花序浸染法转化拟南芥

花序浸染法转化拟南芥

1 种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。营养土和蛭石1：1比例混合。

2 可以采取两种方法种植野生型拟南芥：一种是直接在大钵子里种八、九颗，小钵子里种四、五颗，等它稍微长大以后去掉长势不好的或者不能成活的，大钵子保留四颗，小钵子保留两颗，这种方法不用移栽；另一种是现在大钵子里种上几十颗（小钵子里相应的减少），等它们长成小苗后移栽（千万不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根），这种方法移栽比较麻烦，但是在移栽过程中能保证你要移栽的每一颗都是长势良好的拟南芥。不管你采取哪种方法，在种下拟南芥后都需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。总之盖膜时间自己灵活掌握。

3 转拟南芥一般用GV3101这个农杆菌，在你电转农杆菌，挑取阳性克隆检测后，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的LB，分装2管，摇8—10小时（时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊）待浑浊后再转移到500ml三角瓶（按1：100的比例装有200ml的LB）中大量摇菌8—10小时直到浑浊为止（有时候需要摇更长的时间才能浑浊）。浑浊的标准是OD值为0.8，但是现在基本都不测OD值。（在摇菌过程中所用的离心管和LB要灭菌，另外还要注意添加抗生素利福平，最好选用利福平和另外一种到两种抗生素以达到双抗或者三抗的效果，实际上双抗就可以了，理论上可以添加三种抗生素，一种是利福平，GV3101农杆菌本身就是抗利福平的；另一种是农杆菌自身所携带的协助Ti质粒载体上的基因所抗的抗生素；还有一种就是T-DNA区内基因所对应的抗生素），接下来就是离心富集农杆菌（用离心瓶或者是50ml的大离心管，这个时候离心瓶或者50ml大离心管可以灭菌也可以不灭菌），然后用100ml的5﹪的蔗糖悬浮，蔗糖溶液中加入20微升表明活性剂，也就是浓度0.02%（此时的蔗糖溶液就不用灭菌了，因为以后的侵染也不在超净工作台操作）。要转的每个基因的每个载体都是先2ml少量摇菌，然后按1：100的比例200ml大量摇菌。

4 在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。在用花序侵染法转拟南芥之前，先用剪刀剪去已经长成的角果（因为这些角果将来结的种子肯定是非转基因的，如果不剪掉的话会降低阳性率，本身阳性率已经很低了，再降低就更不爽了），把100ml的5﹪的蔗糖悬浮的菌液倒入大皿内，然后把拟南芥的花序浸入进去侵

染2分钟，侵染的过程要转动钵子，（侵染之前一晚上最好给钵子里浇些水，这样第二天侵染后钵子里的土就不容易掉出来），侵染后用滤纸擦干，侵染后的拟南芥要用黑色塑料袋或者薄膜覆盖，暗培养24小时。侵染后悉心照料，保持水分充足。由于拟南芥的盛花期较长，所以一般要侵染2—3次。

5 角果自然开裂后就可以收种子了。此时收的种子是T1种子。

6 接下来就是筛拟南芥种子了，巴氏消毒液和灭过菌的ddH2O按1：1混合，在2ml离心管中灭菌就行，灭菌3次，总时间不要超过8分钟，用灭菌水洗5次。然后用灭过菌的0.1％琼脂悬浮。用拟南芥筛选培养基进行筛选，加千分之一的卡那（Kana 母液100mg/ml,300ul母液/500ml MS）和头孢（cef 母液1 00mg/ml, 500ul母液/500ml MS）（1L8克琼脂），加卡那是由于T—DNA标签上的NPTⅡ是卡那抗性的，起筛选作用；加头孢主要是抑菌作用。由于T1种子的阳性率较低，所以筛选时每个皿要筛很多种子，这时候种子之间可以紧密靠近，但注意不要过分紧密。有时候一个皿可以得到好几个阳性苗子，有时候一个都得不到，这个跟你转的基因以及转化效率有关。筛选TI种子的皿放在光照培养室，待这批种子长出拟南芥幼苗后就可以观察出来筛选效果，阳性的长的比较绿，而且比阴性的长的高一点，阴性的长的发黄，而且长的比较矮。T1阳性拟南芥幼苗至少20颗，挑选出阳性的拟南芥幼苗平铺于新的拟南芥筛选培养基让它长根，皿要立起来放。

7 待拟南芥幼苗的根长到一定长度后就可以进行移栽了，移栽的过程中要清洗掉根部所粘的培养基，因为根部粘有培养基的话容易长菌，还有就是移栽时防止伤根。移栽完成后浇水并覆盖白色薄膜3—4天。待角果开裂就可以收种子了，此时收的种子是T2种子，T2种子就已经开始出现分离比了，所以此时再进行筛选时每个皿里涂的种子就不宜过多了，种子之间不能靠的太近。如果是单拷贝的，则会出现3：1的分离比，如果是双拷贝的，则会出现15：1的分离比，依次类推。听他们说转拟南芥单拷贝出现的几率比转棉花要高。T2拟南芥幼苗挑15—20颗。以单拷贝为例，即使是阳性的，也会出现AA和Aa两种情况，所以T2幼苗继续按上述方法让它长根，移栽，收种子，此时收的种子就是T3种子，继续筛选，如果T3不分离的话，那么证明是T2是AA；如果出现3：1分离比的话，那么T2是Aa。不出现分离的T2及T3种子就是纯系了，把它们种下去长出的拟南芥就可以进行基因功能验证了。最终要保证转基因纯系在10个以上。