基因工程实验技术手册
实验指导书-基因工程
生命科学学院《基因工程》实验指导书适用专业生物技术、生物科学二OO 七年八月前言该指导书以基因工程的研究程序为主线，综合了目的基因的分离、克隆，载体的构建等方面的实验内容，在注重专业性和可操作性的前提下突出先进性和系统性。
通过本课程的学习和实践，使学生对基因工程的全过程有系统、明确的认识，达到熟识、理解并掌握DNA 重组实验原理和操作方法，提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为从事生物技术及其相关领域的科学研究工作打下基础。
实验设置内容包括：目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化（设计性实验），农杆菌介导的植物遗传转化（综合性实验），转化植物的表型分析及鉴定等内容（综合性实验）。
本课程的目的是培养高年级本科生及研究生进行基因操作的能力。
教学中，要求调动教学双方的主观能动性，组织学生参加实验准备，让学生和教师共同讨论理论和实验问题，指导学生分析总结实验结果。
本书可作为高等院校生物技术、生物科学等生命科学各有关专业本科生《基因工程原理与应用》的配套实验教材。
目录1、实验一：目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化···································32、实验二：农杆菌介导的植物遗传转化·······································································83、实验三：转化植物的表型分析及鉴定·······································································104、实验报告基本内容要求····························································································125、实验报告格式··········································································································13实验一目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化实验学时：7实验类型：综合实验要求：必修一、实验目的在学习分子生物学课程，并熟练掌握分子生物学实验操作技能的基础上，综合运用PCR、细菌感受台细胞制备、转化等手段，完成DNA体外扩增、扩增片段的连接、转化全过程，使同学掌握基因扩增和载体的基本方法和思路，培养独立设计实验并进行操作的能力，为从事基因工程相关研究奠定基础。
基因工程技术的实验室操作指南
基因工程技术的实验室操作指南基因工程技术是当代生物科学领域的重要技术之一，依靠该技术，科学家们能够对生物体的基因进行修改和编辑，从而改变其性状和特征。
为了确保实验的准确性和安全性，科学家们在基因工程技术的实验室操作中需遵循一系列的指南和标准。
本文将针对基因工程技术的实验室操作进行详细介绍。
实验室操作前的准备工作非常关键。
首先，实验室应具备相关的设备和材料，如PCR仪、电泳仪、恒温器、培养皿和试管等。
同时，实验室应确保符合生物安全标准，并配备必要的防护设施，如实验室白大褂、口罩、手套和安全护目镜等。
在开始实验之前，实验员应熟悉实验的流程和步骤，并将实验室设置为无菌环境。
基因工程技术的一个重要步骤是基因克隆。
在进行基因克隆实验时，实验员应遵循以下步骤：1. DNA提取：从所需的生物体中提取DNA样本。
可以通过使用商业化的DNA提取试剂盒或自制试剂盒来实现。
2. PCR扩增：设计引物并进行PCR扩增，以扩增想要克隆的基因片段。
确保PCR反应体系中酶和引物的质量和浓度合适。
3. 凝胶电泳：将PCR扩增产物与DNA分子量标准一同在凝胶上进行电泳，以分离并检测所需的基因片段。
4. 净化PCR产物：使用商业化的PCR产物净化试剂盒或其他方法去除PCR反应中的杂质，得到纯净的PCR产物。
5. 酶切和连接：使用限制性内切酶切剪基因片段，然后与质粒载体进行连接。
确保酶切体系和连接试剂的合理选择和操作。
6. 转化：将连接好的质粒转化至宿主细胞中，如大肠杆菌。
通过热激或电激等方法，使质粒得以进入宿主细胞，从而实现基因的转移和表达。
另一个重要的基因工程技术是基因编辑。
下面是基因编辑实验的步骤：1. 选择编辑工具：选择合适的基因编辑工具，如CRISPR-Cas9系统。
设计合适的引物和寡核苷酸（gRNA）序列，与Cas9蛋白结合来识别和切割特定的基因序列。
2. gRNA合成与转染：合成gRNA并将其转染至需要编辑的目标细胞中。
基因克隆实验手册
插入片段 线性化载体
推荐使用的试剂盒
产品信息
DNA Ligation Kit <Mighty Mix> P4
Blunting Kination Ligation (BKL) Kit
P6
TaKaRa DNA Ligation Kit LONG P4
Mighty TA-cloning Kit
P6
Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR®
↓ ③42℃反应45秒后，在冰中放置1～2分钟
↓ ④加入已预先37℃保温的SOC培养基，使终体积为1 ml。
↓ ⑤37℃振荡培养1小时（160～225 rpm）
↓ ⑥取适量涂布于LB选择培养基、37℃过夜静置培养
5. PCR扩增确认插入片段DNA 6. 培养、纯化质粒
PCR扩增确认插入片段DNA请参考第5页
TCGA 5’ Hin d Ⅲ
线性化载体 ※
C TAG A G C T
※ 利用限制性内切酶酶将环状载体DNA切断后，切胶 回收、或必要时进行去磷酸化反应
转化
·感受态细胞
形成菌落
进行菌落PCR 确认插入片段
·EmeraldAmp® MAX PCR Master Mix等
·电泳相关制品
— 1—
基因克隆实验手册
※ PCR扩增产物是平滑末端时进行dA加尾反应。
【目的DNA片段】 带有限制性内切酶的
酶切末端
In-Fusion克隆
5×In-Fusion® HD In-Fusion酶使 Enzyme Premix 末端15个相同
碱基无缝融合
TA克隆
3’ A
A 3’
T载体
基因工程实验手册
总论基因是遗传的基本单位，所以基因工程有时称遗传工程(genetic engineering),有时还称为基因克隆(gene cloning)、分子克隆(molecular cloning)。
