花序浸染法转化拟南芥
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
侵染液制备
1、将保存的农杆菌拿出按1：100的比例接种与5ml含抗生素的液
体YEP培养基中。
28°C、220rpm过夜培养。
农杆菌2h左右繁殖一代，培养时间较大肠杆菌长。
2、将活化好的农杆菌按1：100的比例加入100ml含抗生素的液
体YEP培养基中继续28°C、220rpm培养16h左右。
3、次日中午测菌液OD600值，用含抗生素的液体YEP培养基作为
空白对照。
OD600值达到1.0-1.3之间时，用50ml离心管，
室温4000rpm离心10min集菌。
倒掉上清，加入悬浮液重悬
菌体，调节OD600达到0.8-1.0.
悬浮液100ml为例：ddH2O 1OOml、MS 0.216g、蔗糖5g、L-77 30ul，调节PH=5.8
4、拟南芥有花序、花蕾的植株浸入悬浮好的菌液40-50s ,确保
所有的花都浸在农杆菌培养液中。
浸染后避光过夜，第二天
揭开覆膜。
正常光照培养。
每隔七天转化一次。
可转化3次
提高转化效率。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌渗透转化拟南芥
1）取含有重组质粒的农杆菌，在含有相应抗生素的YEP（LB也可以）平板上划线，28℃培养2-3d。
2）取划线的农杆菌单菌落，接种在3ml含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡过夜培养。
3）在400-500ml 含相应抗生素的YEP培养基中，接种3ml过夜培养的起始农杆菌液，并在28℃摇床上振荡过夜，培养至细菌OD600值大于2.0。
4000rpm离心
10min收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液（1/2MS，50g/L蔗糖，0.5g
MES，pH=5.7-5.8，250ul/L silwetL-77(0.02%silwet)）中，此时的OD600值约
为0.8。
一般来说，400ml YEP过夜培养的农杆菌应至少可以渗透转化6钵植株。
4）在一个开口的大器皿（如500ml烧杯）内倒入200-300ml的悬浮有农杆菌的渗透液。
5）将生长有拟南芥的培养钵（盛花期拟南芥，最好在转化前修剪掉果荚和已经开放的花）小心地反扣在上述器皿内，让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌悬浮液中
大约1min，将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。
6）将处理过的植物用塑料盖盖上避光大约24h培养。
7）将植物放置在适宜的条件下培养3-4周，收集种子，进行下一步的筛选处理。
转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
Silwe-77t：加300微升/L 浸30s 50-100微升/L 浸3分钟。
拟南芥的遗传转化
拟南芥的遗传转化作者：刘晓丽魏楠来源：《河南农业·教育版》2019年第09期摘要：通过构建重组表达载体，转化农杆菌制作浸染液，实现农杆菌介导法进行目的基因的拟南芥遗传转化，将目的基因转入到野生型拟南芥中。
通过筛选和鉴定后，得到阳性的转基因植株，最终得到纯合T3代转基因株系。
后续可以通过对纯合转基因株系和野生型拟南芥进行比较鉴定，即可推断目的基因在拟南芥中的功能。
关键词：拟南芥;遗传转化;实验一、实验材料（一）试验材料转基因所需的菌株：农杆菌EHA105;转基因所需的模式植物：野生型拟南芥;转基因所需的植物表达载体：pCAMBIA3301。
（二）试验试剂本实验所需试剂主要有：Mu-rashige Skoog（MS）培养基：M519（Phyto Technology Laboratories，LLC）;YEB、YEP液体培养基;YEP固体培养基;抗生素氯霉素（chlorampheni-col，Chl）、卡那霉素（kanamycin，Kan）;草铵膦（phosphinothricin，PPT）;v/v（1：5）的次氯酸钠溶液;琼脂;蔗糖;表面活性剂silwetL-77等。
二、实验方法（一）超表达载体的构建采用质粒小提试剂盒提取扩增、测序结果均正确无误的pGM-T-目的基因的质粒，具体步骤如下：第一，取2ml过夜培养的含目的基因的大肠杆菌Trans 5a转化菌液，12，000rpm离心I min，吸除上清;第二，向留有菌体沉淀的离心管中加入150ul溶液P1（已加入RNase A和0.5%的TIANRed），使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀;第三，向离心管中加入150ul溶液P2，温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解;第四，向离心管中加入350ul溶液P5，立即快速地上下颠倒12-20次，充分混匀，将出现絮状沉淀，然后，12，000rpm离心2min;第五，将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。
拟南芥实验报告
一、实验目的1. 了解拟南芥基因表达调控的基本原理和实验方法；2. 掌握利用RNA干扰技术（RNAi）研究基因表达调控的方法；3. 通过实验验证特定基因在拟南芥生长发育过程中的功能。
二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学研究的模式植物。
在植物生长发育过程中，基因表达调控起着至关重要的作用。
RNA干扰技术（RNAi）是一种利用双链RNA（dsRNA）降解特定mRNA，从而抑制目标基因表达的技术。
本实验通过构建特定基因的RNA干扰载体，导入拟南芥，观察目标基因表达受抑制后的表型变化，以研究该基因在拟南芥生长发育过程中的功能。
三、实验材料1. 拟南芥野生型植株；2. 目标基因cDNA克隆；3. 载体pCAMBIA1300；4. 实验试剂：DNA连接酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、pUC18载体、DNA分子量标准等；5. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、激光共聚焦显微镜等。
四、实验方法1. 目标基因cDNA克隆：利用PCR技术扩增目标基因cDNA，克隆到pUC18载体上，进行序列验证；2. RNA干扰载体构建：利用PCR和限制性内切酶技术，将目标基因cDNA克隆到载体pCAMBIA1300的RNAi表达框中，构建RNA干扰载体；3. 拟南芥转化：采用花序浸染法将RNA干扰载体导入拟南芥野生型植株；4. 表型观察：观察转化植株的生长发育状况，记录表型变化；5. 基因表达分析：采用RT-qPCR技术检测转化植株中目标基因mRNA表达水平的变化。
五、实验结果与分析1. 目标基因cDNA克隆：通过PCR和序列验证，成功克隆目标基因cDNA；2. RNA干扰载体构建：成功构建了RNA干扰载体，经测序验证无误；3. 拟南芥转化：成功转化拟南芥野生型植株，获得转化植株；4. 表型观察：转化植株在生长发育过程中出现表型变化，如叶片变小、生长缓慢等；5. 基因表达分析：RT-qPCR结果显示，转化植株中目标基因mRNA表达水平显著降低。
拟南芥蘸花法
农杆菌蘸花转化拟南芥法1、将低温保存的带有表达载体的农杆菌菌株，分别在对应抗性平板上划线，挑取单菌落接种于5ml的已加入对应抗生素的液体LB培养基中，28℃下250rpm振荡培养18-24h；2、然后相同条件下按照1:100接种扩大培养，总菌液体积为200ml，直到OD600值在0.8-1.0范围内；3、离心沉淀并去上清液，用等体积的5%的蔗糖溶液重悬菌体，在菌液中加入0.02%-0.04%的SilwetL-77混匀；4、将拟南芥的花序在菌液中蘸取0.5-1min即可(在转化前要先将拟南芥的角果剪掉);5、然后将拟南芥苗放置于黑暗，湿润的条件下16h，一周后，重复侵染一次；6、收种后种植后代，向12d的幼苗上喷洒54mg/ml除草剂或在将种子播种于抗性MS平板上以筛选阳性植株。
