组全序列的完成，标志着生命科学研 究进入所谓的“后基因组时代 (Postgenome era)”, 即产生了功能基因 组学（Functional Genomics）
课件：第六章 蛋白质组学技术
（尼龙膜： 480µg/cm2 ；硝酸纤维素膜：80µg/cm2 ）
特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱
需要更大的机械强度
的免疫学检测
• 封闭 • 靶蛋白与一抗反应 • 与二抗反应 • 显色
2021/11/16
14
二抗与底物反应显色
•辣根过氧化物酶法（HRP） •碱性磷酸酶法（AP） •化学发光显色法
2-DE 分离的可溶性 E. coli 蛋白
2021/11/16
26
双向电泳特点
• 优点：高分辨率 • 缺点：
– 低丰度蛋白质 – 极酸或极碱蛋白质 – 极大或极小的蛋白质 – 难溶蛋白质
2021/11/16
27
生物质谱技术
2021/11/16
28
质谱分析（mass spectrometry,MS）
2021/11/16
9
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10
2021/11/16
11
转膜：负极到正极，依次放海绵，滤纸，凝 胶，硝酸纤维膜， 滤纸，海绵
380mA 30分钟
2021/11/16
12
转膜
硝酸纤 维素膜
价格便宜
简单快速封闭非特异性抗体结合
膜的选择
封闭非特异性抗体结合麻烦
尼龙膜
价格昂贵
需要更高的蛋白结合率
现、同源蛋白质比较、蛋白质加工修饰分析。 2、蛋白质组功能模式（作用）的研究 • 基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制分析。 • 重要生命活动的分子机制（如细胞周期、分化与发
育、环境反应与调节等）。
• 医药靶分子的寻找和分析（包括新药靶分子、肿瘤 分子标记、人体病理介导分子等）。
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特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱
需要更大的机械强度
的免疫学检测
• 封闭 • 靶蛋白与一抗反应 • 与二抗反应 • 显色
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二抗与底物反应显色
•辣根过氧化物酶法（HRP） •碱性磷酸酶法（AP） •化学发光显色法
2-DE 分离的可溶性 E. coli 蛋白
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双向电泳特点
• 优点：高分辨率 • 缺点：
– 低丰度蛋白质 – 极酸或极碱蛋白质 – 极大或极小的蛋白质 – 难溶蛋白质
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生物质谱技术
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质谱分析（mass spectrometry,MS）
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转膜：负极到正极，依次放海绵，滤纸，凝 胶，硝酸纤维膜， 滤纸，海绵
380mA 30分钟
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转膜
硝酸纤 维素膜
价格便宜
简单快速封闭非特异性抗体结合
膜的选择
封闭非特异性抗体结合麻烦
尼龙膜
价格昂贵
需要更高的蛋白结合率
现、同源蛋白质比较、蛋白质加工修饰分析。 2、蛋白质组功能模式（作用）的研究 • 基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制分析。 • 重要生命活动的分子机制（如细胞周期、分化与发
育、环境反应与调节等）。
• 医药靶分子的寻找和分析（包括新药靶分子、肿瘤 分子标记、人体病理介导分子等）。
2021/11/16
蛋白质组学研究技术-PPT精品文档
二维凝胶电泳（2-DE）—目前唯一能将 数千种蛋白质同时分离与展示的分离技 术 工作原理是根据蛋白质的两个一级属性： 等电点和分子量的特异性，将蛋白质混 合物通过等电聚焦电泳（IEF）和聚丙烯 酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），在两个水 平上进行分离。 1975年首先由O’Farrell等创立
2019/7/11
2019/7/11
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第一节 概述
蛋白质组学研究范围及意义
表达蛋白质组学研究 选择具有重要生物学意义且已完成DNA测
序的生物体，鉴定出生物体/某种组织（细胞） 所表达的全部蛋白质，建立其蛋白质表达谱数 据库。 进展较快的领域：一些重要的疾病及微生物组。 有难度的领域：估计人类的蛋白质组由50万个 蛋白质组成，真核生物细胞表达的蛋白质也超 出1万个
2019/7/11
9
第一节 概述
2019成立了中国人类蛋白质组组织 （CHHUPO），并分别于2019年9月、 2019年8月以及2019年8月召开了中 国蛋白质组学首届、第二届及第三届 学术大会，2019年10月在中国北京召 开了第三届国际蛋白质组学会议。
2019/7/11
10
第一节 概述
科技部已将疾病蛋白质组研究列入我 国“973”计划项目和“863”计划项 目；国家自然科学基金委员会也将 “蛋白质组研究”列为重点项目。
第一节 概述
基因与其编码产物蛋白的非线性关系
mRNA水平的基因表达研究取得进展，但 mRNA与蛋白质间的相关系数仅为0.4～0.5， mRNA的种类与含量不能代表蛋白质的种类与 含量。支原体的蛋白质数目较基因多24%，对 于人，蛋白质的数目至少多3倍。 蛋白质自身特点难以从DNA和mRNA水平得到 解答：复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定 位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等
蛋白质组学及技术介绍PPT通用课件.ppt
拖尾"point streaking") 。
3.二相SDS-PAGE
