第七章核酸分子杂交技术与核酸序列测定
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分子诊断学之核酸分子杂交技术-医学检验
» 核酸分子杂交（nucleic acid hybridization）
是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未 知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合 ，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置 或大小显示出来。
» 探针( probe )
带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。 Institute of Genetic Engineering
分子克隆基本过程：
切 转
分 切 接
筛
Institute of Genetic Engineering
Institute of Genetic Engineering
分子诊断学
核酸分子杂交技术
Nucleic Acid Hybridization Technology
Institute of Genetic Engineering
Institute of Genetic Engineering
影响复性速度的因素：
DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度
Institute of Genetic Engin1e7ering
二、核酸分子杂交的技术原理
在DNA复性过程中，如果把不同 DNA单链分子放在同一溶液中， 或把DNA与RNA放在一起，只要 在DNA或RNA的单链分子之间有 一定的碱基配对关系，就可以在 不同的分子之间形成杂化双链 (heteroduplex) 。
检测对象: 克隆化的基因组DNA，细胞总DNA、总RNA
。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细 胞内杂交, 即细胞原位杂交。
核酸分子杂交特点：高度的灵敏性、特异性
应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特
第七章 分子杂交
•第一节 核酸分子杂交的基本原理 第一节 •第二节 核酸探针 第二节 •第三节 •第三节 核酸分子杂交技术
第一节 核酸分子杂交的基本原理
DNA和DNA链、RNA与DNA链或两条 和 链或两条RNA链之间， 链之间， 链 与 链或两条 链之间 只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂 常用已知的DNA或 RNA的片段作为探针 ， 包括 的片段作为探针， 交 。 常用已知的 或 的片段作为探针 特异的DNA序列，或转录的 序列， 序列或cDNA序列， 序列， 特异的 序列 或转录的RNA序列或 序列或 序列 或人工合成的寡核苷酸片段。 或人工合成的寡核苷酸片段。 根据支持物的不同，分为固相杂交和液相杂交。 根据支持物的不同，分为固相杂交和液相杂交。 固相杂交又包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两种。 固相杂交又包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两种。 膜上印迹杂交即将核酸从细胞中分离纯化后， 膜上印迹杂交即将核酸从细胞中分离纯化后，在体外 与探针杂交，细胞原位杂交是在细胞内进行的杂交。 与探针杂交，细胞原位杂交是在细胞内进行的杂交。
Байду номын сангаас
㈢ RNA探针 探针 RNA探针有下述优点： 探针有下述优点： 探针有下述优点 杂交体的稳定性高，杂交反应条件严格， ①杂交体的稳定性高，杂交反应条件严格，特异性更 高。 单链不存在双链DNA探针的互补双链的复性 ， 探针的互补双链的复性， ② RNA单链不存在双链 单链不存在双链 探针的互补双链的复性 杂交效率较高。 杂交效率较高。 无高度重复序列， ③RNA无高度重复序列，非特异杂交少。 无高度重复序列 非特异杂交少。 杂交后用RNase消化未杂交的 消化未杂交的RNA探针，可降低杂 探针， ④杂交后用 消化未杂交的 探针 交本底。 交本底。
第七章 真菌的分子生物学鉴定方法
RAPD是一种比较精细的分子标记技术，单个碱基的改 变有可能对扩增片断的多态性产生明显的影响。
国内有人利用RAPD对白色念珠菌、淋球菌、水稻白叶 枯病菌进行分型取得了很好的结果。 黄勃等人利用 RAPD 技术对拟青霉属菌株进行分类鉴定时，发现
RAPD 指纹图谱在拟青霉属不同种间具有明显的种的
特异性，可以区别所有形态近似的种类，但对比RAPD
（二）真菌线粒体DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析 限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP），将目标DNA序列经一定数目和种类的限 制性内切酶(RE)进行酶切,由于不同生物体的基因组DNA在限制性 内切酶的酶切位点的遗传信息有差异, 限制性内切酶在其上的识别
例——捕食线虫真菌的分类发展
粘球和 非收缩环
节丛孢
收缩环
单顶孢
菌网
隔指孢
粘性分枝
分子生物学鉴定方法包括DNA碱基组成 (G+C)mol%、限制性片段长度多态性（RFLP）、 随机扩增多态性 (RAPD) 、Southerm印迹分析 脉冲电场凝胶电泳（PFGE）以及小亚基rDNA(或 rRNA)序列测定等。 过去依赖形态和生理生化等表型特征描述逐 渐引入分子生物学鉴定方法，按其亲缘关系和 客观的反映系统发育的规律对真菌进行自然分 类，达到人们追求已久的自然分类目的，无疑 是分类学发展过鉴定等的很好的分子 标记，已经被成功地用于动物、植物、人和微生物的遗 传多样性检测、基因定位、品系鉴定、医学诊断、遗传 图谱构建和系统学研究等。 在分析生物间系统发育关系、分析突变以及亲缘关系鉴 定等方面显示出卓越的功能,一些表型上不能反映的遗传 物质的细微变化都可以通过RAPD技术显示出来。
核酸分子杂交技术 ppt课件
ppt课件
15
一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针
基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
ppt课件
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(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
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(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