基因工程的基本技术是DNA 重组技术(recombinant DNA technigue)，其定义是在分子水平上，用人工方法提取(或合成)不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后将体外重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达。
按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。
了解这个概念要注意两个问题，第一就是必须有体外DNA的切割、连接、重组过程。
第二，DNA重组必须是有目的的，按事先设计的过程进行，随意的切割、连接、重组过程不是基因工程。
一、DNA体外重组的主要步骤DNA体外重组可分五个步骤。
(一)目的基因和载体基因的制备制备带有目的基因的DNA片段和载体基因。
1．带有目的基因的DNA片段的获得带有目的基因的DNA片段的获得，主要有两个途径：一是从已有的生物基因组中分离；二是用酶学或化学的方法合成。
从生物基因组中分离DNA片段主要是提取基因组DNA，对其进行酶切，获得特定的酶切片段。
酶学合成目的基因DNA片段通常是以mRNA为模板，用反转录酶合成其cDNA作为克隆的片段。
化学合成是对目的基因DNA片段在体外进行设计，并用化学方法进行合成，较大的基因一般分多段进行合成，并在体外连接成目的基因的片段。
目前，用聚合酶链反应(PCR)对目的基因进行扩增或对目的基因转录产物RNA进行RT-PCR扩增，也是获得带有目的基因DNA片段的最常用方法之一。
2．载体的选择DNA体外重组所用的载体是可以克隆DNA片段的DNA分子。
目前常用的载体类型有质粒、噬菌体和动物病毒等。
其中以质粒载体最常用。
质粒(plasmid)是某些细菌中独立于染色体外的DNA，它有自主复制的能力，在细菌分裂时可伴随染色体分配到子细胞。
基因工程实验-biochemlab
实验二 基因组总ＤＮＡ提取
一、实验目的
掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。
生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。
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五、思考题
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如果实验对照组本不该长菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种想象？
01
实验目的
02
掌握重组质粒的转化方法
03
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实验六 重组质粒的转化
转化是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。
化学转化法 利用Cacl2处理感受态受体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90s，热休克后，是受体菌在不含抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够蛋白质，以便能在含抗生素的平板上生长菌落。
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ＤＮＡ重组、转化 ＭＨＣ与pMD18-T连接 DH5a感受态细胞制备
转化、平板涂布、培养
筛选与鉴定 抗生素抗性筛选 挑单菌落培养 提取质粒 质粒酶切、电泳检测
2.微量移液器的使用
将微量移液器按钮轻轻压在第一挡 垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头直接插到液体底部 缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样品液。否则液体进入吸头太快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。 等1s后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦过 平稳把按钮压到第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、 提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过 然后按吸头弹射器除去吸头
基因工程实验技术操作手册
基因工程实验技术操作手册一、实验前准备在进行基因工程实验前，需要做好以下准备工作：1. 实验室环境准备：确保实验室设备完好，工作台面干净整洁，通风良好。
2. 实验材料准备：准备所需的试剂、培养基、细胞培养物等实验材料，并按照要求进行储存和标识。
3. 实验仪器准备：检查并确保实验所需的仪器设备正常运作，如PCR仪、电泳仪等。
4. 个人防护准备：佩戴实验室必备的个人防护用品，如实验手套、实验服、护目镜等。
二、实验步骤1. DNA提取a. 准备待提取的生物样本，如细菌、植物组织等。
b. 使用DNA提取试剂盒按照说明书进行提取步骤，如细胞破碎、蛋白质沉淀等。
c. 最后得到纯净的DNA样品，可用于后续的实验操作。
2. PCR扩增a. 准备PCR反应体系，包括DNA模板、引物、酶和缓冲液等。
b. 将反应体系加入PCR仪中，设置好扩增程序和参数。
c. 进行PCR扩增反应，得到所需的目标DNA片段。
3. DNA连接a. 准备连接试剂盒，包括连接酶、连接缓冲液等。
b. 将目标DNA片段和连接载体按照比例混合，加入连接试剂中。
c. 进行连接反应，使目标DNA片段与载体DNA连接成一个完整的质粒。
4. 转化a. 准备感受态细胞，如大肠杆菌等。
b. 将连接后的质粒DNA加入感受态细胞中，进行热激转化或电转化。
c. 将转化后的细胞涂布在含有适当抗生素的培养基上，培养过夜。
5. 筛选与鉴定a. 从培养基中挑取菌落，进行PCR扩增或酶切检测，筛选含有目标基因的菌落。
b. 对筛选出的菌落进行测序，验证目标基因的正确性。
c. 进一步进行功能鉴定，如蛋白表达、酶活性等实验。
三、实验注意事项1. 操作时要严格遵守实验室安全操作规程，注意个人防护和废弃物处理。
2. 实验材料的储存和标识要清晰明确，防止混淆和污染。
3. 仪器设备的操作要正确，遵循使用说明书，避免操作失误和设备损坏。