丙烯酰胺/甲叉双丙烯 酰胺溶液
分离胶缓冲液
10%（w/v）过硫酸铵 溶液
（30.8%T，2.6%C）：30%（W/V）丙烯酰胺和 0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶 液。将 300g 丙烯酰胺和 8g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离
研究 内容
蛋白质的研究内容主要有两方面：
1、结构蛋白质组学：主要是蛋白质表达模型的研究，包括蛋白质氨基酸序列 分析及空间结构的解析种类分析及数量确定; 2、功能蛋白质组学：主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质功能及蛋白 质间的相互作用。
研究 内容
蛋白质组学可分为三个主要领域： 1、蛋白质的微特性以供蛋白质的规模化鉴定和他们的后翻译饰； 2、“差异显示”蛋白质组学供蛋白质水平与疾病在广泛范围的有力应用比 较； 3、应用特定的分析技术如质谱法（包括串联质谱法、生物质谱法）或酵母 双杂交系统以及其他蛋白质组学研究新技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该方法所研究的蛋白均是在体内经过翻译后修饰的，并且是可 分离的天然状态的相互作用蛋白复合物，能够反映正常生理条件下的 蛋白质间相互作用
蛋白质相互作用
2、酵母双杂交系统：
该系统利用真核细胞调控转录起始过程中，DN A结合结构域(binding domain,BD)识别DNA上的特异序列并使转录激活结构域(activation domain, AD)启动所调节的基因的转录这一原理，将己知蛋白X和待研究蛋白Y的基 因分别与编码AD和BD的序列结合，通过载体质粒转入同一酵母细胞中表 达，生成两个融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，则AD和BD在空间上 接近就能形成完整的有活性的转录因子，进而启动转录，表达相应的报告 基因;反之，如果X和Y之间不存在相互作用，报告基因就不会表达。这样， 通过报告基因的表达与否，便可确定是否发生了蛋白质的相互作用。
3.二相SDS-PAGE
丙烯酰胺/甲叉双丙烯 酰胺溶液
分离胶缓冲液
10%（w/v）过硫酸铵 溶液
（30.8%T，2.6%C）：30%（W/V）丙烯酰胺和 0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶 液。将 300g 丙烯酰胺和 8g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离
研究 内容
蛋白质的研究内容主要有两方面：
1、结构蛋白质组学：主要是蛋白质表达模型的研究，包括蛋白质氨基酸序列 分析及空间结构的解析种类分析及数量确定; 2、功能蛋白质组学：主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质功能及蛋白 质间的相互作用。
研究 内容
蛋白质组学可分为三个主要领域： 1、蛋白质的微特性以供蛋白质的规模化鉴定和他们的后翻译饰； 2、“差异显示”蛋白质组学供蛋白质水平与疾病在广泛范围的有力应用比 较； 3、应用特定的分析技术如质谱法（包括串联质谱法、生物质谱法）或酵母 双杂交系统以及其他蛋白质组学研究新技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该方法所研究的蛋白均是在体内经过翻译后修饰的，并且是可 分离的天然状态的相互作用蛋白复合物，能够反映正常生理条件下的 蛋白质间相互作用
蛋白质相互作用
2、酵母双杂交系统：
该系统利用真核细胞调控转录起始过程中，DN A结合结构域(binding domain,BD)识别DNA上的特异序列并使转录激活结构域(activation domain, AD)启动所调节的基因的转录这一原理，将己知蛋白X和待研究蛋白Y的基 因分别与编码AD和BD的序列结合，通过载体质粒转入同一酵母细胞中表 达，生成两个融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，则AD和BD在空间上 接近就能形成完整的有活性的转录因子，进而启动转录，表达相应的报告 基因;反之，如果X和Y之间不存在相互作用，报告基因就不会表达。这样， 通过报告基因的表达与否，便可确定是否发生了蛋白质的相互作用。
蛋白质组学(ppt文档)
6
第一节 蛋白质组学的概念及发展进展
一、蛋白质组和蛋白质组学的概念
蛋白质组（proteome）：PROTEins + genOME，意思是 Proteins expressed by a genome（基因组表达的所有蛋 白质）
1994年由澳大利亚科学家Wilkins提出，是一个动态的概念， 指的是不同细胞在不同时相表达不同的蛋白质
approximately 250,000 proteins in the human genome Only 2-5% of proteins in human genome have been identified
2019/11/25
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
Hotspot:对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物 学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需 要和重要任务
2019/11/25
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
4
前言与背景
The era of ‘omics’-based science （组学时代） – Genomics （基因组学） – Post-genomic science （后基因组时代） • Functional genomics （功能基因组学） – Transcriptomics（ 转录组学） – Proteomics （蛋白质组学） – metabonomics／metabolomics （代谢组学） • Structural genomics （结构基因组学） – Aim - 3D structures of all protein folds !