拟南芥播种1、将拟南芥种子用50%的84消毒液表面消毒6-8 min，继而用无菌水漂洗3次;2、在0.1%琼脂糖中悬浮，然后播种在抗性的MS培养基上，4ºC低温避光处理2天后，转入光照培养室生长。
3、幼苗7d左右便可筛到阳性植株，并移栽到含有蛭石的营养土中继续生长（蛭石：营养土=1：3）。
植株种植的培养箱维持22℃恒温和16h光照/8h黑暗培养的循环培养条件。
注：几种常用抗生素的工作液浓度Kanamycin 50μg/mlGentamicin 50μg/mlRifampicin 25-50μg/mlHygromycin 50μg/mlBarstar 25-50μg/ml注：MS培养基配方（1L）MS盐 4.4gMES 0.5g蔗糖10g调PH至5.8-6.0加Agar 10g(在抗性MS培养基上筛选阳性转基因植株时可不加蔗糖防止长菌)42. Schägger H, von Jagow G (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.AnalBiochem166:368–379.。
拟南芥浸花法转化流程
拟南芥浸花法转化流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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在进行拟南芥浸花法转化之前，需要做好充分的准备。
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥一、实验目的1.了解浸花法(floral tip)转化的机理；2.掌握拟南芥浸花法(floral tip)转化的技术二、实验原理拟南芥的花序大量产生时，将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡20秒，3-4周后对转化植株收种子。
在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选，能够健康生长的幼苗为转基因植株。
三、实验材料及仪器材料：生殖期的拟南芥植株，含目的基因质粒的农杆菌(PCAMIBIA 3301-ZEP)，无菌滤纸仪器设备：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式高速离心机，涡旋仪，抽滤器，高压灭菌锅，电子天平，酸度计，培养室用具：微量移液器，金属药匙，牙科手术钩或细菌涂布器，100 ml无菌三角瓶，直径9 cm 培养，200 ml及1ml tip枪头，枪形镊四、实验步骤1)当野生型株系的拟南芥植株生长了个月左右。
将其主薹剪掉，待其次生薹长出，浸染前剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花；2)将农杆菌菌液扩大培养接入到250 ml含有50 μg/ml的Kan和Rif的YEP的液体培养基中:3)将装有250 ml YEP液体培养基的500 ml三角瓶置于28℃ 200 rpm下振荡培养24 h;4)分批次将250 ml YEP液体培养基装在50 ml离心管中多次离心，每次7500 rpm离心5 min,直到把所有的农杆菌都聚集在管底；5)用5%的蔗糖溶液。
其中加了0.02%-0.05% (VV)的silwet L-77来重新悬浮聚集在管底的农杆菌，直到把浓度稀释到OD600为1.5左右即可；6)把蔗糖溶液重悬的农杆菌菌液放入50 ml 离心管中，将花盆倒转过来，将花序浸入农杆菌中20 s，轻轻转动和晃动植物，保证腋芽生长的花都能浸到液体溶液中，取出后能看见植物上有一层水膜，轻轻晃动植物3-5 s抖掉过多的液体(花在液体中浸泡时间过长有所伤害)。
7)浸染过得植株放置在塑料盆中并用一个高的遮光的袋子遮住植株以保持其湿度,并将盆置于弱光或黑暗的条件下一天；8）将其遮光袋拿去，移到智能气候室培养，并定期补浇营养液，直到角果成熟收获种。
拟南芥
拟南芥种植花序浸染法转化拟南芥（1）种植：选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土（1：1/2）作为拟南芥种植土壤。
直径9cm的花盆，每盆播种20-30颗。
播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。
（2）去顶：在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。
适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。
（3）配制浸染液：在5%的蔗糖溶液中重悬农杆菌使OD=0.8，为了保持蔗糖溶液的新鲜，可以现配现用，无需灭菌。
100-200ml浸染2-3个小盆植株，400-500ml浸染，2-3个花盆（9cm）植株。
在浸染之前加入表面活性剂至浓度0.05%（500ul/L），如果产生表面活性剂的毒性现象（浸过部分发黄或死亡），将浓度降至0.02%。
（4）浸染：将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在农杆菌悬浮液中2-3s，同时轻轻旋转。
（5）暗培养：将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养24h。
（6）浸染后培养：隔天浇水，保证水分充足即可。
（7）种子收集：种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。
（8）转基因种子筛选：在含有Kan抗生素的平板上培养浸染后所得种子。
40mg的种子大约200颗于含kan 10-50μg/ml 的0.5×MS培养基上春化2天，之后在持续光照条件下培养7-10天。
根据生长状况判断是否为转基因种子。
成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶。
非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天以后死亡。
（9）转基因植株转土栽培。
转基因种子在MS+kan平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。
转基因拟南芥纯合子筛选由于农杆菌介导的花序浸染法只能将目标片段整合到一条DNA单链上，为后续生理性状实验需要，将T0代转基因种子培育至T2代，利用抗性筛选得到纯合子。
根据杂合子在发生性状分离时会产生野生型后代，而野生型种子不能在MS+Kanr（50μg/ml）平板上正常生长，进行转基因植株纯合子的筛选。
采用农杆菌花序浸染法获得转crtB基因拟南芥
采用农杆菌花序浸染法获得转crtB基因拟南芥作者：刘慧娟，冯志国，李先文，等来源：《湖北农业科学》 2013年第1期刘慧娟１，２，冯志国１，２，李先文1，李涛２，３，何光源２（１．信阳师范学院生命科学学院，河南信阳４６４０００；２．华中科技大学分子生物物理教育部重点实验室，武汉４３００７４；３．重庆警察学院，重庆４０１３３１）摘要：利用农杆菌花序浸染法将构建的植物表达载体ｐＢＩ１２１－ｔｐ－ｃｒｔＢ转入拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）野生型Ｃｏｌｕｍｂｉａ中，共获得了１４株转基因系，并进行了转基因拟南芥种子萌发实验。
结果表明ｔｐ－ｃｒｔＢ基因已经成功转入拟南芥中，其不影响拟南芥种子的正常萌发。