4. 实验步骤中的温度、时间等参数要按照要求进行调整和控制，确保实验结果的准确性。
基因工程实验手册
《本科实验教学》基因工程实验指导贵州大学农业生物工程研究院2015年4月实验一DNA片断的连接、转化及酶切鉴定一、实验原理：实验所用载体为Promega公司T载体pGEM®-T Easy Vector，特点为在载体中存在两个T末端。
使用LA Taq进行扩增得到的大部分PCR产物3’端附有一个“A”碱基。
T4噬菌体DNA连接酶可在体外使外源DNA片段和线状质粒载体之间形成新的3'，5'磷酸二酯键。
PCR胶回收产物游离A末端与载体的T末端可互补配对并在连接酶作用下连接形成重组质粒。
转化指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA分子导入受体细胞体内，使法），其原理之获得新的遗传特性的一种方法。
大肠杆菌转化常用化学法（CaCl2溶液致敏处理，就可以成为高是培养至对数生长期的细菌在0℃经过低渗CaCl2效的感受态细胞，这种感受态细胞与质粒混匀置于0℃30min，混合物中的DNA 形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，再经42℃短时热激处理，促使质粒进入细胞实现转化，利用质粒上的遗传选择标记在LB平板上进行初步筛选转化菌落。
蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补，抗生素基因等（本实验中使用的T载体pGEM®-T Easy Vector本身具有Amp抗性）。
现在使用的许多载体都有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。
因此，宿主和质粒编码的片段虽没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样，β-半乳糖苷酶基因在缺失近操纵区段的宿主细胞与带有完整近操纵区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。
基因工程操作方案
基因工程操作方案一、研究目的本实验旨在通过基因工程技术对大豆进行基因编辑，以增强其耐病性和抗性，提高产量和品质。
具体操作方法如下。
二、实验材料和仪器1. 实验材料：（1）大豆种子；（2）大豆叶片；（3）大豆细胞；（4）质粒载体；（5）再生植物生长基质。
2. 实验仪器：（1）基因编辑工具，如CRISPR/Cas9系统；（2）生物反应器；（3）滤纸；（4）过滤器；（5）离心机；（6）光学显微镜。
三、实验步骤1. 提取大豆叶片DNA（1）用无水乙醇浸泡大豆叶片，研磨成细胞浆。
（2）使用DNA提取试剂盒提取叶片DNA。
（3）通过紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度。
2. CRISPR/Cas9设计（1）在NCBI数据库中获取大豆相关基因序列。
（2）设计适当的RNA引物和Cas9蛋白质来切割目标基因。
（3）将RNA引物和Cas9蛋白质混合，构建成CRISPR/Cas9系统。
3. 转基因植物的制备（1）将质粒载体注入大豆细胞。
（2）通过冷冻融合技术将载体导入大豆叶片细胞。
（3）将转基因细胞培养在再生植物生长基质中。
4. 转基因大豆的筛选和鉴定（1）利用抗性筛选方法，对经过CRISPR/Cas9编辑的大豆细胞进行筛选。
（2）通过PCR技术和基因序列分析，鉴定转基因大豆中是否成功编辑了目标基因。
5. 转基因大豆的培育（1）将成功编辑的转基因大豆细胞进行再生，培育成植株。
（2）在生物反应器中培养转基因植株，观察其生长情况和产量变化。
6. 转基因大豆的性状分析（1）对转基因大豆进行耐病性、抗性、产量和品质的性状分析。
（2）通过对比实验组和对照组的数据，评估转基因大豆的优劣势和应用潜力。
四、实验结果分析通过以上步骤的操作，通过基因工程技术对大豆进行了基因编辑，得到了一批转基因大豆植株，并进行了性状分析。
结果显示，转基因大豆在耐病性、抗性、产量和品质上都表现出了显著的改进。
这表明基因工程技术可以有效地改善大豆的性状，为大豆育种和生产提供了新的途径。
水稻转基因实验技术手册
水稻转基因实验技术手册遗传工程实验室Genetic Engineering Laboratory Discipline of Crop Genetics and BreedingFujian agricultural and Forestry University目录第一章DNA提取与纯化第二章引物设计与PCR第三章感受态细胞制备与转化（E. coli & 农杆菌）第四章电泳技术、琼脂糖凝胶DNA回收第五章质粒回收第六章RT-PCR第七章构建载体互补实验过量表达GFPGUSRNAi第八章水稻组织培养第九章原位杂交第十章石蜡切片技术第十一章扫描电子显微镜附录：第一章SDS-DNA微量提取法1、取新鲜叶片5cm 左右于1.5ml 离心管中，加入液氮研磨（电钻）。
2、加入700μl 预热至65℃的SDS 抽提液，迅速搅匀后置于65℃水浴30min 。
3、加入200μl 5M KAc ，颠倒混匀，-20℃冰浴30min 后，10,000rpm 离心5min ，将上清夜倒入另一新的1.5ml 离心管中。
注：若溶液中仍有植物组织，可进行二次离心。
4、加入等体积的异丙醇（700 μl ），-20℃冰浴30min ，11,000rpm 离心5min 。
5、弃上清，加入70%乙醇清洗液晾干。
6、将风干的DNA 溶于100 μl TE 溶液中，55℃水浴溶解1h ，再室温放置1d 。
实验准备：溶液配制：SDS-抽提液：1M Tris-HCl ：100ml 5M NaCl ：100ml 0.5M EDTA ：100ml 10% SDS ：125mlTE （pH8.0）：1M Tris-HCl （pH8.0）：5ml 0.5M EDTA （pH8.0）：1ml第二章 PCR定容至1000ml定容至500mlPrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer & TaKaRa LA Taq with GC BufferPCR体系和程序第四章琼脂糖凝胶DNA回收*第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇1、在长波紫外下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽力切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。