《蛋白质组学》课件
蛋白质组学技术
本节将介绍蛋白质组学常用的实验技术和分析方法，包括质谱、二维电泳、 蛋白质结构预测等。
蛋白质组学应用领域
本节将探讨蛋白质组学在生物医药、农业和环境科学等领域的应用，展示其 广泛的研究价值。
蛋白质组学研究的重要性
本节将详细解释为何蛋白质组学研究对于解决生物学中的关键问题和推动科学进步具有重要意义。
《蛋白质组学》PPT课件
欢迎观看《蛋白质组学》PPT课件，本课程将介绍蛋白质组学的概念、技术、 应用领域和重要性，以及它的发展趋势。
课程介绍
本节将介绍蛋白质组学的基本概念和研究对象，以及在生物学研究中的重要 性。
蛋白质组学概述
本节将对蛋白质组学的研究内容、方法和技术进行概述，帮助您理解蛋白质组学的基本原理。
蛋白质组学的发展趋势
本节将展望析和应用拓展等方面。
结论和要点
本节将总结蛋白质组学课程的要点和结论，帮助您加深对蛋白质组学的理解 和应用。
蛋白质组学及技术介绍通用课件
详细描述
蛋白质组学技术可以对蛋白质相互作用进行系统研究，发现新的药物靶点，并对药物作用过程中蛋白 质的应答变化进行监测，从而对新药进行有效的筛选和评价。同时，蛋白质组学还可以用于研究药物 的作用机制，解析药物在体内的生物过程，为新药的研发提供重要的理论支持。
生物进化研究
总结词
蛋白质组学在生物进化研究中的应用主要表 现在对不同物种间蛋白质结构和功能的比较 分析，揭示生物进化的规律和机制。
动物实验伦理
减少动物使用
尽量采用其他替代方法，减少动物的使用数量和痛苦。
优化实验方案
在必须使用动物的情况下，应优化实验方案，尽量减少动物的痛苦 和死亡。
严格遵循法律法规
遵守国家和地区的动物保护法律法规，确保实验的合法性。
数据共享与知识产权保护
数据共享
鼓励在学术领域内共享数据，促进科研合作和知识进步。
详细描述
蛋白质组学通过对不同物种间相似蛋白质的 同源性进行分析，可以发现物种间的亲缘关 系和进化历程。同时，蛋白质组学还可以通 过对蛋白质结构和功能的比较分析，发现物 种间在适应环境变化过程中产生的蛋白质变 异和进化机制。这些研究对于深入理解生物
进化的过程和机制具有重要意义。
04
蛋白质组学研究展望
通过测定蛋白质的氨基酸序列，确定蛋白质的组成和 结构。
质谱分析
通过测量蛋白质离子的质量和电荷比值，推断蛋白质 的分子量和肽链组成。
数据库搜对，确定蛋白质的身份。
蛋白质定量技术
同位素标记技术
01
通过同位素标记目标蛋白质，利用其与未标记蛋白质在质谱中
鉴定蛋白质之间的相互作用关系，了解蛋白 质的功能网络。
蛋白质修饰分析
研究蛋白质的翻译后修饰，如磷酸化、糖基 化、乙酰化等，以揭示其调控机制。
蛋白质组学技术可以对蛋白质相互作用进行系统研究，发现新的药物靶点，并对药物作用过程中蛋白 质的应答变化进行监测，从而对新药进行有效的筛选和评价。同时，蛋白质组学还可以用于研究药物 的作用机制，解析药物在体内的生物过程，为新药的研发提供重要的理论支持。
生物进化研究
总结词
蛋白质组学在生物进化研究中的应用主要表 现在对不同物种间蛋白质结构和功能的比较 分析，揭示生物进化的规律和机制。
动物实验伦理
减少动物使用
尽量采用其他替代方法，减少动物的使用数量和痛苦。
优化实验方案
在必须使用动物的情况下，应优化实验方案，尽量减少动物的痛苦 和死亡。
严格遵循法律法规
遵守国家和地区的动物保护法律法规，确保实验的合法性。
数据共享与知识产权保护
数据共享
鼓励在学术领域内共享数据，促进科研合作和知识进步。
详细描述
蛋白质组学通过对不同物种间相似蛋白质的 同源性进行分析，可以发现物种间的亲缘关 系和进化历程。同时，蛋白质组学还可以通 过对蛋白质结构和功能的比较分析，发现物 种间在适应环境变化过程中产生的蛋白质变 异和进化机制。这些研究对于深入理解生物
进化的过程和机制具有重要意义。
04
蛋白质组学研究展望
通过测定蛋白质的氨基酸序列，确定蛋白质的组成和 结构。
质谱分析
通过测量蛋白质离子的质量和电荷比值，推断蛋白质 的分子量和肽链组成。
数据库搜对，确定蛋白质的身份。
蛋白质定量技术
同位素标记技术
01
通过同位素标记目标蛋白质，利用其与未标记蛋白质在质谱中
鉴定蛋白质之间的相互作用关系，了解蛋白 质的功能网络。
蛋白质修饰分析
研究蛋白质的翻译后修饰，如磷酸化、糖基 化、乙酰化等，以揭示其调控机制。
蛋白质分析与蛋白质组学
1. 蛋白质的定位基于十二类亚细胞结构 蛋白质在细胞内的定位主要基于12类亚细胞的分 类数据库（来自SwissProt）： 细胞膜、细胞质基质、内质网、高尔基体、溶酶 体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、细胞骨架、 液泡、细胞核、细胞外基质。
二、蛋白质的定位、修饰
蛋白质的定位 2. 蛋白质在细胞内合成后的转运与定位有两种机制