关键词：ｃｒｔＢ基因；农杆菌花序浸染法；拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）中图分类号：Ｑ９４３．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０13）01－0200-03类胡萝卜素（Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ）是一种在自然界中分布广泛、种类丰富的色素，导致许多植物的果实、花及块根呈现橙红色、黄色或红色。
类胡萝卜素对动物、植物、藻类、细菌以及真菌细胞都是不可缺少的营养成分。
植物类胡萝卜素还是植物激素［１］、防御化合物［２］和风味芳香物（如β－吲哚）［３］等许多生理活性物质生物合成的前体。
噬夏孢欧文氏菌（Ｅｒｗｉｎｉａｕｒｅｄｏｖｏｒａ）类胡萝卜素合成相关基因ｃｒｔＢ编码的八氢番茄红素合成酶是催化类胡萝卜素合成的关键酶和限速酶。
为了研究该酶对类胡萝卜素合成的调控作用，构建了特异性表达载体ｐＢＩ１２１－ｔｐ－ｃｒｔＢ，通过农杆菌花序浸染法将其转入拟南芥，获得转ｃｒｔＢ基因拟南芥植株，为分析ｃｒｔＢ基因的过量表达对拟南芥生长发育的影响奠定基础。
１材料与方法１．１材料大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５α、根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０５及ｐＢｌｕｅ－ｓｃｒｉｐｔＫＳ、植物表达载体ｐＢＩ１２１－ｎａｐＡ均为华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室保存。
农杆菌介导DR1372基因转化拟南芥的研究
农杆菌介导DR1372基因转化拟南芥的研究张思维;周文波;张新;陈翠娜;代其林【摘要】耐辐射奇球菌(D.radiodurans,DR)在极端胁迫条件下能够继续生存,其耐辐射奇球菌基因组中(DR R1)拥有一个独特的极端环境抗性基因组而被广泛研究.DR1372基因就是在DR R1中克隆得到的一个基因,其蛋白序列存在一个Why 功能域,此功能域可能参与了植物的抗旱过程.我们利用基因工程手段首先构建了植物DR1372-GV3103表达载体,然后利用花序浸染法成功将目的基因DR1372转入拟南芥中,最后对阳性植株进行盐胁迫,证实了DR1372基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性.初步建立了农杆菌介导DR1372基因转化拟南芥体系,为后续DR1372基因的功能研究工作提供了理论基础.【期刊名称】《绵阳师范学院学报》【年(卷),期】2013(032)002【总页数】8页(P57-64)【关键词】DR1372;载体构建;盐胁迫;拟南芥【作者】张思维;周文波;张新;陈翠娜;代其林【作者单位】西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳621000【正文语种】中文【中图分类】O175.120 引言目前，越来越多的抗旱相关基因已经被克隆，并用来提高植物的抗旱性.按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相关基因分为两大类:第一类是编码在植物抗性中直接起保护作用的蛋白质基因，属于功能基因;第二类是编码在信号传导和逆激基因表达过程中起调节作用的转录因子基因，属于调节基因［1］.Pibn－Smits等将otsA和otsB导入烟草，在干旱胁迫下，转基因植株中海藻糖含量比对照高，叶面积增大，光合活性提高［2］.Kishor等将从乌头叶豇豆中克隆的P5CS基因与CaMV35S启动子连接转入烟草中，发现转基因烟草的脯氨酸含量比对照高10－18倍;干旱胁迫下，转基因烟草落叶少而迟，根比对照长40%，生物量增加2倍［3］.Capell等发现Adc在水稻中的超表达缓解了干旱条件下转基因水稻叶绿素的损失，并提高了水稻的抗旱性［4］.由于转录因子能在转录水平上调控一系列基因的表达，所以转化调节基因能有效地提高植物的耐旱性，与抗旱相关的转录因子有DREB、MYC/MYB、bZIP、WRKY和NAC类等，其中MYB/MYC是植物中最大的转录因子家族.Chen等发现了小麦中23个MYB转录因子，其中有4个与抗旱相关［5］.耐辐射奇球菌(D.radiodurans，DR)是Anderson等科学家在1956年从经过灭菌处理的肉类中发现的一种红色非致病性球菌，目前被认为是"世界上抗性最强的细菌"，因其对电离辐射、干燥、紫外线及一些DNA损伤试剂显示超强的抗性，一直倍受生物医学界的关注［6］.White等在1999年公布了DR R1的完全基因组序列，包括两条染色体，共携带有3195个可预测基因，并对部分基因进行了评注［7］.DR R1基因组可以在一个细胞中完成DNA修复，DNA损伤信号输出，干旱和饥饿胁迫的应答，以及基因组的修复等功能.Battista等推测，在耐辐射球菌R1中的抗旱性研究将用于引导较高生物体的抗旱性研究［8］.DR1372基因是耐辐射奇球菌体内1号染色体上的一个基因，把这个基因转入大肠杆菌后进行培养，经初步定性分析发现，在大肠杆菌中有稳定细胞膜，调节细胞内外渗透压的作用，初步推测为与调节水分胁迫应答有关的基因.对DR1372蛋白序列进行分析发现，其内部存在一个WHy功能域非特异性结合位点，与HIN1蛋白中的WHy功能域结构非常相似［9］.WHy结构域存在于几大类蛋白质家族中，大约由100个氨基酸组成，这些氨基酸由亲水性和疏水性氨基酸交替排列，并且在N末端都存在一个非蛋白氮(NPN)结构.同时，研究者还在胚胎发育晚期蛋白中也发现了WHy功能域的存在，最终推测WHy结构域是参与植物水分胁迫应答以及超敏应答的一类功能域［9］.脱水素是一类亲水性蛋白质，其蛋白结构中也含有一个WHy功能域，它们在胚胎发生后期阶段产生，对低温、外源ABA、干旱、盐渍以及脱水胁迫反应迅速，进而在植株中积累［10、11］.由于WHy功能域参与了干旱胁迫应答，这些间接证据表明DR1372基因在干旱胁迫过程中也可能参与了抗旱性相关的基因.因此，本研究利用基因工程手段构建植物DR1372－GV3103表达载体，将DR1372基因转入拟南芥中，得到转基因抗性拟南芥，并对转DR1372基因拟南芥幼苗进行了盐胁迫的反应，不仅为后续的该基因研究提供了丰富的植物材料，也为DR1372的功能研究包括WHy功能域的功能研究奠定了基础，对植物育种工作也有一定的指导意义.1 实验材料1.1 植物材料拟南芥野生型col－0生态型1.2 菌株DR1372+Z3(DR菌内与干旱相关的基因DR1372与穿梭质粒pRADZ3连接转大肠杆菌)，JM109，JM109，GV31032 实验方法2.1 构建DR1372－GV3103植物表达载体2.1.1 DR1372 基因的引物设计根据DR1372基因序列，利用生物软件Primer5设计出该基因的上、下游引物(分别命名为DR1372－F，DR1372－R);根据pBI121质粒图谱，分别引入XbaI，SacI限制性酶切位点，并设计引物如下:2.1.2 PCR扩增目的基因DR1372用试剂盒(TIANGEN)提取DR1372+Z3质粒，在最优扩增体系下进行PCR扩增.电泳验证.2.1.3 质粒pBI121的提取用试剂盒(TIANGEN)提取pBI121质粒.电泳验证.2.1.4 PCR 产物胶回收PCR产物经电泳检测后，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN)回收扩增的目的片段DR1372和pBI121.电泳验证.2.1.5 DR1372基因和pBI121的酶切，连接，筛选及鉴定2.1.5.1 目的片段DR1372和pBI121质粒用XbaI，SacI(购自Takara公司)进行双酶切，37℃酶切过夜，回收目的片段.2.1.5.2 将回收的目的基因片段和pBI121质粒大骨架片段，16℃连接过夜，重组质粒转化JM109感受态细胞.2.1.5.3 阳性克隆检测:进行菌落PCR初步鉴定，将PCR检测出的阳性单克隆摇菌后送华大基因公司测序.2.1.6 挑取测序成功的JM109单菌落，继代培养，保菌.