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二、核酸分子杂交的基本原理
根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。
医学分子生物学 7 分子生物学常用技术
5′
3′
*********G —OH
*********C T T A A — P
3′
5′
5′
3′
P A A T T C*********
OH— G*********
3′ 5′
EcoR I: dATP+ [α-32P]-dTTP
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根据反应原理确定同位素反应底物名称
• DNA的切口平移标记法 • 随机引物标记法 • DNA的3′末端标记
• 极高的特异性
缺点 半寿期短, 故要随用随标 放射性污染
9
1. DNA探针放射性标记方法
(1) 切口平移标记法 (2) 随机引物标记法 (3) PCR标记法 (4) 5′-末端标记 (5) 3′-末端标记
10
(1) DNA的切口平移标记法
5′
3 ′ 双链DNA
3′
5′
DNase I，Mg2+
② 反应产物的长度与加入的寡核苷酸引物的量呈反比。
当需要较长片段探针，可适当减少随机引物的加入量。
③ 所得到的标记产物为新合成的DNA单链。当采用单链
DNA片段或RNA作为模板时，必须注意得到的标记探针并 不是其本身.
④ 反应条件要控制在pH值6.6，抑制Klenow DNA聚合酶
的3′－5′外切酶的活性。
第七章 分子生物学常用技术
1
第一节 核酸分子杂交
2
*核酸分子杂交：
具有一定互补序列的不同来源的核苷酸单 链在一定条件下按照碱基配对的原则形成
杂交双链的过程。
实质: 核酸分子的变性与复性过程
变性：将双链DNA分子解聚成为单链的过程 复性：使单链聚合成双链的过程，又称为退火. 特点：高度特异性和灵敏性 杂交的双方: （靶,target） --待测序列
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操 作中形成的喷雾、 试剂及任何与扩增产物接触的东 西。
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术 高俊燕
博 奥 生 物 集 团 有 限 公 司 生物芯片北京国家工程研究中心 北京博奥晶典生物技术有限公司
目录 核酸分子杂交的基本理论 核酸探针及其标记 核酸探针的标记方法 核酸分子杂交方法
DNA芯片技术
2
目 录
part 1
3
核酸分子杂交的基本理论
核酸分子杂交
具有互补序列的两条单链核酸 (DNA或RNA)分子在适宜的温度及离 子强度等条件下, 可按碱基互补配对原则退火形成双链杂合体的过程称 为核酸分子杂交。 核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的 技术之一，也是临床分子检验的重要技术。 核酸分子杂交技术是 20 世纪 70 年代发展起来的一种崭新的分子生物 学技术。它是基于 DNA分子碱基互补配对原理，用特异性的核酸探针 与待测样品的DNA/RNA形成杂交分子的过程。分子杂交实验依据其形 式的不同可以分为液相杂交和固相杂交，各类型杂交的基本原理和步骤 是基本相同的，只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。
3、影响复性的因素 1） DNA浓度 DNA浓度越大复性速度越快 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.1-0.5μ g，浓度过高影响杂交效率 2）DNA的分子质量 大分子质量的DNA扩散速度慢，复性速度慢
10
核酸分子杂交的基本理论
3）温度 温度过高，有利于DNA变性而不利于复性
4
核酸分子杂交的基本理论
关键步骤：
变性—杂交（复性）—检测信号—结论
变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
信号的采集与处理
结论
5
核酸分子杂交的基本理论
DNA变性
1、定义：在某些理化因素作用下，两条DNA链间的氢键断裂，变为单 链的过程称DNA变性。 2、变性的方法： 1 ）热变性：温度升高到 90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全 断裂。 2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。 3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢 键断裂
博 奥 生 物 集 团 有 限 公 司 生物芯片北京国家工程研究中心 北京博奥晶典生物技术有限公司
目录 核酸分子杂交的基本理论 核酸探针及其标记 核酸探针的标记方法 核酸分子杂交方法
DNA芯片技术
2
目 录
part 1
3
核酸分子杂交的基本理论
核酸分子杂交
具有互补序列的两条单链核酸 (DNA或RNA)分子在适宜的温度及离 子强度等条件下, 可按碱基互补配对原则退火形成双链杂合体的过程称 为核酸分子杂交。 核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的 技术之一，也是临床分子检验的重要技术。 核酸分子杂交技术是 20 世纪 70 年代发展起来的一种崭新的分子生物 学技术。它是基于 DNA分子碱基互补配对原理，用特异性的核酸探针 与待测样品的DNA/RNA形成杂交分子的过程。分子杂交实验依据其形 式的不同可以分为液相杂交和固相杂交，各类型杂交的基本原理和步骤 是基本相同的，只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。
3、影响复性的因素 1） DNA浓度 DNA浓度越大复性速度越快 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.1-0.5μ g，浓度过高影响杂交效率 2）DNA的分子质量 大分子质量的DNA扩散速度慢，复性速度慢
10
核酸分子杂交的基本理论
3）温度 温度过高，有利于DNA变性而不利于复性
4
核酸分子杂交的基本理论
关键步骤：
变性—杂交（复性）—检测信号—结论
变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
信号的采集与处理
结论
5
核酸分子杂交的基本理论
DNA变性
1、定义：在某些理化因素作用下，两条DNA链间的氢键断裂，变为单 链的过程称DNA变性。 2、变性的方法： 1 ）热变性：温度升高到 90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全 断裂。 2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。 3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢 键断裂