一、蛋白质的指纹特征
2. 肽质量指纹谱是鉴定蛋白质的常用参数
质谱指纹分析需要经过蛋白质原位酶解（包括 蛋白质凝胶的脱色、还原和烷基化、酶解、萃取及 合并萃取液冻干后进行质谱分析）、MALDI-TOF肽 质量指纹图测定（包括蛋白样品脱盐及制备、质谱 仪进行肽质量指纹图测定）及蛋白质鉴定数据库搜 寻等三个步骤。
蛋白质分析与蛋白 质组学
主要内容
第一节 引言 第二节 蛋白质分析方法 第三节 蛋白质组学数据的获取与分析
第一节 引 言
蛋白质组(proteome) 源于蛋白质(protein)与 基因组(genome)两个字的结合，意指“一种基因 组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至 一种生物所表达的全部蛋白质。
序和协同作用的结果。 ▪ 细胞各种重要的生理过程，包括信号转导、细胞
对外界环境及内环境变化的反应等，都是以蛋白 之间相互作用为纽带，并形成网络。
二、蛋白质的定位、修饰
蛋白质的相互作用 2. 蛋白质的特定结构域是介导蛋白质-蛋白质间相
互作用的基础 ▪ 典型蛋白质相互作用的结构域是一个具有结合专
一性的独立折叠元件，可以插入新的蛋白质中并 保留结合靶部位的能力。 ▪ 它们的相互作用多是通过 2个多肽表面几何构型 和静电力而相互连接。
▪ 二级结构预测常用方法有：nnPredict， PredictProtein，SOPMA，COILS，TMpred， SignalP等。
二、蛋白质的定位、修饰
蛋白质的定位 2. 蛋白质在细胞内合成后的转运与定位有两种机制
一、蛋白质的指纹特征
2. 肽质量指纹谱是鉴定蛋白质的常用参数
质谱指纹分析需要经过蛋白质原位酶解（包括 蛋白质凝胶的脱色、还原和烷基化、酶解、萃取及 合并萃取液冻干后进行质谱分析）、MALDI-TOF肽 质量指纹图测定（包括蛋白样品脱盐及制备、质谱 仪进行肽质量指纹图测定）及蛋白质鉴定数据库搜 寻等三个步骤。
蛋白质分析与蛋白 质组学
主要内容
第一节 引言 第二节 蛋白质分析方法 第三节 蛋白质组学数据的获取与分析
第一节 引 言
蛋白质组(proteome) 源于蛋白质(protein)与 基因组(genome)两个字的结合，意指“一种基因 组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至 一种生物所表达的全部蛋白质。
序和协同作用的结果。 ▪ 细胞各种重要的生理过程，包括信号转导、细胞
对外界环境及内环境变化的反应等，都是以蛋白 之间相互作用为纽带，并形成网络。
二、蛋白质的定位、修饰
蛋白质的相互作用 2. 蛋白质的特定结构域是介导蛋白质-蛋白质间相
互作用的基础 ▪ 典型蛋白质相互作用的结构域是一个具有结合专
一性的独立折叠元件，可以插入新的蛋白质中并 保留结合靶部位的能力。 ▪ 它们的相互作用多是通过 2个多肽表面几何构型 和静电力而相互连接。
▪ 二级结构预测常用方法有：nnPredict， PredictProtein，SOPMA，COILS，TMpred， SignalP等。
蛋白质组学PPT课件
功能蛋白质组学 结构蛋白质组学
.
11
人类蛋白质组学研究进展
2001年成立国际人类蛋白质组组织（HUPO）， 2003.12.15启动两个首批行动计划 1.人类肝脏蛋白质组计划（HLPP）由中国军事医学科学
院副院长贺福初院士领导，16国80多个实验室参加。 中国第一次领导重大国际协作计划。 2. 人类血浆蛋白质组计划（HPPP）由美国科学家牵头， 13国47个实验室参加。
双向电泳后的凝胶
经染色后蛋白呈现二维
分布图： 水平方向反映出蛋
白在pI上的差异， 垂直方向反映出它
聚焦后凝 胶放置在 SDS凝胶 上，进行 第二向电 泳
们在分子量上的差别。
第二向电泳： SDS-PAGE
pH9
.
pH9
pH3
分子量大 分子 量小
pH3
18
(1)等电聚焦 凝胶电泳 （ IFE）
利用载体两 性电解质在电场 作用下沿电场方 向在凝胶内形成 一个连续而稳定 的pH梯度。
根据一定的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混 合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共 价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方 式生成的IPG不会发生电渗作用，因而可以进行特别稳 定的IEF分离达到真正的平衡状态。
.
5
第一节 蛋白质组及蛋白质组学基本概念
.
6
什么是蛋白质组？
蛋白质组(proteome)：
PROTEOME = PROTE in +genOME Proteins expressed by a genome.