将保存菌种摇菌提取质粒，得到 DR1372－GV3103植物表达载体.2.2 花序浸染法转化拟南芥2.2.1 培养基:MS培养基中抗性筛选平板加入卡拉霉素(Kan，50 mg/ml)Hoagland＇s(霍格兰氏)液体培养基药品试剂:乙酰丁香酮(AS)Silwet－L77表面活性剂2.2.2 拟南芥种子的消毒、铺板及植株培养选取150粒拟南芥种子，用75%乙醇消毒1 min，然后用无菌水洗2遍;再用2.5%NaClO消毒5 min，用无菌水清洗5遍后，最后用加无菌水少许，放在4℃冰箱春化2 d后进行铺板.铺板前一天按照每板大约25 mL MS配制固体平板培养基，col－0生态型拟南芥种子铺于无抗性培养基上，放入光照培养箱中(22℃，16h/8h光/暗培养 (光强130 μmol·m－2·s－1)).培养10 d后把拟南芥幼苗移栽至培养土中(营养土/蛭石=2:1)，相同温度和光照条件下继续培养，每3 d浇水一次.待拟南芥开出花序准备进行浸染.2.2.3 花序浸染法浸染拟南芥:2.2.3.1 DR1372－GV3103农杆菌的培养:在200 mL LB液体培养基中加入0.2 mL DR1372－GV3103菌液，28℃ 220 rpm振荡培养15 h左右，室温下4000 rpm离心20 min，弃上清，用1/2 MS液体培养基(含AS 100 μmol/L，0.05%Silwet－L77表面活性剂)悬浮菌体，稀释到原体积的10倍，在28℃ 220 rpm振荡培养1 h，菌液浓度达到OD600=0.5时待用.2.2.3.2 浸染:将拟南芥未开花的花序浸入菌液中3－5 s，倒放24 h，并用薄膜覆盖避光24 h，然后21℃光照培养.2.2.4 收取拟南芥的T1代种子:T1代种子采收后，用含有卡那霉素的平板进行转基因阳性筛选，然后提取抗卡那霉素的拟南芥幼苗基因组进行PCR鉴定，阳性T1代幼苗开花结实后，收取T2代种子，得到纯合体转基因拟南芥种子.2.3 转DR1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应2.3.1 拟南芥种子的消毒、铺板选取T2转基因拟南芥种子约200粒，用75﹪乙醇消毒1 min，用无菌水洗2遍;再用2.5﹪NaClO消毒5min，随后用无菌水清洗5遍，再次加入无菌水放置在4℃冰箱进行春化处理2d.然后把春化后的种子铺在25 mL MS固体培养基上，转基因和非转基因拟南芥种子均铺于无卡拉霉素的培养基上，封口放入光照培养箱中培养(22℃，16/8h 光/暗培养 (光强为130 μmol·m－2·s－1)).2.3.2 对拟南芥幼苗进行NaCl盐胁迫待拟南芥幼苗在平板上长出3片叶后，在平板中加入0、100、200、250和300 mmol/L灭菌的NaCl溶液.然后观察拟南芥幼苗的生长状况.3 结果3.1 pBI121－DR1372质粒的构建3.1.1 提取含DR1372基因质粒提取DR1372质粒，其电泳结果如图A所示，我们提取的目标基因条带清晰，无弥散现象，可以用于PCR扩增.3.1.2 DR1372 基因的扩增利用DR1372－F和DR1372－R引物对DR1372基因进行PCR扩增，其电泳结果如图B.DR1372基因分子大小为495 bp，条带位置正确，并且为单一条带.然后对PCR产物进行胶回收，其胶回收电泳结果如图C.3.1.3 pBI121 质粒的提取提取pBI121质粒后进行电泳，其电泳结果如图D所示，所提取的目标基因条带清晰，无弥散现象，可以进行酶切.3.1.4 对DR1372胶回收产物进双酶切，酶切位点分别为XbaI，SacI，经电泳后(图E)再胶回收(图F).同时对pBI121质粒进行XbaI，SacI双酶切，其电泳图和胶回收情况见图G和图H.从图G和图H两个电泳图分析表明:经双酶切后，目的基因DR1372和质粒pBI121都被切开，胶回收后都能够得到清晰单一的条带，该连接了DR1372基因的质粒pBI121载体可以用于大肠杆菌和根癌农杆菌的转化.3.1.5 连接目的基因的质粒转化菌种JM109把链接了目的基因的质粒转化到JM109后，经培养后挑取抗卡拉霉素菌落直接进行PCR扩增，其扩增的部分结果如图I，表明:有多个菌落显示为阳性，把阳性克隆送去测序，测序反馈结果经过软件分析，目的序列与DR1372序列完全一致，说明DR1372外源基因成功导入到了大肠杆菌中JM109.图1 pBI121－1372质粒的构建结果Fig.1 pBI121－DR1372 clone in JM109A －I中M为DL2000 MarkerA:DR1372+Z3质粒电泳条带A:Agar gel electrophoresis of DR1372B:DR1372扩增条带B:Agar gel electrophoresis of PCR productC:DR1372 PCR胶回收验证C:Agar gel electrophoresis of DNA extractionD:pBI121质粒提取验证D:Agar gel electrophoresis ofpBI121E:DR1372双酶切电泳图E:Agar gel electrophoresis of DR1372 digested productsF:DR1372双酶切后胶回收电泳图 F:Agar gel electrophoresis of DR1372 digested products，extractionG:pBI121双酶切电泳图G:Agar gel electrophoresis of pBI121 digested productsH:pBI121双酶切胶回收验证 H:Agar gel electrophoresis of pBI121 digested products，extractionI:JM109菌落PCR验证 I:1:positive control;2:negative control;3－10:PCR products of JM109 with pBI121－DR1372 clone3.2 DR1372－GV3103植物表达载体的构建将测序正确的JM109单菌落质粒转化GV3103感受态，得到的单菌落进行菌落PCR验证，结果如图2.由图2可以选择1－2、4－6号保菌做浸染拟南芥用，阳性率为66.67%.图2 DR1372－GV3103的菌落PCRFig.2 Analysis of DR1372－GV3103M:DL2000 maker，9:阳性对照，10:阴性对照，1 －8:单克隆菌落PCRM:DL2000 Marker;9:positive control;10:negative control;1－8:PCR products of GV3103 with pBI121－DR1372 clone3.3 转DR1372基因拟南芥体系的建立及抗性植株的获得3.3.1 转DR1372基因拟南芥体系的建立利用花序浸染法侵染拟南芥未开花的花序，待拟南芥角果成熟后收取种子(浸染到收取种子的过程如图3所示).将收取的种子用50 mmol/L卡那霉素筛选，得到30株抗卡拉霉素的幼苗，提取抗性幼苗DNA，进行PCR检测，然后得到10株转DR1372基因的阳性拟南芥苗，待成熟后收种T1代种子.对T1代种子进行进一步筛选，得到纯合的转基因阳性植株T2代，T2代得到阳性苗60株，经PCR检测后得到纯合阳性植株22株，阳性率为36.7%.3.3.2 阳性植株的PCR检测对具有卡那霉素抗性的转化植株提取DNA，进行PCR扩增和电泳检测，其电泳的部分结果如图4所示，共检测出12株拟南芥有清晰的495bp大小的扩增条带，说明外源DR1372基因成功转入到野生型拟南芥中.