基因工程实验
基因工程实验详细步骤一、目的基因LK的扩增——PCR（含电泳）（一）目的基因LK的扩增——NE201（1）实验准备材料：rLK重组质粒（模板）试剂：PCR试剂盒用具：移液枪（2.5μl、10μl、50μl）以及相应枪头（盒）、EP管（100μl）、EP板（大、小）；冰袋两只、手套、废液桶仪器：离心机（14000rpm）、PCR扩增仪（2）反应体系（50μl）试剂（按照加样顺序）用量dH2O23μL重组质粒1μL上游引物F 0.5μL下游引物R 0.5μLTaq酶25μL（3）反应条件预变性95℃，10min变性95℃，30s退火56.6℃，35s延伸72℃，40s最终延伸72℃，10minTIP：*吸取或加入液体时，枪头尽量少伸入，可避免气泡产生；若有气泡，需10000rcf离心1min 再进行下一步实验*勤换枪头，避免污染试剂或产物*任何移液枪用完后及时调回最大量程*仪器用完后及时关闭（二）LK PCR产物的电泳——NE217（1）实验准备材料：LK PCR产物试剂：去离子水、50×TAE缓冲液、电泳用琼脂糖、6×Loading Buffer、DL1000marker（D526A）、Ultrapower DNA Stain染液用具：钥匙、称量纸、橡皮筋、100ml锥形瓶、50ml量筒；制胶槽、制胶卡、制胶梳（18teeth）；移液枪（10μl、1000μl）及相应枪头（盒），100μl EP管，EP板（大、小）；冰袋两只、手套（包括塑料和麻布）、废液桶仪器：电子天平、微波炉、电泳仪（含电泳槽）（2）制胶（3%）1. 称取电泳用琼脂糖0.6g（即总体积20ml 的3%），小心倒入100ml锥形瓶中2. 取TAE缓冲液400μl于50ml量筒中，去离子水定容至20ml（实为电泳缓冲液）3. 将量筒中液体转入锥形瓶中，盖上吸量纸，用橡皮筋封好，再用步骤2中用剩的枪头扎一个小孔4. 将制胶梳（18 teeth）、制胶卡、制胶槽洗净并用吸水纸擦干，组装好5. 至于微波炉中，注意观察，煮沸后立即拿出（戴上麻布手套），轻轻晃匀，重复2-4次，至胶完全澄清均一为止6. 及时将胶转入准备好的制胶槽，凝固30min后，连着横条纹塑料板一起放入电泳槽中（胶孔靠近负极）（3）加样和电泳1. 在EP管内分别加入A. DL1000marker 5μl，染液1μl；B. PCR产物5μl，6×loading buffer1.2μl，染液1μl2. 将样品全部转入胶孔中。
基因工程实验指导书
实验项目重组质粒DNA的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳检测实验项目类型：综合性所属课程名称：《基因工程》实验计划学时：8学时一、实验目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。
学会用酶切法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。
二、实验原理1、提取质粒原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。
在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。
尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
2、质粒DNA的酶切鉴定原理利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。
再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。
三、实验材料与仪器1、仪器超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。
2、试剂pGEM-T-AT8载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液(溶液II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。
EcoR I，Xba I，Sac I ，Xho I，内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲四、操作步骤1、实验准备氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20︒C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200μL 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121︒C 20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd water至100ml），70%乙醇（-20︒C 保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /mL RNase A （RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121︒C 30min）。
基因工程的实验技术方案
基因工程的实验技术方案基因工程是一种将基因改变和转移到另一个生物体中的技术，它广泛应用于医学、农业和工业等领域。
基因工程技术的发展使得人们可以对生物体进行精准的基因改造，以实现各种目的。
下面将介绍一种基因工程实验的技术方案，包括实验目的、材料与方法、实验步骤、结果与分析等内容。
实验目的本实验的目的是利用基因工程技术，将外源基因转移到靶细胞中，并观察外源基因在靶细胞中的表达情况。
通过本实验的设计与实施，将考察基因工程技术在基因转移与表达方面的应用效果，并为进一步的研究与应用提供实验基础。
材料与方法1. 材料- 靶细胞：选择目标细胞，如细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
- 载体DNA：质粒或病毒载体，用于携带外源基因。
- 外源基因：感兴趣的基因序列。
- 转化试剂：如钙磷酸钠、聚乙烯亚胺等。
- 培养基与培养设备：提供细胞生长所需的养分、温度和湿度等条件。
2. 方法- 基因克隆：将外源基因克隆到适当的载体DNA中。
- 载体构建：将所得的重组载体构建好，确保外源基因的稳定性和表达性。
- 细胞培养：培养靶细胞，确保细胞状态良好。
- 转化：利用转化试剂将构建好的载体DNA与外源基因转移到靶细胞中。