是指“特定细胞、组织乃至机体作为一个 生命单元中所有蛋白质的集合，即生命体中携 带的基因信息在某一时段所表达的全部蛋白质。
蛋白质分析和蛋白质组学ppt课件
生物学途径是由分子功能有序地组成的，具有多个 步骤的一个过程。（细胞生长和维持、信号传导 、 嘧啶代谢或α－配糖基的运输 ）。
cell division
gluconeogenesis
19
Biological Process
20
lipocalin
21
以树状图形式 显示的GO词汇 之间的关系
22
6
本体(ontology)
计算机科学对自然世界认知的形式化的表示,既是 可被计算机表示,解释和利用的知识的形式化的研 究—即本体 。本体是结构化的领域知识,并可以被 计算机解释和利用 。 实现对生命世界中这些概念理解上的共享,包括从 不同的视角,不同的术语分类, 不同的主体( 人和机 器)共享概念 --概念化的规范 Gene Ontology(GO)协会致力于这样一项工程： 编辑一组动态的而又可控的词汇来描述基因和基 因产物(主要是蛋白质)不同方面的性质。
酶的数目
1003 — — 1076 — 1125 356 156 126
子类的例子
作用于CH-OH基团 作用于醛类或氧络集团 转移—碳基团
38
Functional assignment of proteins: Clusters of Orthologous Groups (COGs)
39
Proteomics: High throughput protein analysis
蛋白质分析和蛋白质组学
DNA
RNA
protein
1
[1] Molecular biology
[3] Protein localization
protein [4] Protein function
蛋白质组学与分析技术
x5x
蛋白质分子的大小
蛋白质的分子量
一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12
≈1.66×10-27千克
x6x
蛋白质的两性电离及等电点
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大
pI通常在 6.0 左右
x7x
蛋白质分离纯化的一般原则
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
大分子蛋白质不能同时入孔内而径直流出。
5、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的 分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。
1x8x
沉淀法
1、盐析法
盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高
而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋
Hale Waihona Puke 白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质
1x4x
蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质（colloidal system） 胶体溶液的特点： w 分子直径在1-100 nm内 w 溶于水 w 不易聚集沉淀 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液
1x5x
蛋白质的沉淀
蛋白从胶体溶液中析出 Ⅰ可逆沉淀：
温和条件，改变溶液pH或蛋白所带电荷 蛋白结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解
修饰蛋白
x9x
从生物样品抽提蛋白质
去污裂解：溶解细胞膜裂解细胞如SDS 还原剂：用于还原二硫键或防止蛋白质氧化如巯
蛋白质分子的大小
蛋白质的分子量
一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12
≈1.66×10-27千克
x6x
蛋白质的两性电离及等电点
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大
pI通常在 6.0 左右
x7x
蛋白质分离纯化的一般原则
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
大分子蛋白质不能同时入孔内而径直流出。
5、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的 分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。