图3 转DR1372基因拟南芥体系的建立Fig.3 Regeneration of transgenic ArabidopsisA:花序浸染后拟南芥 B:50MKan筛选T1代抗性苗 C:T1带抗性拟南芥幼苗 D:T1抗性拟南芥代成株子E:筛选T2代抗性苗 F:T2代抗性拟南芥幼苗G:T2代抗性拟南芥成株A:the impregnated Arabidopsis B:resistant shoots of T1generation C:T1generation Arabidopsis seedlingD:the mature plant of T1generation E:resistant shoots of T2generation F:T2generation Arabidopsis seedlingG:the mature plant of T2generation图4 转DR1372基因拟南芥PCR检测Fig.4 PCR test of DR1372gene in transgenic plantsM:DL2000 maker;1:阳性对照;14:阴性对照(野生型);2－13:抗性植株M:maker;1:positive control;14:Negative controls(WT);2－13:Transformed plants3.4 转DR1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应当转DR1372基因拟南芥T2代和非转基因植株种子发芽生长至第3片叶时，分别添加0、100、200、250和300 mmol/L的NaCl溶液.NaCl胁迫7d后，转DR1372基因拟南芥植株与非转基因植株的生长发育状态发生了很大的变化，并且相同浓度下转基因植株与非转基因植株的萎蔫程度也有着明显的差别(如图5).当NaCL胁迫浓度为100 mmol/L时，非转基因植株叶片开始黄化，盐环境已经对拟南芥的生长产生抑制，而转基因植株未受影响;当NaCL浓度达到200 mmol/L 时，非转基因拟南芥的叶片和茎部黄化程度加重，植株开始萎蔫，同时转基因植株部分叶片也出现黄化;当NaCL浓度达到250 mmol/L时，转基因拟南芥植株与非转基因植株都出现了不同程度的萎蔫死亡，但非转基因植株萎蔫程度要比转基因植株严重;当NaCL浓度达到300 mmol/L时，非转基因拟南芥绝大部分萎蔫死亡，转基因植株虽然叶片和茎部出现萎蔫发紫，但死亡程度较小，部分植株仍能正常生长存活，说明转基因拟南芥有一定的抗盐能力，盐胁迫环境下下，DR1372基因在一定程度上调控了植株度过盐环境.图5 转DR1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应Fig.5 Growth of transgenic and wild type Arabidopsis seedlings treated with different concentrentions of NaCL4 讨论近几年许多与植物抗旱耐盐相关基因被克隆和分析，同时通过转基因技术将这些基因转入到植物中进行异源表达，能显著提高转基因植物的抗旱耐盐能力.其中转录因子通过与相关基因的特异性结合来调控其表达，进而产生相关调控蛋白等物质增强植物在逆境中的生存能力［12］.DR1372基因的蛋白中有WHy结构域，这结构域是通过对HIN1蛋白进行分析鉴定的一种独特的结构域.Francesca D、Ciccarelli、Peer Bork［9］等人研究表明，WHy结构域在植物中具有抗水分胁迫和高敏反应等干燥应答功能.WHy功能域作为一种干燥响应蛋白，在国内的研究中外鲜有报道，在植物体内的抗水分胁迫应答机制中，是WHy功能域独自发挥了作用还是能够识别某些特定的序列而协同发挥响应，这一问题有待进一步探究. 对转化了DR1372基因的大肠杆菌进行定性分析发现，逆境下的大肠杆菌中细胞膜很稳定，其细胞膜调节细胞内外渗透压的能力很强.由此推断，将DR1372基因通过基因工程手段转入植物中，该基因可能会提高植物抗旱性，以此为基础通过培育抗旱品种，以降低干旱对农作物产量的影响.拟南芥是转基因最好的模式植物，由于其基因高度纯合，并且自花授粉，能够快速鉴定基因的相关作用.本研究通过基因工程手段成功将外源基因DR1372转入了拟南芥基因组中.实验中构建了DR1372－pBI121载体，载体上带有一个GUS基因，以及CaMV35S强启动子和NOS终止子，能够稳定调控DR1372基因在植物中的表达.利用冻融法将植物表达载体DR1372－pBI121载体导入农杆菌GV3103，最后利用根癌农杆菌介导法成功将外源基因DR1372整合到拟南芥.对DR1372基因拟南芥幼苗进行盐胁迫反应，发现转基因植株与非转基因植株在盐胁迫反应过程中，当NaCL浓度较小时，虽然植株的生长都受到了抑制性影响，但转DR1372基因拟南芥植株的抑制作用明显小于非转基因植株，当浓度达到300 mmol/L时，非转基因植株基本萎焉死亡，而部分抗性植株仍能存活生长，说明DR1372基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性.本实验通过基因工程手段，成功得到转DR1372基因阳性植株，盐胁迫处理发现阳性植株比非转基因植株有更强的耐盐功能，这为后续该基因或类似功能基因的抗旱、抗盐性研究提供了丰富的植物材料和理论依据.参考文献:［1］李晓慧，董明伟，刘康.植物抗旱基因及其功能研究进展［J］.江苏农业科学，2009，5(4):73－77.［2］Pilon－Smits E A H，Ebskamp M J M，Paul M J，et al.Improved performance of transgenic fructanaccumulating tobacco under drought stress［J］.Plant Phyiol，1995，107:125 －130.［3］Kishor P B K，Hong Z，M iao G，Hu C A，et al.Overexpression of pyrroline carboxylase synthase increase proline production and confersosmotolerance in transgenic plants［J］.Plant Physiol，1995，108:1367 － 1394.［4］Capell T，Escobar C，Liu H，et al.Overexpression of the oatarg in inedecarboxylase cDNA in transgenic rice affects normal development patterns in vitro and result in putrescine accumulation in transgenic plants ［J］.Theor Appl Genetics，1998，97:246－254.［5］Chen J.and Wang Z.Y.Progress in the study of plant mybtranscription factors，Zhiwu Shengli Yu Fenzi Shengwuxue Xuebao(Journal of Plant Physiology andMolecular Biology)，2002，28(2):81 －88.［6］Anderson，A.W，Nordon，H.C，Cain，R.F.，et al.Studies on a radio－resistant micrococ－cus.I.Isolation，morphology，cultural characteristics，and resistance to gamma radiation［J］.Food Technol，1956，10:575 －578.［7］White O，Eisen J.A，Heidelberg J.F，et al.Genome sequence of the radio－resistant bacterium Deinococcus radiodurans R1［J］.Science，1999，286:1571 －1577.