华东理工大学仪器分析高效液相色谱法3
高效液相色谱法测定精氨酸催产素及其酶催化降解产物
４ ．酶催化反应是一类重要的特殊的复
杂反应，反应体系中成分复杂，有些性质很 相似，一般的方法不能完美地解决浓度测定 这个关键，ＨＰ Ｃ Ｌ 法可以直接测定酶催化反 应体系中组分的浓度，这就大大简化了分离
手段。用Ｈ Ｌ 研究这类反应 的动力 学机 ＰＣ
制，前景令人乐观。
反应速度常数ｋ［，２ １ １３ ｏ Ｌ－ ２］ ＝ ． ０ｍ ｌ ） ６ｋ ２ （ ／ １
反应体系为 ６ ００ｍｏ Ｌ ｍｌ．４ ｌ 磷酸缓冲溶 ／
（ 一）仪器及试剂
美国 Ｖ ｒ ｎ ６ ａｉ ５ ０高 效 液 相色谱仪及 ａ ０
Ｕ －０检测器；日 ｉ ｃｉ －０ Ｖ １０ 本Ｈｔ ｈ ８５５ 氨基 ａ ３
酸分析仪。
液 ｐ ． 在该体系中 既 Ｈ７ ， ０ 准 确加入一定量的标 准Ａ Ｔ Ｖ 和新制备的酶催化剂，使Ａ Ｔ的初 Ｖ 始浓度Ｃ为３ ０ １－ ｏ Ｌ 酶催化剂的 ｏ ． ０ ０５ ｌ ｍ ／ 量为２ ｍ ／ ｌ ． ｇｍ ，恒温３℃进行反应。分别 ５ ７ 在反应时间 ｔ０３ ０１０２０ ６分钟） （ ０８ ６ ４和３０
［ ］Ｄ ｅ ｅ，Ｂ ｏｕ，“ ａ ｒｉ ｏ ４ ．Ｄ Ｗｉ ｄ ．Ｂｈｓ Ｍ ｔａｏ ｆ ｕ ｔｎ
Ｔ ｅ ｒｏｓ ｓｍ Ｐｏｒ ｓ Ｂａ ｈ Ｎ ｖｕ Ｓ ｔ ， ｒ ｅ ｉ ｒｉ ｅ ｙｅ ｇ ｓ ｎ ｎ
Ｒ ｓ ｒｈ ， Ｅｓｖｅ， Ａ ｓ ｒａ ｅｅ ｃ ” ｔ ｉｒ ｍ ｔ ｄｍ，Ｖｏ ８ ａ ｅ ｅ ｌ４ ．
ｔ ｒ ｈｄ １ ｏ ａ ｈｏ ｒ Ｒ －８ ｕ ｎ ｏ ａ ｅ ａ ７ ｎ ｌ ｒ ｏｂ １ ｃｌ ｇｐ ｔ ｉ ｓ ｃ Ｐ ｏｍ
ｕｉｇ ４ｎ ｕｔ ｖ ｌ ｄｔ ｔｒ Ｂ ｃｕｅ ｍ ｓ ａ２ －ｍ ｌａ ｉ ｅ ｅ ｃ ． ｅａｓ ｓ ｅ ｎ ５ ｒ ｏ ｔ ｅ ｏ ｏ ａ ｕ ｔ ｍ ｔａ ｏ ｉ ｓｂｔｕｅ ｆｒ ｂｌ ｍｏｎ ｏ ｆ ｅｈｎ ｌ ｕ ｓ ｔｔ ｓ ｉ ｄ ｏ ｍｏ ｉ ｅ
食品仪器分析-高效液相色谱参考答案.总结
高效液相色谱习题一、填空题1.高效液相色谱分析是将流动相用高压泵输送，使压力高达 5 M Pa以上，并采用新型的化学键合固定相，是分离效率很高的液相色谱法。
2.高效液相色谱法的特点是分离性能高、分析速度快、检测器灵敏度高、应用范围广。
3.高效液相色谱法和气相色谱法的共同之处是分离功能、分析功能、在线分析。
4.高效液相色谱分析根据分离机理不同可分为四种类型，即液固色谱、液液色谱、键合相色谱、凝胶色谱。
5.高效液相色谱中的液一液分配色谱采用的新型固定相叫化学键合相，它是利用化学方法将固定液官能团键合在载体表面上的。
6.通常把固定相极性大于流动相极性的一类色谱称为正相色谱。
反之称为反相色谱。
7.高效液相色谱仪通常由储液器、输液泵、梯度淋洗器、进样器、色谱柱、检测器、色谱工作站七部分组成。
8.高效液相色谱仪中使用最广泛的检测器为紫外检测器，另外还有折光检测器、荧光检测器等等。
9.高效液相色谱主要用于分析沸点高的、分子量大的、受热易分解的以及具有生理活性物质的分析。
二、判断题√、√、⨯、⨯、√、√、⨯、√、⨯、√、⨯、√、√、⨯、√、⨯、⨯、√、⨯、√、√、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、√、⨯1．液一液色谱流动相与被分离物质相互作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的改变。
（√）2．利用离子交换剂作固定相的色谱法称为离子交换色谱法。
（√）3．紫外吸收检测器是离子交换色谱法通用型检测器。
（×）4．检测器性能好坏将对组分分离产生直接影响。
（×）5．高效液相色谱适用于大分子，热不稳定及生物试样的分析。
（√）6．高效液相色谱中通常采用调节分离温度和流动相流速来改善分离效果。
（×）7．键合固定相具有机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。
（√）8．在液相色谱中为避免固定相的流失，流动相与固定相的极性差别越大越好。
（×）9．正相分配色谱的流动相极性大于固定相极性。
高效液相色谱分析原理及流程
高效液相色谱分析原理及流程高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。
通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。
所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。