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沉淀法
1、盐析法
盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高
而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋
Hale Waihona Puke 白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质
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蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质（colloidal system） 胶体溶液的特点： w 分子直径在1-100 nm内 w 溶于水 w 不易聚集沉淀 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液
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蛋白质的沉淀
蛋白从胶体溶液中析出 Ⅰ可逆沉淀：
温和条件，改变溶液pH或蛋白所带电荷 蛋白结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解
修饰蛋白
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从生物样品抽提蛋白质
去污裂解：溶解细胞膜裂解细胞如SDS 还原剂：用于还原二硫键或防止蛋白质氧化如巯
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银染
银染是非放射性染色方法中灵敏度最好 的，其灵敏度可达200pg 凝胶在固定液中固定后，在含戊二醛的 溶液中增敏，然后在AgNO3溶液中浸泡， 蛋白与银结合，银颗粒沉淀在蛋白点上， 沉淀的银颗粒产生催化反应，提高银染 反应灵敏度，使蛋白点显示棕黄色或棕 黑色
负染
负染是一种可逆染色方法，其灵敏度高 于考染低于银染，准备从胶上回收蛋白 可选用此方法，负染有铜染、锌-咪唑等， 灵敏度可达50 ng。负染在凝胶表面可产 生半透明背景，蛋白质以透明的形式被 检测出来，凝胶显示黑色背景或相应的 底色，染色过程很快，5-15min即可完成
蛋白质组学与分析技术特点
分析技术面广：氨基酸组分、序列测
定；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；毛细管 电泳；高效液相色谱；质谱；液质联仪； 毛细管电泳-质谱联用；双向凝胶电泳； 蛋白质芯片；蛋白质生物信息学；蛋白 质结构与功能；园二色谱；X光衍射；高 能辐射；蛋白质杂交技术；蛋白质酶学 技术
蛋白质组学与农业的科学实践
样品制备原则
1，尽可能采用简单方法进行样品处理，以避 免蛋白丢失 2， 细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白 的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的 降解 样品裂解液应该新鲜制备、并且分装冻存于80C,不要反复冻融已制备好的样品 通过超速离心清除所有的杂质 加入尿素之后加温不要超过37C,防止氨甲酰化 而修饰蛋白
从生物样品抽提蛋白质
去污裂解：溶解细胞膜裂解细胞如SDS 还原剂：用于还原二硫键或防止蛋白质氧化如 巯基乙醇、硫脲 变性剂：用于改变溶液离子强度和PH，破坏蛋 白质的二级和三级结构 酶裂解：用酶来消化细胞器如溶菌酶、纤维素 酶、果胶酶等 渗透裂解：用低渗溶液悬浮细胞 冻融裂解：用液氮迅速冷冻细胞，随后在37C 融化，反复几次
二维凝胶电泳图像采集
图象分析基本上依赖与各个蛋白质点的 光密度值相对大小 图象采集质量的因素包括系统的分辨率、 灵敏度、图象对比度和明亮度 常见的可见光扫描仪、荧光、化学发光 和磷屏扫描仪
存在的问题
低丰度蛋白质的检测 高丰度蛋白的去除 极酸和极碱性区蛋白的分离：pH <3或pH>11 高分子质量区蛋白的分离：100 000Da以上的 蛋白质很难进入胶条 定技术