核酸的分子杂交
Home
3 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。
3.1 标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。
有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。
Home
应 用：
检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。
2 核酸探针的制备
2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
202X
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第五节 核酸的分子杂交 Nucleic Acid Hybridization
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前 言
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02
前 言
Home
核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
2.2 探针的制备方法
01
02
03
PCR扩增
DNA重组技术
化学合成
长度一般以50~300bp为宜。制备方法：
2.3 探针的分类 据来源及性质不同可分为： 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
2.4 合成寡核苷酸探针注意原则
3 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。
3.1 标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。
有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。
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应 用：
检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。
2 核酸探针的制备
2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
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第五节 核酸的分子杂交 Nucleic Acid Hybridization
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核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
2.2 探针的制备方法
01
02
03
PCR扩增
DNA重组技术
化学合成
长度一般以50~300bp为宜。制备方法：
2.3 探针的分类 据来源及性质不同可分为： 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
2.4 合成寡核苷酸探针注意原则
分子生物学课件-基因操作7节节核酸杂交revised
2、尼龙膜：
对单链和双链DNA及RNA的结合能力达到 350-500μg/cm2。对小分子量的核酸片段也有 较强的结合能力。不一定通过真空干烤，只需短 时间紫外线照射，核酸中的部分嘧啶碱即可与膜 上带正电荷的氨基相互交联，从而使结合更加牢 固。
优点 吸附力强（共价结合）、机械性能好（不易破 碎、可重复使用）。
第七节 核酸分子杂交
（molecular hybridization)
特点： 灵敏度高（<1pg互补序列） 速度快（<24h） 简单易行 应用： 基因克隆的筛选 酶切图谱制作 基因组中特定基因序列的定量和定性检测 基因突变分析 疾病的诊断、微生物病原体检测
核酸分子杂交
用标记的已知DNA或RNA片段（探针） 来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸 间碱基互补的原则发生异源性结合，再经 显影或显色的方法，将结合核酸序列的位 置或大小显示出来。
Northern 杂交
原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离后， 转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经过杂交， 分析mRNA的大小及含量。
应用：半定量分析mRNA的含量；确定mRNA分 子的大小。
方法：提取组织细胞总RNA→RNA定量→变性 胶电泳→转膜→干膜→预杂交→杂交→洗 膜→压片→洗片→图像分析
⑤ 离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸 分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥 力，有利于复性。离子强度过高则不利于复性。
3、杂交
来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互 补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂 交。
杂交可分成：DNA与DNA、RNA与RNA、 DNA与RNA之间的杂交。
❖ Northern印迹杂交 (Northern blot hybridization)
分子诊断学
研究对象
Artwork from /
Old Way
New Way
Patient’s tissue sample
Proteomics
Proteins
Pathology
Mass Spectrometry Proteomic image
Genomics Patient’s tissue sample or blood sample
DNA Gene chip Microarray image
Edited from the artwork by Jeanne kelly © 2002 Donna Kerrigan, M.S. Jeanne Kelly, Brian Hollen. Understanding Cancer and Related Topics Understanding Molecular
ISH（In-situ Hybridization，原位杂交） 3、测序技术 4、芯片技术
Microarrays（微阵列） Tissue Arrays（组织芯片） 5、质谱技术（Mass Spectroscopy）