这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。
而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。
高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。
近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。
世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。
高效液相色谱分析原理(一)高效液相色谱分析的流程由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
(二)高效液相色谱的分离过程同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
高效液相色谱分析法.ppt
3.固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其 选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱 的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。
二、分离类型选择
choice of separation types
三、 HPLC的应用
application of HPLC
影响分离的因素与操作条件的选择 一、影响分离的因素
factors influenced separation
1.
•
影响分离的因素与提高柱效的途径
在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一， H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。
则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：
3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使 保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳> 环己烷>己烷>煤油(最小)
电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。
五、 离子对色谱(Ion pair chromatography)
原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（ 对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏 水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配； 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢 氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对 离子； 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有 对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入 流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。
高效液相色谱法(2021年整理)
(完整)高效液相色谱法(word版可编辑修改)编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（(完整)高效液相色谱法(word 版可编辑修改)）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
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仪器分析练习题(二)——高效液相色谱法部分一、选择题1。
分离一组高聚物（分子量>2000）时最宜采用的色谱方法是( D ）A. 气固色谱B. 反相键合相色谱C。
离子交换色谱 D. 凝胶色谱2. Si—O—Si-C型的18烷基固定相可用于（ B ）A。
正相色谱 B。
反相色谱C．离子交换色谱 D。
空间排阻色谱3。
反相离子对色谱法分离试样组分时,随着对离子浓度的增大，组分的保留时间( A )。