［8］Cominelli E，Sala T，Calvi D，et a.l Over exp ression of theArabidopsis AMYB 41 genealters cell expans ion and leaf surface permeability［J］.Plant Journal，2008，53(1):53 －64.［9］Francesca D.Ciccarelli and Peer Bork .The WHy domain mediates the response to desiccation in plants and bacteria［J］.Discovery Note，2005，8:1304 －1307.［10］Ingram J，Bartels D.The molecular basis of dehydration tolerance in plants［J］.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1996，47:377－403. ［11］刘广宇，魏令波，陈吉龙，等 .植物脱水素研究进展［J］.生物工程进展，2001，21(2):35－38.［12］陈丽萍，何道一.植物抗旱耐盐基因的研究进展［J］.生物工程进展，2010，29(3):542－549.。
植物转基因的花序浸润法
植物转基因的花序浸润法摘要通过对植物转基因的花序浸润法的研究，介绍了花序浸润法的操作要点及其注意事项，为尝试这种方法进行转基因研究提供参考。
关键词转基因；花序浸润法；操作要点；注意事项自从1984年首次获得转基因烟草以来，植物基因工程取得了长足的发展，转基因技术得到了日益广泛的应用，转基因作物在生产上大面积推广应用。
但是，在大多数植物中还存在转化率低、转基因植株再生和鉴定难、操作周期长等问题，获得大量转基因植株仍然比较困难。
目前，植物遗传转化最常用的农杆菌介导法和基因枪法，存在着依赖于组织培养，操作复杂，过多的处理常引起受体组织的突变，以及转化植株中常出现基因沉默等不足。
而非组培植物基因转化方法中，农杆菌真空渗透法虽然无须经过植物组织培养或再生，但是真空渗透过程很费力。
为此，在真空渗透法的基础上又发展了花序浸润法(flora／dip)。
花序浸润法转化首先在拟南芥中获得成功，随后对萝卜、甘蓝型油菜的转化也获得了成功。
花序浸润法转化不需要进行真空处理．只需将发育的花组织简单地浸泡在农杆菌液中，大大简化了转化程序，对其他物种的遗传转化也有很好的借鉴价值。
结合笔者的实践体会，本文以拟南芥为例介绍花序浸润法转化的操作要点及其注意事项。
1花序浸润法转化的操作要点1．1植株的培养拟南芥植株在植物生长室或人工气候箱中生长至开花阶段，培养条件为16h 光照／8h黑暗，在室外光照水平低于14000Lx时白天辅以18h高压钠光，湿度为80％。
在盛有潮湿的培养土的25cm3容器中种植1～2株，或64cm3容器中种植6～20株。
为了防止容器中的土在浸润时洒落进接种介质，土隆起至略微高出容器中的边沿，播种后用尼龙窗纱或纱布织品覆盖在土上并用橡皮带固定。
为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花薹形成后剪去第一个花薹，解除顶端优势，促使多个次生花薹的同步出现。
当大多数花序约1～10cm 高(剪主薹后4～8d)时开始浸润。
利用花序浸泡法将大片段胡杨基因转入拟南芥
溶剂 为 二 级 水
滴加 ５ ｍ ｏ ｌ Ｎ ａ Ｏ Ｈ调节 ｐ Ｈ值至 ７ ． ０ 高 温 高压 灭 菌 后 ， ４ ｃ ｃ 保存（ 固体 培 养基 加 １ ３克 琼 脂 ） 。 （ ３ ） Ｙ Ｅ Ｂ液 体 培养 基
Ｔ ｒ ｙ ｐ ｔ ｏ ｎ ｅ ５克／ 升 Ｙｅ ａ ｓ ｔ Ｅｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ １ ０克 ， 升
种 子 。介 质 表 面用 喷 壶 轻 轻 地 喷 水 ． 以便 种 子能 够 完 全 与土 壤接触 。 保 鲜 膜 覆盖 保 湿 ， 置 于培 养 架 培 养 。保 湿 三天 ， 待 种
子发芽， 于叶 展 开 ， 即可 去 除保 鲜 膜 。 ．
Ｙ ｅ ａ ｓ ｔ Ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ５克， 升
Ｎａ Ｃ Ｉ １ Ｏ克／ 升
溶 剂 为 二级 水 滴加 ５ ｍ ｏ ｌ Ｎ ａ Ｏ Ｈ调节 ｐ Ｈ值至 ７ ． ０
④每周浇水 １ 次． 抽苔前浇 ｌ ～ ２次营养液
（ 待 抽 苔 后 花 径 长 至 ３ ～ ５厘 米 ， 去 除顶部花序 ， 促 进 次
生花 序发 育 。
高 温 高 压灭 菌后 ， ４ ℃保 存 （ 固体 培 养 基 加 １ ３ ｇ琼 脂 ） 。
了 各步 骤 的 关 键 技 术 方 法 。
本 研 究 项 目主 要 是 利 用 已 构 建 的 胡 杨 基 因 组 Ｂ Ａ Ｃ 文 库， 以模 式 植 物 拟 南 芥 为 受 体 进 行 胡杨 大 片段 Ｄ Ｎ Ａ转 化 ． 构 建 拟 南芥 转 化子 库 ，筛 选 出性 状 显 著 改 变 的 转 基 因 植株 ． 研 究 转 基 因植 株 表 型及 代 谢 途 径 的 变 化 ． 确 定 引 起 性 状 改 变 的 基因背景， 分 析 性 状 相关 基 因 （ 簇） 及调 控 元 件 的 功 能 及 调 控 机理 ， 筛选出具有潜在 育种价值的基因（ 簇） 及调控元件 ， 为 林 木 基 因工 程提 供 理 论 基 础 和 基 因 资 源 。
拟南芥的花浸渍转化方案
拟南芥的花浸渍转化方案
拟南芥的花浸渍转化是利用其遗传特性实现不同的目的的一项技术。
通常来说，拟南芥的花浸渍转化方案分成三个步骤：1）花粉培养 2）植物体系建立 3）转基因表达系统构建。
首先，在进行拟南芥花浸渍转化方案时，花粉培养是必不可少的一个步骤。
在该步骤中，
一般利用磷酸三钠、核酸抗凝剂、复合氮肥和碳源构建适宜的花粉培养基，利用此基础培养拟
南芥花粉以便获得正常受精细胞。
其次，完成花粉培养和受精细胞形成后，将进行植物体系的建立。
在此步骤中，需要构筑
一个适宜的植物大培养体系，一般以磷酸铵、硝酸钾、硫酸钙和无机氮构建营养基，并加入2％的半乳糖等激素以利于受精细胞的胚胎发育，建立起适宜的植物体系。
最后，构建转基因表达系统，这是拟南芥花浸渍转化中最重要也是最复杂的一步。
常用的
基因载体可以分为普通的DNA质粒和Agrobacterium质粒载体，其中保护基因所需的抗生素
标记也不相同，它们分别是：对于普通的DNA质粒，采用Kanamycin标记；而对于Agrobacterium质粒载体，采用Bastinomycin标记。
在此步骤中，我们还需要将培养好的转
基因拟南芥细胞接种到拟南芥的植株上，以便获得转基因拟南芥以及转基因表达分析。
总之，拟南芥的花浸渍转化方案具有较强的通用性，可以用于实现拟南芥的转基因技术。
此外，拟南芥的花浸渍转化方案分为三个步骤：花粉培养，植物体系建立和转基因表达系统的
构建。
与传统的转基因技术相比，拟南芥的花浸渍转化方案具有更快的获得转基因拟南芥的速度，同时也具有更高的成功率，可以为科研活动提供更高的效率和更好的效果。
利用花序浸泡法将大片段胡杨基因转入拟南芥
利用花序浸泡法将大片段胡杨基因转入拟南芥
尚爱华;杨雪芹;杨凯年;石玉氏;李淑霞
【期刊名称】《现代农业》
【年(卷),期】2013(000)008
【摘要】本研究以拟南芥为研究材料,采用花絮浸泡法转化了400个农杆菌株系,对该转化体系进行了研究.结果表明,共120个农杆菌菌系转化成功,获得阳性转化子,转化体系中,应用YEP培养基培养农杆菌活化效果好,应用0.05％浓度的silwet L-77,浸染40s,浸染三次可提高转化效率.本研究摸索出更适合的转化体系,对于本项目具有重要的应用意义,时于未来以拟南芥为受体进行胡杨大片段DNA转化,构建拟南芥转化子库奠定研究基础.