核酸等温控制技术在呼吸道病 原菌检测中的应用
艾滋病的核酸检测与分析
动脉粥样硬化性重要疾病： 冠心病基因组研究进展
& The Association for Molecular Pathology
美国研究病理学会和分子病理学协会
中山大学
2002
Molecular diagnostics: a training and study guide Gregory J. Tsongalis William B. Coleman
第十五章 分子诊断的其它应用
第八章 蛋白质组学研究技术 第十六章 生物信息学在分子诊断中的应用
常用的分子生物学基本技术核酸分子杂交技术
常用的分子生物学基本技术核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。
其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。
杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。
核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。
根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。
固相杂交固相杂交（solid-phasehybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。
斑步杂交（dot hybridization）是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。
该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。
该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。
印迹杂交（blotting hybridization）Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。
可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。
Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。
《核酸分子杂交》课件
实验步骤
1
样品制备
获得需要研究的核酸样品并进行提取和
合成探针和标记物
2
纯化。
设计和合成与目标核酸互补的DNA或
RNA探针，并标记探针以便检测。
3
杂交反应
将待测核酸样品与探针和标记物进行杂
杂交产物的检测和分析
4
交反应，使它们结合形成杂交分子。
通过不同的检测方法对杂交产物进行分 析和表征，如凝胶电泳、放射性测量等。
核酸杂交的种类
DNA-DNA杂交
两段DNA互相结合形成双链 DNA。
RNA-DNA杂交
RNA和DNA互相结合形成 RNA-DNA杂交分子。
RNA-RNA杂交
两段RNA分子互相结合形成 双链RNA。
应用
检测病原微生物、基因 突变、肿瘤等
核酸分子杂交可用于诊断病 原微生物感染、检测基因突 变和肿瘤相关标记物。
《核酸分子杂交》PPT课 件
核酸分子杂交是指不同DNA或RNA进行结合形成杂交分子的过程。它在分析 核酸序列的同源性和差异性、检测特定序列的核酸以及研究DNA和RNA的结 构、功能和互动关系方面非常重要。
定义
核酸分子杂交是指来自不同DNA或RNA的单链或双链核酸互相结合形成杂交 分子的过程。
重要性
研究基因表达、基因调 控等
通过核酸分子杂交，我们可 以研究基因的表达模式和调 控机制。
设计新型药物和检测方 法
利用核酸分子杂交技术，可 以设计基于核酸的新型药物 和高灵DNA和RNA的结
性和差异性
核酸
构、功能和互动关系
核酸分子杂交可用于比较 DNA或RNA序列，帮助我 们了解核酸之间的相似性 和差异性。
通过配对互补的探针和标 记物，核酸分子杂交可用 于检测具有特定序列的核 酸分子。
第七章 核酸分子杂交技术与核酸序列测定ppt课件
链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放 在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间 有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分 子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
整理版课件
6
复性
RNA
DNA
整理版课件
7
1. 原理
DNA的变性与复性
2. 常见条件：加热
S形曲线
解链温度（Tm）
A260增高的原因
3. 分子杂交的目的
整理版课件
8
应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在
亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
整理版课件
Home
9
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
整理版课件
10
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱
➢ 增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。
生物信息学(bioinformation) 是一门伴随着基因组研究 而产生的交叉学科。广义地说，它是从事与基因组研究有关 的生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和解释的一门 学科。这个定义包含两层意思，即对海量数据的收集、整理 以及对这些数据的应用。
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54
核酸序列分析的基本原理
化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染 色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原” 免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤 膜上的蛋白质。用于蛋白质定性定量及相互
作用研究。
常用Ab来检测蛋白质，也被称为免疫 印迹技术 。
靠电转移将蛋白质从凝胶转移到膜上。
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6
复性
RNA
DNA
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7
1. 原理
DNA的变性与复性
2. 常见条件：加热