A。
增大 B。
减小C。
不变 D. 不能确定4. 下列试剂中可作为正相色谱流动相的是（ C D )。
A. 水 B。
甲醇C．乙腈 D. 正已烷5. 在惰性担体表面健合上基团－SO3ˉ后的离子交换树脂称为（ B ）。
A．强碱性阳离子交换树脂 B. 强酸性阳离子交换树脂C．强碱性阴离子交换树脂 D. 强酸性阴离子交换树脂6. 分离一组高沸点的物质时最宜而是采用的色谱方法是( D )。
A。
气液色谱 B。
气固色谱C. 毛细管气相色谱D. 液相色谱7。
应用正相色谱法分析一组组分时，组分的出峰顺序为（ A ).A。
极性小的组分先出峰 B. 极性大的组分先出峰C. 分子量小的先出峰D. 分子量大的先出峰8. 火焰光度检测器是（ C ）检测器。
A. 通用型、质量型 B。
通用型、浓度型C。
选择型、质量型 D。
选择型、浓度型9。
分析化学高效液相色谱法
分析化学高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种分离和测定化学物质的重要分析方法，具有高分离效率、高灵敏度、宽线性范围和广泛的应用范围等优点。
下面将从仪器原理、工作原理和应用等方面对HPLC进行详细分析。
一、仪器原理：HPLC仪器主要由溶剂系统、进样器、柱温箱、液相分离柱、检测器和数据处理系统等组成。
1.溶剂系统：通常采用双头柱泵供应稳定的流动相。
溶剂通过比例调节阀混合形成所需的溶剂混合物。
2.进样器：它将少量的样品溶液注入到流动相中，通常使用自动进样器进行样品进样。
3.柱温箱：控制流动相的温度，以提高分离的效果。
柱温一般在室温到高温之间进行控制。
4.液相分离柱：是HPLC的核心部分，其中填充有液相固定相。
根据不同的分析目标和样品性质，可以选择不同类型的液相柱，如反相色谱柱、离子交换柱等。
5.检测器：常见的检测器有紫外-可见光谱检测器（UV-VIS）、荧光检测器、折射率检测器等。
根据不同化学物质的性质和要求，可以选择不同的检测器。
6.数据处理系统：包括记录和处理仪器所得到的信号。
常见的数据处理系统有计算机数据采集系统，可以进行数据的分析和处理，生成相应的色谱图。
二、工作原理：HPLC通过运用固定相与移动相之间的亲疏水性差异来实现化学物质的分离。
样品在液相中与固定相发生相互作用，不同化合物的相互作用程度不同，因此在液相中呈现出不同的流动速度。
根据样品分离的顺序，不同的化合物在一定时间内通过液相分离柱，进而被检测器检测到。
HPLC中的流动相一般由溶剂和缓冲液组成，并通过色谱柱中的固定相将待测试的物质分离开来。
其中，缓冲液（通常称为背后电解质）可以调节流动相的pH值，改变待测试物质的性质，从而影响其分离。
三、应用：HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全和生化分析等领域。
1.药物分析：HPLC可以用于药物分析中，以检测药物的含量、纯度和杂质成分。
药物的测定可以通过校准曲线来进行分析。
2.环境检测：HPLC可以用于环境监测中，例如水质分析、大气污染物分析等。
华理仪器分析总结
高效液相色谱
1. 液相色谱特点：高压、高速、高效、高灵敏度
应用范围：热不稳定、高沸点、离子型物质
2. 仪器流程 P83
高压泵：输送流动相
梯度洗提装置：程序控制流动相极性变化
进样装置：将样品瞬时注入色谱柱上端柱担体中心
色谱柱：分离
检测器 p86
示差折光
紫外
荧光
电导
适用范围
通用
选择性
高选择性
选择性
不 适 用 对紫 外 多环芳烃、VB、 离子型化合物 光 完 全 不吸 收 黄曲霉素、卟啉
分离酚类、芳硝基化合物，保留比 C-18 强
聚苯乙烯基 反相
pH 使用范围广，对部分分离峰形好，寿命长
相对分子质量 ＞2000
样品
相对分子质量 ＜2000
电位分析
溶于水——排阻色谱，水为流动相
不溶于水——排阻色谱，非水流动相 同系物——键合相色谱
不溶于水 异构体——液固色谱 分子大小差异——排阻色谱 反相键合相色谱
玻璃膜产生一电位差 E M
E试
E内
RT F
a ln H , 试 aH , 内
K
2.303RT F
pH 试
测量体系：pH 玻璃电极、饱和甘汞电极、试液、pH 计
3. 选择性系数 Ki，j：干扰离子 j 对欲测离子 i 的选择性系数，在其他条件相同时提供电位的
欲测离子活度 ai 和干扰离子 aj 的比值
能检测 ppb 级物质，适合于痕 Ppt 适合痕量分析 含 P、S 化合物
范围
量分析
含电负性原子或基团
有机物(不含 S、P 等)
的化合物
影 响 桥流 P37
气体流量 P39
载气纯度 99.99%
现代色谱法分析技术—高效液相色谱法(分析化学课件)