【总页数】4页(P78-81)
【作者】尚爱华;杨雪芹;杨凯年;石玉氏;李淑霞
【作者单位】阿拉善盟额济纳旗林业工作站;阿拉善盟额济纳旗林业工作站;阿拉善盟额济纳旗林业工作站;阿拉善盟额济纳旗林业工作站;阿拉善盟额济纳旗林业工作站
【正文语种】中文
【相关文献】
1.胡杨大片段转化拟南芥植株表型分析
2.拟南芥菜LEAFY基因片段的分离及果树基因组中存在LEAFY同源基因的证据
3.胡杨大片段DNA转化拟南芥技术体系的优化
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采用花序浸染法将线性基因表达框导入拟南芥
采用花序浸染法将线性基因表达框导入拟南芥
花序浸染法是一种利用液相和气相来将线性基因表达框导入拟南芥的技术，它
可以为拟南芥株提供一种增强类似肿瘤抑制的功能。
在当今的技术发展趋势下，花序浸染法已经成为互联网研究人员里广受瞩目的一种技术。
首先，花序浸染法采用液相和气相来驱动线性基因表达框进行拟南芥株的传导。
这一技术的主要原理是，经由释放到浸溶液中的DNA，以及释放到气体盒中的射线，这些茎细胞会被移植到拟南芥株的体外侧根区，从而实现DNA的分布和传输。
相比其他技术，这一技术具有更加高效可控的精度。
其次，花序浸染法可以实现多重基因表达。
拟南芥株在浆果期和抽穗期间，可
以同时在不同穗轴内植入不同基因，进行同步表达多种基因。
在多重基因表达过程中，可以有效调节基因表达的功能和程度，从而提高拟南芥株的抗病性和抗逆性。
最后，花序浸染法可以为转基因植物的研究带来突破性的进展。
通过将多种转
基因基因注入拟南芥株，可以优化拟南芥的农FField病害抗性，加快转基因植物
的繁殖迭代速度，从而节省农业研究的时间和金钱，提高农作物的产量和品质。
借助花序浸染法，我们可以轻松地建立有效、精确、可控，且安全可靠的研究
体系，不仅可以有效改善拟南芥株的数据性，而且还可以创建转基因植物，为地球范围内的农业研究和多样性管理研究带来巨大的帮助。
拟南芥转化
拟南芥的遗传转化（花序浸泡法）
1.培养基
YEP培养基：蛋白胨10g/L 酵母提取物10g/L
NaCl 5g/L 固体琼脂粉15g/L
2.拟南芥材料
培养拟南芥直到它们开始抽苔并产生花序（为了让植株产生更多不成熟的花序，需要推迟转化实验，将抽出的第一个苔剪去，以便于莲花座上腋芽分化出的第二花序的增值）。
3.拟南芥的遗传转化
1)含有目的基因的双元载体转化农杆菌，并接种当菌斑到5ml含有
适当抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养2天。
2)再将这一培养基内注入500ml带有适当抗生素的YEP液体培养
基，并在28℃条件下培养16-24小时，使用生长达到稳定期的细胞（OD=1.0-1.6）
3)室温下4000rpm离心10分钟，收集农杆菌细胞，然后加入新制的
5%蔗糖，轻轻悬浮细胞，使OD =0.6-0.8
加入Silwet L-77至浓度0.05%，立刻混匀。
将农杆菌悬浮细胞转移到大的平皿中，用于侵染。
注：Silwet L-77可能有毒，腰带手套保护皮肤。
4)倾斜植株，使所有的花序都浸泡在农杆菌溶液中，浸泡时间1.5-2
分钟，取出后轻轻煽动10秒，控干3-5秒，将植株横放，暗处培养16小时，再恢复光照。
5)为了提高转化效率，可以浸泡植株两次，中间相隔7天。
6)分株收种子，并在含有合适抗生素的MS培养基上萌发，筛选得
到T1转基因拟南芥。
拟南芥培养及遗传转化
拟南芥待转化植株培养及遗传转化一实验目的：获得待转化拟南芥植株并进行花序浸润转化植株。
二实验材料：拟南芥种子（拟南芥的生态型最好是Col-0或者Ws-O，Nd-O，No-O），25cm3花盆，15ml离心管，10ml吸管，Agar，乙醇，次氯酸钠，利福平，Silwet L-77，营养液配方所需试剂，营养土，蛭石，塑料薄膜，托盘等。
三实验步骤：1 待转化植株培养⑴种子消毒：20μl种子装入1.5ml离心管内，加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 1%次氯酸钠，震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；均匀撒播于MS培养基平板上，注意每次洗脱用V ortxe充分混匀。
⑵春化作用：将MS培养基放到4℃冰箱中放置2天。
⑶将MS培养基放置在23 0 C/20 0 C光照培养箱16h/8h培养，在有3~5片成熟叶片后，移栽生长良好的拟南芥幼苗至用营养液浇灌过的营养土和蛭石（4:6）中生长，营养土和蛭石分装在25cm3的小培养皿中，保湿7天左右，湿度为60%~80%。
在生长期间适当浇灌营养液，按需要没3-4周一次（或者时间更长）。
⑷为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花序形成后剪去第一个花序，解除顶端优势，促使多个次生花序的同步出现。
当大多数花序约1~10cm高（剪主序后4~8d）时准备浸润。
表1 MS培养基注意事项：①溶化琼脂：用粗天平分别称取琼脂5.5g、蔗糖20 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入750 mL蒸馏水，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。
然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1000 mL，搅拌均匀。
②调节PH至5.7~5.8。
表2 营养液配方（无需调节PH）成分含量（mol/L）Ca(NO3)2·4H2O 1.01×10-3NH4H2PO4 1.30×10-4KNO3 5.10×10-3MgSO4·7H2O 4.98×10-4NaOH 3.13×10-5Fe-EDTA 2.24×10-5H3BO39.68×10-6Mncl2·4H2O 2.03×10-6CuSO4·5H2O 2.1×10-7MoO3 1.39×10-7Co（NO3）2·6H2O 8.59×10-8NH4NO3 2.93×10-52 农杆菌的培养取出保种的农杆菌菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接入10mL无菌LB液体培养基中（一般含75mg/ L利福平、100mg/ L链霉素和100mg/ L卡那霉素），28℃恒温下250r/ min 振摇过夜培养。