S形曲线
解链温度（Tm）
A260增高的原因
3. 分子杂交的目的
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8
应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在
亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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9
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
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10
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱
➢ 增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。
生物信息学(bioinformation) 是一门伴随着基因组研究 而产生的交叉学科。广义地说，它是从事与基因组研究有关 的生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和解释的一门 学科。这个定义包含两层意思，即对海量数据的收集、整理 以及对这些数据的应用。
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54
核酸序列分析的基本原理
化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染 色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原” 免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤 膜上的蛋白质。用于蛋白质定性定量及相互
作用研究。
常用Ab来检测蛋白质，也被称为免疫 印迹技术 。
靠电转移将蛋白质从凝胶转移到膜上。
核酸分子杂交技术
8
Southern印迹杂交 1）Southern印迹杂交
DNA检测 －DNA检测
将混合DNA样品经凝胶电泳分离， 将混合DNA样品经凝胶电泳分离， DNA样品经凝胶电泳分离 被分离的DNA片段从凝胶转移到膜上， 被分离的DNA片段从凝胶转移到膜上， DNA片段从凝胶转移到膜上 经标记的探针杂交，从而检测特定DNA 经标记的探针杂交，从而检测特定DNA 片段。 片段。
分子杂交图
3
一 核酸分子杂交技术原理
用标记的已知DNA或 RNA片段 （ 探针 ） 来检测样品中 或 片段（ 用标记的已知 片段 探针） 未知核酸序列（ 形成异源双螺旋） 未知核酸序列 （ 形成异源双螺旋 ） ， 再经显影或显色的方 法，将结合核苷酸序列的位置或大小显示出来。 将结合核苷酸序列的位置或大小显示出来。
13
3） Western印迹 （Western blot） Western印迹 blot）
• 又称免疫印迹（immunoblotting），常用的蛋白质检测 又称免疫印迹（immunoblotting） 免疫印迹 技术。将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白区带转到膜上， 技术。将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白区带转到膜上， 通过免疫反应，检测能与可以抗体结合的蛋白质。 通过免疫反应，检测能与可以抗体结合的蛋白质。 • 操作程序： 操作程序： 蛋白质样品制备→SDS-PAGE分离→ 蛋白质样品制备→SDS-PAGE分离→蛋白质的电转移 分离 （印迹）→靶蛋白与抗体（一抗与二抗）的结合→显色、 印迹） 靶蛋白与抗体（一抗与二抗）的结合→显色、 分析。 分析。
1
复性
复性：变性DNA分开的两股链在适当 复性：变性 分开的两股链在适当 条件下重新生成双链结构的过程
退火（ 热变性的DNA经 退火 （ annealing） :热变性的 ） 热变性的 经 缓慢冷却复性的过程。 缓慢冷却复性的过程。
Southern印迹杂交 1）Southern印迹杂交
DNA检测 －DNA检测
将混合DNA样品经凝胶电泳分离， 将混合DNA样品经凝胶电泳分离， DNA样品经凝胶电泳分离 被分离的DNA片段从凝胶转移到膜上， 被分离的DNA片段从凝胶转移到膜上， DNA片段从凝胶转移到膜上 经标记的探针杂交，从而检测特定DNA 经标记的探针杂交，从而检测特定DNA 片段。 片段。
分子杂交图
3
一 核酸分子杂交技术原理
用标记的已知DNA或 RNA片段 （ 探针 ） 来检测样品中 或 片段（ 用标记的已知 片段 探针） 未知核酸序列（ 形成异源双螺旋） 未知核酸序列 （ 形成异源双螺旋 ） ， 再经显影或显色的方 法，将结合核苷酸序列的位置或大小显示出来。 将结合核苷酸序列的位置或大小显示出来。
13
3） Western印迹 （Western blot） Western印迹 blot）
• 又称免疫印迹（immunoblotting），常用的蛋白质检测 又称免疫印迹（immunoblotting） 免疫印迹 技术。将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白区带转到膜上， 技术。将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白区带转到膜上， 通过免疫反应，检测能与可以抗体结合的蛋白质。 通过免疫反应，检测能与可以抗体结合的蛋白质。 • 操作程序： 操作程序： 蛋白质样品制备→SDS-PAGE分离→ 蛋白质样品制备→SDS-PAGE分离→蛋白质的电转移 分离 （印迹）→靶蛋白与抗体（一抗与二抗）的结合→显色、 印迹） 靶蛋白与抗体（一抗与二抗）的结合→显色、 分析。 分析。
1
复性
复性：变性DNA分开的两股链在适当 复性：变性 分开的两股链在适当 条件下重新生成双链结构的过程
退火（ 热变性的DNA经 退火 （ annealing） :热变性的 ） 热变性的 经 缓慢冷却复性的过程。 缓慢冷却复性的过程。
核酸分子杂交的方法及其在医学检验中的应用
核酸分子杂交的方法及其在医学检验中的应用核酸分子杂交技术及其在医学检验中的应用核酸分子杂交技术是一种技术，可以用来检测和识别特定的基因，查明个体与被研究物之间的关系。
在过去的几十年里，它已经被广泛应用于疾病诊断、环境检测和发现新基因等领域，基本上都要求快速、灵敏和特异性的检测结果，以及定性和定量的研究结果，而这一切都可以通过核酸分子杂交技术来实现。
本文综述其基本原理、步骤、优缺点以及在医学检验中的应用。
一、核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交技术(in situ hybridization, ISH)是一种用来识别和检测特定的基因序列的分子生物学技术，通常用于染色体分析，可以发现特定基因所在的细胞和组织。