低丰度蛋白的分离： 低丰度蛋白的分离 ： 尽管增加上样量和提 高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰 度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白 的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响 分离。现常用预分级＋窄pH胶的微制备 技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白 质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位 的IPG胶进行窄pH范围的分离。 高不溶性蛋白的分离： 高不溶性蛋白的分离 ： 主要还是要增加蛋 白质的溶解度，采用顺序抽提法进行。
清除影响二维电泳图谱的杂质
盐离子、痕量缓冲液和其他带电荷的小分子：盐离子会干扰 电泳，可以透析去除 内源性小分子（如核酸、代谢物和磷酸）：这些物质带负电 荷，发生偏阳极侧聚焦不全，用TCA/丙酮沉淀去除 离子去污剂：SDS与多肽形成复合物，不能正确聚焦，通过 丙酮沉淀可去除SDS 核酸（DNA、RNA）：核酸增加样品的黏度导致背景弥散， 核酸通过电稳态相互作用也蛋白结合阻碍聚焦，核酸在银染 检测中导致高背景 多糖：阻碍凝胶孔径导致沉淀，多糖含有负电荷与蛋白质形 成复合物，用硫酸铵或苯酚/醋酸铵沉淀去除多糖 脂类：蛋白质与脂类形成复合物影响等电点和分子量，用强 变性剂和去污剂减少蛋白与脂类的相互作用 酚类组分：苯酚通过酶催化的氧化反应来修饰蛋白，用巯基 乙醇或硫脲来灭活多酚氧化酶
蛋白沉淀步骤
硫酸铵沉淀（盐析）：高盐溶液中蛋白质聚合而沉淀 TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）：TCA 10%-20%，蛋白质 可冰上沉淀，用丙酮和乙酸清洗沉淀。去除TCA 丙酮沉淀：3倍体积的冰丙酮，蛋白在-20度沉淀，离 心沉淀蛋白，丙酮通过空气或冻干去除 在丙酮中用TCA三氯醋酸沉淀：两者联合使用更有效， 10%的TCA在丙酮中重悬裂解样品溶液 用苯酚提取，随后在甲醇中醋酸铵沉淀：蛋白质被提 取到饱和酚中，在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白， 丙酮清洗
实验样品的制备原则
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 （包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有 可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学 修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从 而保证待研究蛋白的可检测性。
1D-SDS-PAGE SDS-
一维等电聚焦电泳
蛋白质在不同PH值的溶液中带电荷情况是不同的， 在低的PH条件下，蛋白质静电荷为正，在高PH条件 下静电荷为负，在某一PH的溶液中，蛋白质的静电 荷为零，则此PH值为该蛋白的等电点 蛋白质等电点取决与氨基酸的组成，是一个物理化学 常数 如果外加一个电场，蛋白质会在电场作用下分别向正 极和负极漂移，当达到等电点位置时，蛋白不带电， 就不在漂移，这就是等电聚焦电泳的基本原理
2D-SDS-PAGE 存在的问题 SDS一维电泳相同蛋白质迁移的任何不同可能会被 误认为是样品中含有不同蛋白质 蛋白质的脱酰胺化、糖基化、磷酸化、氧化、 外源化学修饰等是相同多肽的不同修饰可能显 现为“点横向排列” 某些蛋白质不太适于进行第一维IEF电泳， 低溶解度导致蛋白质沉淀和聚集，造成在IPG 胶条中蛋白质的“成片条带”
2D-SDS-PAGE SDS-
样品制备
第一向 IEF电泳
第二向 SDS-PAGE电泳
染色 蛋白斑点的切取 图像采集和分析
二维电泳原理
Smithies和Poulik(1956 )最早引入二维电泳技术， O’Farrell（1975）根据蛋白质的等电点和相对分 子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上 按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照 相对分子质量大小进行分离 二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫 描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的， 呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质
蛋白质组学与分析技术特点
内容多：蛋白质组作图、蛋白质组成分鉴