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花序浸染法转化拟南芥
1 种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。
营养土和蛭石1：1比例混合。
2 可以采取两种方法种植野生型拟南芥：一种是直接在大钵子里种八、九颗，小钵子里种四、五颗，等它稍微长大以后去掉长势不好的或者不能成活的，大钵子保留四颗，小钵子保留两颗，这种方法不用移栽；另一种是现在大钵子里种上几十颗（小钵子里相应的减少），等它们长成小苗后移栽（千万不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根），这种方法移栽比较麻烦，但是在移栽过程中能保证你要移栽的每一颗都是长势良好的拟南芥。
不管你采取哪种方法，在种下拟南芥后都需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。
注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。
总之盖膜时间自己灵活掌握。
3 转拟南芥一般用GV3101这个农杆菌，在你电转农杆菌，挑取阳性克隆检测后，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的LB，分装2管，摇8—10小时（时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊）待浑浊后再转移到500ml三角瓶（按1：100的比例装有200ml的LB）中大量摇菌8—10小时直到浑浊为止（有时候需要摇更长的时间才能浑浊）。
浑浊的标准是OD值为0.8，但是现在基本都不测OD值。
（在摇菌过程中所用的离心管和LB要灭菌，另外还要注意添加抗生素利福平，最好选用利福平和另外一种到两种抗生素以达到双抗或者三抗的效果，实际上双抗就可以了，理论上可以添加三种抗生素，一种是利福平，GV3101农杆菌本身就是抗利福平的；另一种是农杆菌自身所携带的协助Ti质粒载体上的基因所抗的抗生素；还有一种就是T-DNA区内基因所对应的抗生素），接下来就是离心富集农杆菌（用离心瓶或者是50ml的大离心管，这个时候离心瓶或者50ml大离心管可以灭菌也可以不灭菌），然后用100ml的5﹪的蔗糖悬浮，蔗糖溶液中加入20微升表明活性剂，也就是浓度0.02%（此时的蔗糖溶液就不用灭菌了，因为以后的侵染也不在超净工作台操作）。
要转的每个基因的每个载体都是先2ml少量摇菌，然后按1：100的比例200ml大量摇菌。
4 在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。
适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。
在用花序侵染法转拟南芥之前，先用剪刀剪去已经长成的角果（因为这些角果将来结的种子肯定是非转基因的，如果不剪掉的话会降低阳性率，本身阳性率已经很低了，再降低就更不爽了），把100ml的5﹪的蔗糖悬浮的菌液倒入大皿内，然后把拟南芥的花序浸入进去侵
染2分钟，侵染的过程要转动钵子，（侵染之前一晚上最好给钵子里浇些水，这样第二天侵染后钵子里的土就不容易掉出来），侵染后用滤纸擦干，侵染后的拟南芥要用黑色塑料袋或者薄膜覆盖，暗培养24小时。
侵染后悉心照料，保持水分充足。
由于拟南芥的盛花期较长，所以一般要侵染2—3次。
5 角果自然开裂后就可以收种子了。
此时收的种子是T1种子。
6 接下来就是筛拟南芥种子了，巴氏消毒液和灭过菌的ddH2O按1：1混合，在2ml离心管中灭菌就行，灭菌3次，总时间不要超过8分钟，用灭菌水洗5次。
然后用灭过菌的0.1％琼脂悬浮。
用拟南芥筛选培养基进行筛选，加千分之一的卡那（Kana 母液100mg/ml,300ul母液/500ml MS）和头孢（cef 母液1 00mg/ml, 500ul母液/500ml MS）（1L8克琼脂），加卡那是由于T—DNA标签上的NPTⅡ是卡那抗性的，起筛选作用；加头孢主要是抑菌作用。
由于T1种子的阳性率较低，所以筛选时每个皿要筛很多种子，这时候种子之间可以紧密靠近，但注意不要过分紧密。
有时候一个皿可以得到好几个阳性苗子，有时候一个都得不到，这个跟你转的基因以及转化效率有关。
筛选TI种子的皿放在光照培养室，待这批种子长出拟南芥幼苗后就可以观察出来筛选效果，阳性的长的比较绿，而且比阴性的长的高一点，阴性的长的发黄，而且长的比较矮。
T1阳性拟南芥幼苗至少20颗，挑选出阳性的拟南芥幼苗平铺于新的拟南芥筛选培养基让它长根，皿要立起来放。
7 待拟南芥幼苗的根长到一定长度后就可以进行移栽了，移栽的过程中要清洗掉根部所粘的培养基，因为根部粘有培养基的话容易长菌，还有就是移栽时防止伤根。
移栽完成后浇水并覆盖白色薄膜3—4天。
待角果开裂就可以收种子了，此时收的种子是T2种子，T2种子就已经开始出现分离比了，所以此时再进行筛选时每个皿里涂的种子就不宜过多了，种子之间不能靠的太近。
如果是单拷贝的，则会出现3：1的分离比，如果是双拷贝的，则会出现15：1的分离比，依次类推。
听他们说转拟南芥单拷贝出现的几率比转棉花要高。
T2拟南芥幼苗挑15—20颗。
以单拷贝为例，即使是阳性的，也会出现AA和Aa两种情况，所以T2幼苗继续按上述方法让它长根，移栽，收种子，此时收的种子就是T3种子，继续筛选，如果T3不分离的话，那么证明是T2是AA；如果出现3：1分离比的话，那么T2是Aa。
不出现分离的T2及T3种子就是纯系了，把它们种下去长出的拟南芥就可以进行基因功能验证了。
最终要保证转基因纯系在10个以上。