它是根据两种相互作用的核酸分子之间结合的原理工作，即“杂交”。
在杂交反应中，一条条的核酸分子（DNA或RNA）互相结合，形成特定的结构，从而在某些非常特异的情况下进行识别。
另外，通过应用适当的荧光技术，可以直观地观察和显示杂交反应。
二、核酸分子杂交技术的步骤核酸分子杂交技术包括以下几个步骤：（1）样本准备。
样本准备是研究时的第一步，在这一步骤中研究者根据自己的研究需求，选择合适的样本。
（2）核酸分离。
在核酸分离步骤中，由于核酸是微小的，因此需要采用特殊的技术来从样本中分离出核酸，而这些技术通常是PCR，即聚合酶链反应，用于提高核酸的灵敏度。
（3）核酸杂交。
在核酸杂交的步骤中，首先，将抗体结合到探针中，然后将探针与样本中的核酸结合起来，形成双螺旋构型，从而实现特异性识别。
（4）信号分析。
在信号分析步骤中，需要对样本中的核酸进行鉴定，以及检测所测试的核酸是否核苷酸序列正确的特定目的。
最常见的技术是利用基因组芯片，通过它们可以对大量的基因进行组合扩增，从而识别、分析和检测出特定基因。
三、核酸分子杂交技术的优缺点（1）优点核酸分子杂交技术有很多优点，如：（1）操作简单，容易实现自动化，可以提高生产效率；（2）能够检测出对特定基因的非常特异性的序列；（3）可以测定大量基因，使得研究者可以更容易地进行基因组学研究；（4）技术可以检测出胞内和蛋白质的体外表达；（5）核酸分子杂交技术的发展使得药物研发有了新的思路和突破，可以更加准确高效地展开新药的研发。
分子生物技术—核酸分子杂交技术
一、核酸分子杂交基本原理
(二) 核酸分子杂交基本原理
• 根据核酸变性和复性的原理,不同来源的DNA 变性后,若这些异源DNA之间存在某些相同序 列的区域,在退火条件下则可形成DNA-DNA 异源双链;或将变性的单链DNA与RNA经复 性处理可以形成DNA-RNA杂合双链。这种 不同来源的单链核酸分子在合适的条件下,通 过碱基互补形成双链杂交体的过程称为核酸分 子杂交
三、核酸分子杂交相关技术
（一）传统核酸分子杂交技术
2.Northern杂交
• 对RNA的检测也可以利用与DNA检测 相同的印迹技术来分析。与 Southern 印迹杂交的方法类似,只是变性剂不同
• Southern杂交中使用的使DNA变性的 试剂为NaOH。因为NaOH会水解 RNA的2-羟基基团,所以Northern杂 交中使RNA変性的试剂为甲基氧化汞 、乙二醛或甲醛
• 斑点杂交和狭缝杂交都是将被检标本 点到膜上烘烤固定。不需电泳和转膜 过程,整个操作过程简便、快速
• 缺点是无法判断核酸片段的大小,也无 法判断样品溶液中是否存在着不同的 靶序列,多用作核酸定性或半定量分析 而且便于杂交条件的摸索
三、核酸分子杂交相关技术
（二）核酸原位杂交
• 原位杂交是将核酸分子杂交技术与组 织细胞化学和免疫组织化学结合起来 的一种杂交方法,其基本原理及探针的 标记方法与传统核酸分子杂交技术相 同
三、核酸分子杂交相关技术
（一）传统核酸分子杂交技术
3. 斑点杂交与狭缝杂交
• 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸 纤维素膜或尼龙膜上,再采用特定的探 针进行杂交这种方法称为点杂交
• 若采用狭缝点样器加样后杂交,则称为 狭缝杂交
• 斑点杂交与狭缝杂交的区别是点样形 状的不同
《核酸分子杂交技术》课件
核酸分子杂交原理
互补配对
核酸分子通过互补配对原理相 结合，碱基之间形成稳定的氢 键。
熔解
通过改变温度，使两条核酸分 子解开，断裂氢键，分离出单 链。
探针结合
利用互补配对原理，核酸探针 与目标核酸结合，形成稳定的 双链结构。
核酸探针的制备
1
设计探针序列
根据目标核酸序列设计探针，考虑碱基
合成探针
2
互补性和特异性。
《核酸分子杂交技术》 PPT课件
核酸分子杂交技术是一种重要的实验技术，能够研究DNA和RNA的结构、功 能以及相互作用。让我们一起探索这门神奇的科学吧！
什么是核酸分子杂交技术
1 定义
核酸分子杂交技术是指通过核酸探针与目标 核酸的互补碱基配对作用实现的一种检测、 分离和研究方法。
2 原理
该技术利用核酸分子的碱基互补性特点，使 探针与目标核酸发生相互结合，从而实现目 标分子的检测和定位。
利用合成技术合成目标序列的核酸探针。
3
标记探针
通过化学反应或酶标记等方法，将探针 标记上荧光剂或放射性示踪剂。
应用领域
遗传研究
核酸分子杂交技术在遗传研究中 起到了至关重要的作用，帮助人 们了解遗传信息的传递和变异。
医学诊断
通过核酸分子杂交技术，可以检 测病原体和基因突变，用于疾病 的早期诊断和治疗。
法医分析
核酸分子杂交技术用于法医学领 域的DNA鉴定和犯罪现场的分析， 提供了重要的法律证据。
核酸分子杂交技术的优势
1 高度特异性
通过合理设计探针序列， 核酸分子杂交技术能够高 度特异地检测目标核酸。
2 灵敏度高
核酸分子杂交技的特点。
3 广泛应用
核酸分子杂交技术在基础 研究、生物医学、农业科 技等领域均有广泛应用。
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最基本的原则是核酸探针与要检测的核酸之 间在核酸序列上要有高度的特异性
基因组DNA探针
• 真核生物基因组中存在大量的重复序列和 非编码序列，因此选择基因组DNA做探针 时，一定要充分考虑实验目的性
• 利用分子克隆或PCR方法可以获得某一段 特定的DNA序列
cDNA探针
• cDNA是能与mRNA互补的DNA分子，它是 利用RNA分子作模板在逆转录酶作用下产 生的。
复性
RNA
DNA
1. 原理 DNA的变性与复性
2. 常见条件：加热 S形曲线 解链温度（Tm） A260增高的原因
3. 分子杂交的目的
应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在
亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
• 化学法P48：利用标记物分子上的活性基团与探 针分子上的基团发生的化学反应直接将标记物结 合到探针分子上。特点是简单、快速、均匀。
• 酶法P48：将标记物预先标记在核苷酸分子上， 然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子渗入到探 针分子上去，或将核苷酸分子上的标记基团交换 到探针分子上。
一个理想的标记物应满足：
(1)标记前后探针基本结构、化学性质相同; (2)特异性强、本底低、重复性好； (3)操作简单、节时； (4)安全、无环境污染。
常用探针的标记方法
3.2.1 缺口平移法 3.2.2 随机引物标记法 3.2.3 末端标记法 3.2.4 生物素光照标记法
缺口平移法的原理
• 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的5`→3`的聚合酶活性和5` →3`的外切酶活性相结合。