- 筛选：用适当的筛选方法筛选转化后成功表达外源基因的细胞。
实验步骤1. 基因克隆首先，从适当的来源中提取感兴趣的基因序列，然后通过PCR等方法将基因扩增。
接着，将扩增的基因与载体DNA连接，构建重组载体，并进行鉴定和纯化。
2. 载体构建将构建好的重组载体经过鉴定，确保外源基因插入正确，并且载体的完整性与稳定性能满足后续的转化与表达需求。
3. 细胞培养准备好靶细胞，并进行细胞培养，确保细胞在培养基中状态良好。
4. 转化将构建好的重组载体与外源基因与转化试剂一起处理靶细胞，促使外源基因转移到细胞内。
5. 筛选用适当的筛选试剂或方法，对转化后的细胞进行筛选，筛选出成功表达外源基因的细胞。
结果与分析通过上述实验步骤，我们可以获得成功表达外源基因的细胞。
基因工程实验操作作业指导书
基因工程实验操作作业指导书前言：在进行基因工程实验操作之前，请确保已经具备相应的实验知识和技能，并遵守实验室的安全规定。
本实验操作指导书将详细介绍基因工程实验的步骤和注意事项，以确保实验顺利进行。
一、实验前准备1.确认实验的目的和所需材料：确定需要进行的基因工程实验目标，并准备所需的各种试剂、细胞培养物和实验器材。
2.实验室安全措施：穿戴实验室要求的个人防护装备，遵守实验室的规章制度。
确保实验室电源和排风系统正常运行。
二、实验步骤1.基因克隆a) DNA提取：从源生物体中提取DNA样本，利用适当的提取方法将DNA纯化并获得高质量的DNA。
b) PCR扩增：设计引物，进行PCR扩增反应，使目标基因扩增到所需的浓度。
c) 酶切：使用限制性内切酶对目标基因和载体进行酶切，创建黏性末端适配体。
d) 连接：将目标基因与载体连接，形成重组DNA。
e) 转化：将重组DNA转化到适宜的宿主细胞中，使其能够被宿主细胞内的酶复制和表达。
2.细胞培养a) 培养基准备：根据实验需求制备适宜的培养基。
b) 细胞传代：将宿主细胞进行传代，以保持活性和生长状态。
c) 质粒提取：从转化后的细菌中提取质粒DNA，作为后续实验的样本。
d) 菌液预处理：将细菌培养物进行适当的处理，如离心、洗涤等。
3.基因表达a) 表达培养条件控制：设置适宜的温度、培养时间和培养基成分，以获得高效的基因表达。
b) 转录与翻译：利用适当的启动子和加入适量的诱导剂，实现基因转录和翻译。
c) 蛋白质纯化：根据需要，对表达的蛋白质进行纯化，确保其纯度和活性。
4.实验结果分析a) 凝胶电泳：使用凝胶电泳分析方法，判断基因工程实验的成功与否。
b) 荧光检测：通过荧光标记的方法检测基因表达程度。
c) 其他分析方法：根据实验目的及需求，选择适当的分析方法进行结果分析。
三、实验操作注意事项1.实验室安全：佩戴手套、实验外套、护目镜等个人防护装备，避免实验材料和试剂对人体造成伤害。
基因工程实验操作
实验一质粒DNA的提取试验方法与步骤（1）、菌种的培养：将含质粒的菌液接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基中，37℃培养12-24小时。
用无菌牙签或接种针挑取单菌落接种到5ml含100ug/ml Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（约18小时）备用。
（2）用微量取液枪取1.5ml菌液于离心管中，将装有剩余菌液的锥形瓶瓶口在酒精灯火焰上灭菌后封口备用。
（3）、将离心管置于离心机中，12000rpm离心1min。
（4）、弃上清，将管口打开倒置于吸水纸上数秒使液体尽可能流尽。
（5）、加入250ul溶液I，用枪吹打悬浮后置于旋涡混合仪上振荡，使菌体充分悬浮，室温静置5min。
（6）、加入250ul新配制的溶液II，温和颠倒混匀，冰浴中静置5min。
（7）、加入350ul溶液III，轻轻颠倒混匀，冰浴中静置10min。
（8）、将管置于离心机中，12000rpm离心10min。
（9）、取上清液,置于套有离心管的吸附柱中,10000rpm离心1min,弃清液,留吸附柱。
（10）、取500ul的Buffer HB置于上述套有离心管的吸附柱中，10000rpm离心1min，弃清液，留吸附柱。
（11）、取500ul的Wash Buffe置于上述套有离心管的吸附柱中，10000rpm离心1min。
（12）、去清夜，离心空离心管，10000rpm离心1min。
（13）、去清夜，取500ul的EB于吸附柱，室温放置1~2min，13000rpm离心1min。
（14）、取200ul样品用水稀释50倍后，以水为对照测其OD260与OD280值。
（15）、另取5ul样品与2ul 6×上样缓冲液混匀后进行琼脂糖凝胶电泳，检测其纯度和分子量。
（16）、其余样品作好标记后贮存于4℃冰箱中备用（用于构建重组子）。
实验二紫外分光光度法测定DNA纯度和浓度实验步骤（1）分光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。
基因工程实验指导书2
目录实验一、质粒DNA的提取实验二、细菌基因组的提取实验三DNA的限制性内切酶解及电泳实验四、PCR基因扩增及电泳实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验一、质粒DNA的提取质粒是一种双链的共价闭合环状的DNA分子,是细胞染色体外能够稳定遗传的因子。
在基因克隆的实验中,要把一个有用的外源基因通过重组DNA技术,送进生物细胞中去繁殖和表达。
实现携带外源基因进入受体细胞的工具被称为载体,细菌质粒是基因工程中常用的载体之一。
作为基因工程的载体需具备下列条件:（1）是一个复制子,载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖;(2)载体在受体细胞中能大量增殖,只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；3)载体DNA链上有一至数个限制性内切酶的单一识别与切割位点,便于外源基因的插入;(4)载体具有选择的遗传标记,如抗氨苄青霉素基因(Amp R,抗新霉素基因(Neo R)等,以此判断载体是否进入受体细胞,并据此将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来.细菌质粒在细胞内的复制,一般分为两种类型:严密控制型和松驰控制型。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,与染色体复制相关联,每个细胞只含有一个或几个质粒分子,如ColEI 质粒(含有产生大肠杆菌毒素EI基因),pBR322就是ColEI衍生的质粒。