分析乙苯及二甲苯三个异构体的样品，用归一化法定量结果如下，计 算各组分百分含量。
组分 峰面积A 重量校正因子
乙苯 120 0.97
对二甲苯 75 1.00
间二甲苯 140 0.96
邻二甲苯 105 0.98
（乙苯21.15％；对二甲苯17.50％；间二甲苯31.35％；领二甲苯24.00％）
高效液相色谱定量分析方法 ——内标法
高效液相色谱定量分析方法
目录
01 面积归一化法
02 外标法
03 内标法
高效液相色谱定量分析方法
什么是定量分析方法
实质是搞清楚样品里各组分含量有多少的问题 。
高效液相色谱法：能将组分分离后再分析含量 。
高效液相色谱定量分析方法—案例
怎样测出食品中的添加剂是符合标准的呢？
高效液相色谱定量分析方法—案例
高效液相色谱定性分析方法
目录
01 高效液相色谱法定性分析原理
02 高效液相色谱法定性分析方法
高效液相色谱定性分析方法
天麻为天麻片的主药，怎么鉴别 天麻片里是否真正含有天麻呢？
功效 祛风除湿 舒筋通络 活血止痛
医学用途 治疗肢体拘挛 治疗手足麻木 治疗腰腿酸痛
高效液相色谱定性分析方法 01.定性分析原理
高效液相色谱定性分析方法
课后思考
复方感冒片里主要有伪麻黄碱、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、右美沙芬这四种成份，请你结合
前面所学知识，说一说如何采用高效液相色谱法定性鉴别这四种成份呢？ 如下图所示，这个样品中是否含有这四种有效成份呢？
高效液相色谱法概念
高效液相色谱法概述
一、高效液相色谱法简介
液相色谱分析是在经典的液体柱色 谱基础上，引入了气相色谱的理论；
华东理工大学仪器分析课件1 绪论
本课程的主要内容
色谱分析法
色谱分析基本原理 气相色谱法 高效液相色谱法
电化学分析法
电位分析法 极谱及伏安分析法 库仑分析法
光谱分析法
原子吸收光谱法 原子发射光谱法
如何学好这门课程？
参考书
《仪器分析教程》 北京大学化学系 北京大学出 版社 1997
Douglas A. Skoog, Donald M. West, F. James Holler. Fundamentals of Analytical Chemistry. 8th ed. Australia: Thomson-Brooks/Cole, 2004
根据混合物中不同物质在两相间作用 力的差异建立的分离分析方法
如气相色谱、液相色谱、超临界流体 色谱、毛细管电泳等
4.其它方法
热分析法
根据物质的质量、体积等性质与温度之 间的关系建立的分析方法
热重量法、差热分析、热导法等
质谱
测量被电离物质的质荷比进行分析 质谱
三、仪器分析的发展概况
刘志广 《仪器分析学习指导与综合练习》 高等 教育出版社 2005
如何学好这门课程？
1. 要求掌握常用仪器分析方法的原理 和仪器 的简单结构；
2. 要求初步具有根据分析的目的，结合学到 的各种仪器分析方法的特点、应用范围， 选择适宜的分析方法的能力。
3. 学习方法：纵向阅读，横向比较
分析化学的三次巨大变革
第一次变革
分析天平的发明 溶液理论的建立（四大平物理学和电子技术的发展为仪器分析奠定了
基础
第三次变革
计算机的发明，尤其微型计算机的发展，给仪器 分析带来 全新的革命。
前景展望
生命科学研究对分析化学提出高的要求。
高效液相色谱法分析(多菌灵)原始记录2
受理号：第1页，共页
检测项目
多菌灵
检测开始时间
年月日
检测依据
NY/T 1680-2009
检测结束时间
年月日
检测方法
高效液相色谱法
温度及相对湿度
℃％
仪器名称及型号
高效液相色谱仪
仪器编号
××/××-
FA2004电子天平
××/××-074
样品处理情况
按照NY/T 1680-2009对样品进行处理。
V--样品提取液体积，（mL）；m--样品质量，（g）；
V1--标准溶液的进样体积，（μL）；V2--样品溶液的进样体积，（μL）；
A1--样品测定液中多菌灵峰面积；A2---标准样中多菌灵峰面积；
f--稀释倍数，f=2。
计算结果保留两位有效数字；样品含量超过1mg/kg时保留三位有效数字。
质控
（自控）
混合标准使用液名称及浓度
多菌灵标准溶液：
仪器
检测条件
检测器：PDA检测器
色谱柱：C18反相柱
柱温：45.0 ℃
流速：1.0 mL/min
进样量：μL
波长：275 nm
流动相：甲醇+离子对试剂=40+60
单点
标液浓度（mg/L）
检出限
0.07mg/kg
定量限
/
峰面积（A）
空白样品
计算公式：w=
式中：w--样品中待测组分含量，（mg/kg）；c--标准溶液中多菌灵的浓度，（mg/L）；
情况
样品总数
平行样个数
质控样个数
仪器使用情况使用前：使用后：
检验人：复核人：审核人：