第二节 核酸探针技术及其标记
探针 (probe) P46 经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，
能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检 测核酸样品中的特定基因。
一、核酸探针的种类和应用
根据核酸性质和检测目的不同可以分为： （一）基因组DNA探针 （二）cDNA探针 （三）RNA探针 （四）人工合成的寡核苷酸探针
第七章 核酸分子杂交技术与核酸
序列测定
Molecular Hybridization and Blotting Technology
Content of Table
前言 1 核酸分子杂交技术的原理 2 核酸探针的制备 3 核酸探针的标记 4 核酸分子杂交技术
前言
核酸分子杂交
把亲源关系较近的，不同生物个体来源的 变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA 或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
在适当条件下，变性DNA的两条互补链 可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火(ann酸分子杂交的应用
研究DNA分子中某一种基因的位置 鉴定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础
• 首先用E.coli的DNAse I 在探针DNA双链上造成缺口， 然后再借助于DNA pol I的5`→3`外切酶活性，切去带有5`磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物 素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。
• 这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链 上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的 DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。
随机引物标记法原理
用一些六核苷酸作为随机引物，将这些 引物和探针DNA片段一起热变性，退火后， 引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的 作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新 的标记的探针片段。
• 利用DNA合成仪，采用化学方法人工合成 寡核苷酸探针
设计寡核苷酸探针的原则
• 1）序列及长度 根据靶分子的序列而定， 长度一般为18-50个核苷酸合适。
• 2）碱基成分 一般G+C含量为40%-60% • 3）探针分子内不存在互补，避免出现“发
夹”结构 • 4）避免单一碱基的重复出现，不超过4个 • 5）与非靶标区域的同源性不超过70%
二、探针的标记
• 探针标记方法: 放射性和非放射性两种
放射性核素： 32P、35S和3H 非放射性标记物： 1）半抗原：生物素、地高辛素 抗原-抗体反应 2）配体：生物素-亲和素反应 3）荧光素 (FITC、罗丹明) 4）化学发光探针
探针标记方法
• 核酸分子杂交所用的探针几乎都用体外标记法标 记，分为化学法和酶法
第一节 核酸分子杂交的
基本原理
一、分子杂交与印迹技术的原理P44
（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单
链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放 在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间 有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分 子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
• 利用基因克隆的方法可获得cDNA • 优点：cDNA探针不含有内含子序列，尤其
适用于基因表达的检测。
RNA探针
• RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交 反应效率极高
• 早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和 病毒RNA探针。利用mRNA与基因的 DNA 杂交，可以反映出基因的转录状态。
人工合成的寡核苷酸探针
➢ Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成， 在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的 50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解 温 度 (melting temperature, Tm) 。 其 大 小 与 G+C含量成正比。
DNA的复性与分子杂交
DNA复性(renaturation)的定义
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱 ➢ 增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。
热变性
➢解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以
温 度 对 A260 （ absorbance ， A ， A260 代 表 溶 液 在 260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解 链曲线。
基因组DNA探针
• 真核生物基因组中存在大量的重复序列和 非编码序列，因此选择基因组DNA做探针 时，一定要充分考虑实验目的性
• 利用分子克隆或PCR方法可以获得某一段 特定的DNA序列
cDNA探针
• cDNA是能与mRNA互补的DNA分子，它是 利用RNA分子作模板在逆转录酶作用下产 生的。
复性
RNA
DNA
1. 原理 DNA的变性与复性
2. 常见条件：加热 S形曲线 解链温度（Tm） A260增高的原因
3. 分子杂交的目的
应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在
亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
Home
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