后者在整个细胞周期中随时可以复制,具多拷贝,一般在120个以上。
本实验分离纯化的质粒为pQE30,为高拷贝质粒。
通过本实验学习了解质粒DNA的特点,掌握碱性SDS快速法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA.一、实验原理所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤:①细菌培养物的生长;②细菌的收获和裂解;③质粒DNA的纯化。
本实验以碱性SDS快速法小量制备pQE30质粒。
碱裂解法对于以前应用的所有的大肠杆菌均卓有成效。
该方法的特点是,加溶菌酶可破坏菌体细胞壁(小量制备可省略不用溶菌酶),去污剂SDS可使细胞壁裂解,并使蛋白质变性,在碱性条件下,破坏碱基配对,故可使宿主的线状染色体DNA变性,但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。
研究生基因工程实验手册1
基因工程实验指导（研究生用）西北农林科技大学2013-5基因工程实验指导编写：张大鹏王保莉目录实验一、细菌培养实验二、琼脂糖凝胶电泳法检测实验三、质粒载体DNA的提取实验四、质粒载体DNA酶切实验五、目的基因的获得及酶切处理实验六、质粒载体和外源DNA的连接反应实验七、感受态细胞的制备及转化实验八、重组质粒鉴定及转化实验九、目的蛋白的诱导表达及检测附录实验守则及要求一、实验前要认真预习实验指导，熟悉实验内容、方法和具体操作步骤，并对本实验中的部分设计型实验内容进行实验参数设计，写出预习报告。
二、实验过程中要认真操作、仔细观察、善于思考和提出问题。
作好实验数据及发生现象的记录。
三、爱护实验室的一切设备和实验仪器，如有损坏应主动向教师说明原因，并填写报损报废单，以便酌情处理。
四、每个小组的学生在进行实验过程中，要密切配合、互相帮助，力争圆满地完成各项实验内容。
五、实验室需要保持安静，不允许高声喧哗和谈笑及随便走动。
每次实验结束，应清理自己的实验台，把实验用具清洗完毕，安放妥当。
并组织值日生打扫，保持实验室的清洁卫生。
并注意实验室的水、电、门、窗等方面情况。
六、实验结束后认真整理数据、计算结果，对实验中的现象和问题进行必要的讨论；对改进实验提出合理化建议。
七、穿着要整洁，必须穿实验服。
在完成实验后，必须书写实验报告。
一份满意的实验报告必须具备准确、客观、简洁、明了四个特点。
写好实验报告除了正确的操作程序外，还必须有赖于仔细的观察及客观的记录，有赖于运用所掌握的理论知识对实验现象和结果的分析和综合能力。
实验报告的格式包括以下几方面：1、实验的目的和原理简单扼要地说明进行本次实验的目的和原理。
对实验中所用的技术和方法，要作简单的介绍。
2、实验操作程序在充分理解操作步骤和原理上。
对整个实验操作过程进行概括性的描述，要求简单明了，避免长篇抄录。
3、结果处理对实验过程中出现的现象仔细观察，对数据客观记录。
然后再进行处理计算等，得出结果。
基因工程实验操作技术
总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。
若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。
在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。
TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。
TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。
Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。
基因工程实验
实验一从植物中提取DNA【实验目的】1、掌握提取DNA的技术及原理2、学习DNA提取的方法【实验原理】首先研磨粉碎的植物组织在LP缓冲液裂解完全，基因组DNA被释放出来。
在加入DA缓冲液沉淀后，去除大部分杂质。
然后，由于加入的P Binding缓冲液中适当的盐分及pH值得作用下，DNA被特异吸附于Biospin膜上。
通过洗涤，可将蛋白质等残留的杂质去除。
最后使用Elution Buffer将DNA从膜上洗脱下来，从而获得基因组DNA。
【实验材料】自己采取某种植物的叶子1. 实验试剂植物DNA提取试剂盒【实验操作】1.剪取约0.2-0.5g叶片于冷研钵后，迅速倒入液氮用玻棒研磨成为粉末，分装到1.5ml的离心管中。
2.加入450μl LP缓冲液，并混合均匀。
3.于65℃环境下温浴15分钟，温浴中可间或震荡离心管2-3次，然后移出。
4.加入150μlDA缓冲液，混合均匀后于冰浴中放置5分钟。
5.将混合物全部转移至Shredder spin colum，于离心机中3分钟。
6. 将滤液转移至一个新的1.5ml离心管。
7. 加750μl P Binding缓冲液，并混合均匀。
8. 将混合液转移至Spin column。
于离心机离心1分钟，弃去接液管中的液体。
9. 向Spin column中加入500μl的G Binding Buffer。
离心30秒，弃去接液管中液体。
10. 向Spin column中加入600μl的Wash Buffer。
离心30秒，弃去接液管中液体。
11. 重复步骤10一次。
12. 再次将Spin column离心1分钟，并将Spin column 转移至一个新的1.5ml离心管中。
13. 向Spin column中加入100μl的 Elution Buffer，并于室温温育1分钟。
离心1分钟，取离心管中的液体含有DNA。
实验二 PCR扩增 DNA【实验目的】1、掌握 PCR扩增 DNA的技术及原理2、学习 PCR扩增仪的使用【实验原理】聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外 DNA扩增技术，1985年由 Mullis 等人创立。
2015年基因工程实验手册-推荐下载
实验一 DNA 片断的连接、转化及酶切鉴定
一、实验原理：
实验所用载体为 Promega 公司 T 载体 pGEM®-T Easy Vector，特点为在载 体中存在两个 T 末端。