定、蛋白质组数据库构建、新型蛋白质发掘、 蛋白质差异显示、同工体比较、基因产物识 别、基因功能鉴定、基因调控机制分析、细 胞周期、细胞分化与发育、肿瘤发生与发展、 环境反应与调控、物种进化、新型药物靶分 子、人体病理介导分子、病原菌毒性成分、 植物信号识别、植物诱导抗性、免疫增产激 发子、抗虫蛋白晶体、植物病害毒素、植物 致病相关蛋白等等。
在IEF(水平)方向显示蛋白质“成片条带”的部分2D凝 胶
由于相同蛋白质的不同修饰/电荷显示“点横向排列”的部分2D凝 胶
蛋白质电泳图像分析
电泳凝胶后图象进行备份保存，从而以 数字化图象形式存储下来，尽量完整的 保留定性和定量信息以进一步分析，如 总蛋白的点数，蛋白点的表达丰度的电 量变化，蛋白点的缺失，利用双向电泳 凝胶分析软件进行分析
完整蛋白质的分离
1D-SDS-PAGE 2D-SDS-PAGE IEF(制备等电聚焦) HPLC 离子交换或亲和层析
聚丙烯酰胺凝胶电泳
通过丙烯酰胺单体和N，N，-甲叉双丙烯酰胺按 一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合 形成交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链 聚合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自 由功能基团反应，发生交联，形成网状结构 等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，SDSPAGE按相对分子质量大小分离蛋白质
荧光染色
利用丙基Cy3和甲基Cy5两种染料分别对不同蛋 白质样品进行荧光标记，并在一块2-D胶上同 步运行，由于两种修饰后的染料的激发波长不 同，在同一块胶上可用两个波长范围进行扫描， 并可得到两个样品的差异，灵敏度比银染要高 3-30倍 另一荧光染料是SYPRO Ruby，它是基于钌的 金属螯和染料，灵敏度为0.25-1ng
蛋白质组学的教学与其他课程的关系
与基因克隆和基因工程教学的异同点 与仪器分析课程的关系 与生物化学的异同点 与农学、植保、制药、免疫和疫苗、分 子生物学、作物育种、土壤肥料、家禽 饲料等的关系
蛋白质组学分析中蛋白质的分 离和消化
蛋白质组分析的基本流程图
蛋白质组研究的技术路线流程图
蛋白质的分离与纯化
蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解
苯甲基磺酰氟PMSF: 不可逆抑制剂 AEBSF：灭活丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶 金属蛋白酶抑制剂乙二 胺四乙酸（EDTA）、 乙二醇双四乙酸(EGTA) 肽蛋白酶抑制剂：亮以酶肽，抑制丝氨酸、半 胱氨酸蛋白酶活性，为蛋白酶抑制剂A抑制酸性 蛋白酶活性，抑蛋白酶肽抑制丝氨酸蛋白酶， 本丁抑制素抑制氨基蛋白酶。 甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCK）、甲苯磺酰苯 丙氨酰氯甲酮（TPCK）: 不可逆抑制丝氨酸和 半胱氨酸蛋白酶。 Benzamidine: 抑制丝氨酸蛋白酶
剧烈的蛋白裂解
超声裂解法：通过超声波切应力来裂解细胞，在剧烈 的搅拌状态下会产生剪切效果 弗氏压碎器：在高压下迫使细胞穿过小孔径产生剪切 力裂解细胞 研磨法：组织和细胞常冻存于液氮中，研磨成粉状 机械匀浆法：将组织切成小片、匀浆、过滤或离心获 得裂解液 玻璃珠匀浆法：剧烈震荡的玻璃珠可以打破细胞壁， 释放细胞内容物
裂解液的组分
为了完成聚焦良好的第一项等电聚焦，蛋白质必须完 全溶解和解聚 经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少 一种表面活性剂来溶解疏水基团。 常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂 Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。 SDS作用后不利于稳定IEF中的等电点，不宜存在于IEF的 样品溶解液中；只有后两类表面活性剂是可用的，其中 CHAPS和SB3-10最好。 常用浓度为在8M尿素溶液中含2-5%的CHAPS，但在含 高浓度硫脲的溶液中其作用有限；SB3-10是一种含有长线 性基团尾端的两性去污剂，其作用要强于CHAPS，但在 尿素浓度大于5M时不溶解。
蛋白质作为人类食物主要营养成分存在于不同的农作物中； 蛋白质在植物生活中具有不同生物学功能（细胞调亡和细 胞器）； 蛋白质作为酶在植物生长代谢中期作重要的作用； 蛋白质作为生物信号传导的受体对外界信号在植物生活进 行传导； 植物中某些蛋白具有抗病虫的生物功能； 蛋白质及多肽能诱导植物抗逆性，促进植物生长和提高作 物品质；