• 化学法P48：利用标记物分子上的活性基团与探 针分子上的基团发生的化学反应直接将标记物结 合到探针分子上。特点是简单、快速、均匀。
• 酶法P48：将标记物预先标记在核苷酸分子上， 然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子渗入到探 针分子上去，或将核苷酸分子上的标记基团交换 到探针分子上。
一个理想的标记物应满足：
(1)标记前后探针基本结构、化学性质相同; (2)特异性强、本底低、重复性好； (3)操作简单、节时； (4)安全、无环境污染。
常用探针的标记方法
3.2.1 缺口平移法 3.2.2 随机引物标记法 3.2.3 末端标记法 3.2.4 生物素光照标记法
缺口平移法的原理
• 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的5`→3`的聚合酶活性和5` →3`的外切酶活性相结合。
第二节 核酸探针技术及其标记
探针 (probe) P46 经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，
能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检 测核酸样品中的特定基因。
一、核酸探针的种类和应用
根据核酸性质和检测目的不同可以分为： （一）基因组DNA探针 （二）cDNA探针 （三）RNA探针 （四）人工合成的寡核苷酸探针
第七章 核酸分子杂交技术与核酸
序列测定
Molecular Hybridization and Blotting Technology
Content of Table
前言 1 核酸分子杂交技术的原理 2 核酸探针的制备 3 核酸探针的标记 4 核酸分子杂交技术
前言
核酸分子杂交
把亲源关系较近的，不同生物个体来源的 变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA 或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
在适当条件下，变性DNA的两条互补链 可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火(ann酸分子杂交的应用
研究DNA分子中某一种基因的位置 鉴定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础
• 首先用E.coli的DNAse I 在探针DNA双链上造成缺口， 然后再借助于DNA pol I的5`→3`外切酶活性，切去带有5`磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物 素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。
• 这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链 上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的 DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。
随机引物标记法原理
用一些六核苷酸作为随机引物，将这些 引物和探针DNA片段一起热变性，退火后， 引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的 作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新 的标记的探针片段。
• 利用DNA合成仪，采用化学方法人工合成 寡核苷酸探针
设计寡核苷酸探针的原则
• 1）序列及长度 根据靶分子的序列而定， 长度一般为18-50个核苷酸合适。
• 2）碱基成分 一般G+C含量为40%-60% • 3）探针分子内不存在互补，避免出现“发
夹”结构 • 4）避免单一碱基的重复出现，不超过4个 • 5）与非靶标区域的同源性不超过70%
二、探针的标记
• 探针标记方法: 放射性和非放射性两种
放射性核素： 32P、35S和3H 非放射性标记物： 1）半抗原：生物素、地高辛素 抗原-抗体反应 2）配体：生物素-亲和素反应 3）荧光素 (FITC、罗丹明) 4）化学发光探针
探针标记方法
• 核酸分子杂交所用的探针几乎都用体外标记法标 记，分为化学法和酶法
第一节 核酸分子杂交的
基本原理
一、分子杂交与印迹技术的原理P44
（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单
链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放 在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间 有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分 子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
• 利用基因克隆的方法可获得cDNA • 优点：cDNA探针不含有内含子序列，尤其
适用于基因表达的检测。
RNA探针
• RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交 反应效率极高
• 早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和 病毒RNA探针。利用mRNA与基因的 DNA 杂交，可以反映出基因的转录状态。
人工合成的寡核苷酸探针
➢ Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成， 在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的 50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解 温 度 (melting temperature, Tm) 。 其 大 小 与 G+C含量成正比。
DNA的复性与分子杂交
DNA复性(renaturation)的定义
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱 ➢ 增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。
热变性
➢解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以
温 度 对 A260 （ absorbance ， A ， A260 代 表 溶 液 在 260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解 链曲线。