使用 LA Taq 进行扩增得到的大部分 PCR 产物 3’端附有一个“A”碱基。 T4 噬菌体 DNA 连接酶可在体外使外源 DNA 片段和线状质粒载体之间形 成新的 3'，5'磷酸二酯键。PCR 胶回收产物游离 A 末端与载体的 T 末端可互补 配对并在连接酶作用下连接形成重组质粒。 转化指将质粒 DNA 或以其为载体构建的重组 DNA 分子导入受体细胞体内， 使之获得新的遗传特性的一种方法。大肠杆菌转化常用化学法（CaCl2 法），其 原理是培养至对数生长期的细菌在 0℃经过低渗 CaCl2 溶液致敏处理，就可以成 为高效的感受态细胞，这种感受态细胞与质粒混匀置于 0℃30min，混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，再经 42℃短时热激 处理，促使质粒进入细胞实现转化，利用质粒上的遗传选择标记在 LB 平板上 进行初步筛选转化菌落。 蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如 α-互补，抗生素基因等 （本实验中使用的 T 载体 pGEM®-T Easy Vector 本身具有 Amp 抗性）。现在使 用的许多载体都有一个大肠杆菌的 DNA 的短区段，其中有 β-半乳糖苷酶基因 （lacZ）的调控序列和前 146 个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一 个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到 β-半 乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码 β-半乳糖苷酶羧基端 部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽没有酶活性，但它们同 时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，β-半乳糖苷酶基因在缺失近 操纵区段的宿主细胞与带有完整近操纵区段的质粒之间实现了互补，称为 α-互 补。由于 α-互补而产生的 β-半乳糖苷酶基因和细菌在诱导剂 IPTG 的作用下， 在生色底物 X-Gal 存在时，可产色蓝色菌落，易于识别。然而，当外源 DNA 插入到质粒的多克隆位点后，宿主细胞与质粒之间不能形成 α-互补，从而使带 有重组质粒的细菌形成白色菌落。
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基因工程实验技术（2013修订版）西北农林科技大学生物化学与分子生物学系2013.12基因工程实验技术（2013修订版）目录实验一、小麦GAPDH总RNA提取实验二、RT-PCR扩增目的基因cDNA（小麦GAPDH截短体）实验三、核酸琼脂糖电泳分析实验四、质粒的提取实验五、表达载体和目的片段的酶切实验六、载体和外源DNA的连接实验七、感受态细胞的制备及转化实验八、重组质粒筛选、鉴定及转化实验九、目的基因诱导表达实验十、Western Blotting检测附录1DNA的纯化与回收附录2培养基制备和细菌培养附录3小麦3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）信息附录4表达载体pGEX4T-1图谱附录5标准分子量图小麦GAPDH截短体的重组与表达实验流程图小麦幼苗总RNA提取RT-PCR扩增GAPDH截短体基因片段胶回收表达载体构建表达菌株转化诱导表达Western杂交小麦GAPDH截短体的重组与表达1小麦总RNA提取（Trizol法）1.1材料小麦幼苗1.2仪器设备高速冷冻离心机、低温冰箱、核酸电泳设备、液氮罐、研钵、剪刀、镊子等1.3试剂配制及器具处理①0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。
剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。
③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
④Trizol⑤75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
⑥氯仿(最好用新的)。
⑦异丙醇(最好用新的)。
1.4操作步骤1.4.1Trizol法提取总RNA①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。
②室温放置5min，然后加入200µL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。
③12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500µL异丙醇，温和颠倒混匀。
室温放置10min，12000rpm离心10min。
④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。
⑤重复步骤④。
⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。
用30µL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。
RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意]①整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
②加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
2RT-PCR 扩增目的基因cDNA2.1试剂①RNA 模板②Olig （dT ）18③反转录缓冲液④dNTP⑤M-MULV 反转录酶⑥RNA 抑制剂（RNasin ）⑦Premix EX Taq DNA 聚合酶⑧PCR 特异引物2.2设备PCR 扩增仪、电泳仪、台式离心机、恒温水浴、微量移液器2.3操作步骤2.3.1RNA 的反转录采用Thermo Scientific （Fermentas ）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6µL （需加入RNA 约1μg ）Oligo dT primer 1µL H 2O （nuclease-free ）5µL12µL65℃5min ，补加下列试剂：5×Reaction buffer4µLRibolock RNase Inhibitor 1µL 10mM dNTP Mix2µL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase1µL 20µL42℃60min70℃，5min ，﹣20℃保存2.3.2PCR 扩增目的基因2.3.2.1用表达引物扩增目的基因（25µL 体系）2×PCR Mix 12.5µL 95℃1min 95℃10s 58℃20s 72℃45s 72℃10min 16℃∞cDNA 1µL 引物GAPDH1-11µL 引物GAPDH1-21µL H 2O 9.5µLtotal25µLPCR 产物经胶回收。
35cycles3核酸琼脂糖电泳分析3.1试剂①TAE缓冲液（50×）：用时需稀释50倍②点样缓冲液Loading buffer（10×）：含0.25%溴酚蓝和40%甘油③溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶，注意EB具致癌作用。
④琼脂糖3.2器材电泳仪系统、凝胶成像系统3.3操作步骤3.3.1琼脂糖凝胶的制备称1g琼脂糖加入100ml TAE缓冲液中加热熔化。
3.3.2胶板制备将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。
然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TAE缓冲液），拔掉梳子。
注意：缓冲液要高出胶面2mm。
3.3.3点样每个样品中加入1/10体积Loading buffer（10×），混匀后小心地加入点样孔中，要避免相互污染。
3.3.4电泳接通电源，80V电压电泳40min左右，当溴酚蓝到达凝胶前沿约2㎝处时停止电泳。
3.3.5观察及照相将凝胶取出，在EB溶液中浸泡10min后，用凝胶成像系统照相。
4表达载体和目的片段的酶切4.1试剂①BamHⅠ②SalⅠ③BamHⅠbuffer④质粒提取试剂盒4.2设备电泳仪系统、紫外灯、恒温水浴箱4.3操作步骤4.3.1在LB液体培养基中接入带pGEX4T-1质粒的菌种，在37℃下200rpm摇菌过夜。
参见实验8的方法提取质粒。
4.3.2质粒DNA和目的片段的酶切管号①②pGEX4T-132µLPCR产物32µLddH2O1010BamHⅠBuffer（10×）5µL5µLBamHⅠ1µL1µLSalⅠ2µL2µL加样后混匀，置于37℃水浴中，保温3~4h。
80℃保温10min灭活酶。
4.3.3酶切产物全部经琼脂糖凝胶电泳后回收。
5载体和外源DNA的连接反应5.1试剂①目标DNA片段（PCR扩增产物）②载体（pGEX4T-1酶切回收产物）③10×ligation缓冲液④T4DNA连接酶⑤ddH2O5.2设备台式离心机、恒温水浴、微量移液器5.3操作步骤取一个200µL的EP管依次加入下列试剂：2×buffer：5µLpGEX4T-1酶切回收产物：1µLPfu扩增并酶切回收的片段：3µLT4连接酶：1µL离心30Sec，使反应体系充分混合，16～22℃连接3～4h。
6感受态细胞的制备及转化（CaCl2方法）6.1实验材料大肠杆菌Top10或BL21（DE3）PlysS6.2试剂①LB培养基（液体和固体培养基配置方法参见附录2）②氨苄青霉素6.3设备培养皿、带帽试管、涂布器、冷冻离心机、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）、恒温摇床6.4操作步骤6.4.1感受态的制备①从LB平板上挑取单克隆于5ml LB培养基中，37℃200rpm摇菌12～16h。
②将活化过的菌按1～5％的体积比接种到新的LB液体培养基中，37℃200rpm摇菌约2h，OD600约为0.4。
③取1.5ml摇好的菌液于一1.5ml的EP管中，4℃4000rpm离心3min，弃上清。
④加250µL0.1M的CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，4℃6000rpm离心1min弃上清。
⑤加200µL0.1M的CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，即为感受态细胞。
置于4℃存放。
12h内使用效果最佳。
注意：①无菌操作和保持低温。
②培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。
③如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。
6.4.2转化①将盛有感受态细胞的EP管放置于冰上10min，加入10µL连接产物（若加质粒，则只需加1µL），温和混匀，冰浴20~30min。
②42℃热激90S。
冰浴5~10min。
③加入800µL LB液体培养基，37℃培养45～60min。
4000rpm离心2min，弃去800µL 上清液，剩余混匀用来涂板。
④取含有50～100μg/ml Amp的LB平板培养基（若进行蓝白斑筛选，在培养皿上先涂布4µL200mg/ml的IPTG和40µL20mm/ml的X-Gal），涂板。
⑤37℃倒置培养16~20h。
7克隆的筛选和快速鉴定7.1试剂①Taq DNA 聚合酶②10×buffer （含MgCl 2）③dNTP④Loading buffer7.2设备电泳仪、1.5ml EP 管、培养皿、PCR 扩增仪、台式离心机7.3操作步骤7.3.1提取质粒测定取一培养皿在底部标记如图示：待转化的细菌菌落长直径到2mm 时，用接种针（或用灭菌的牙签、小枪头）挑取单克隆菌落，划在培养皿上作好标记的方格内；同时在对应编号的培养管中接种，培养管中含5ml LB 液体培养基。
培养皿37℃培养6h 后4℃保存。
培养管37℃振荡培养12h 左右。
用培养管中的菌液提取质粒。
酶切电泳检查质粒或进行质粒PCR 鉴定。
7.3.2菌落PCR 鉴定法直接用接种针或牙签挑取少许菌体加入20μ的PCR 反应体系中。
电泳检测PCR 产物，挑选对应的阳性克隆菌落。
试剂体积（20µL ）2×PCR Mix 10µL 引物GAPDH1-11µL 引物GAPDH1-21µL 模板(单菌落)1个ddH 2O8µL94℃3min 94℃30s 58℃30s 72℃45s 72℃10min30cycles8质粒的提取8.2设备离心机8.3操作方法三、实验材料、试剂与主要仪器8.1实验材料含质粒的大肠杆菌8.2试剂质粒提取试剂盒(天根生物科技)8.3仪器设备①Eppendorf管、离心管架②10，100，1000µL微量加样器③台式高速离心机④摇床、高压灭菌锅8.4操作步骤8.4.1培养细菌将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃培养24h，然后从平板上挑取单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃培养12h。