高效液相色谱法分析（多菌灵）原始记录续页第页，共页
东华大现代环境监测技术课件08高效液相色谱分析法
➢ 进样系统
常用的进样方式有三种：直接注射进样、停留进样和高 压六通阀进样。直接注射进样的优点是操作简便，并可获得 较高的检效，但这种方法不能承受高压。停留进样是在高压 泵停止供液，体系压力下降的情况下，将样品直接加到柱头。 这种进样方式操作不便，重现性差，仅在不得已时才采用。 高压六通阀进样的优点是进样量的可变范围大，耐高压，易 于自动化；缺点是容易造成谱峰柱前扩宽。
➢ 高压输液系统
由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组 成，核心部件是高压输液泵。
高压泵按其操作原理可分为恒流泵和恒压泵。恒流泵的 特点是在一定的操作条件下，输出的流量保持恒定，而与色 谱柱等引起的阻力变化无关。恒压泵与恒流泵不同，它能保 持输出压力恒定，而流量则随色谱系统阻力的变化而变化。 气动放大泵就是一种恒压泵。由于这类高压泵输液流速随色 谱系统的阻力而变化，导致保留时间的重现性差，所以目前 在分析上已较少使用。
第八章 高效液相色谱分析法
8.1 高效液相色谱仪
➢ 高压输液系统 ➢ 进样系统 ➢ 色谱柱 ➢ 检测系统 ➢ 附属系统
8.1 高效液相色谱仪
主要组成：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测 系统（如图示）。另外还有一些附属装置。
➢ 工作过程
高压泵将贮液罐的溶剂经进样器送入色谱柱中，然后从 检测器的出口流出。当欲分离样品从进样器进入时，流经进 样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离，然后依先后顺序 进入检测器。记录仪将进入检测器的信号记录下来，得到液 相色谱图。
➢ 色谱柱
在高效液相色谱中，色谱柱一般采用优质不锈钢管制作。 近年来，由于高效微型填料（3-10um）的普遍应用，考虑 管壁效应对柱效的影响，故一般采用管径粗（4-5mm），长 度短（10-50cm）的色谱柱。
华东理工大学仪器分析高效液相色谱法3
化学键合相色谱法 液固色谱法 离子对色谱法 离子色谱法 体积排阻色谱法
1. 化学键合相色谱法
（1）分离机理
正相键合相色谱法：固定相的极性大于流动相的极 性，适用于分离油溶性或水溶性的极性或强极性化 合物。 分配机理：分配系数 x为溶质，M为溶剂
[ SiO2 R NH 2 x] Kp [x M ]
Pˊ 0.1 4.0 5.8 5.1 10.2
xe
xd
xn
0.38 0.31 0.48 0.37
0.20
0.27
0.42 0.42 0.31 0.25
乙腈 甲醇 水
0.22 0.37
溶剂的选择原则
溶剂具有稳定的化学性质
溶剂的选择与使用的检测器要有相容性
溶剂的粘度要小
溶剂的沸点不能太低
聚苯乙烯基 反相
应用举例
（3）流动相
表征溶剂特性的重要参数
溶剂强度ε°：溶剂分子与吸附剂的亲合程度，ε° 越大，亲合力约大。 溶解度参数δ：衡量溶剂极性强度的指标，δ越大， 极性越强。是溶剂和溶质分子间色散力、偶极力、接 受质子或给予质子能力的总和。所以δ相近的混合溶 剂，它的选择性α不同。
（3）流动相
ε°越大，洗脱力越强。合适的洗脱强度可通 过混合溶剂来得到 硅胶为固定相时：以弱极性的正构烷烃为主体， 加入二氯甲烷等中等极性溶剂调节合适的洗脱
强度。
可用水对硅胶进行减活处理，或加入四氢呋喃、 乙腈、甲醇、异丙醇等改性剂
举例
（4）应用
Hale Waihona Puke 中等分子量的油溶性样品如油品、脂肪、
芳烃等
选择合适的液相色谱分离类型
高效液相色谱法用于品红DIR成色剂的制备分离
表１ 给出短程序与原程序测定时间及试剂消耗 比较。改进后的 程序可使分析时间从过去的 ２００ 分缩短至８５ 分。改进前后差异非常显著 ４．５ ．１ （ ００）分析试剂随分析时间的缩短而减少。 Ｐ ．１。 涞 所
用 的 茚 三 酮 试 剂 由 过 去 的 ２．ｍ／ 减 少 至 ０１ ｌ 样
制备分离得到的组分 又经Ｈ Ｌ ＰＣ分析（ 见图 ２， 已基本不含未反应的原料。
醇中， 检测波长２４ 。 ５ｎ ｍ
制备时采用甲醇洗脱， 流速 ５ ｌ ｉ， ｍ／ ｎ 压力 ｍ ４８ Ｐ， ．Ｍ ａ操作参数如下：
制集 备方 收式
仪器和试剂
法 国 ＧＬＯ Ｉ Ｎ梯度洗脱 自动分析系统 （ Ｓ 配 Ａ ＰＥ 型屏幕显示系统，２ 数据处理器，０ 程 ＰＬ ６０ ７４ 序软盘和 Ｈ Ｌ Ｃ Ｒ Ｍ 紫外分光光度检测器） ＯＯＨ Ｏ Ｅ ， Ｙ －１ ＷＧＣ８ 反相柱（ 天津化学试剂二厂填料， 中科院大
高效液相色谱法用于品红 ＤＲ成色剂的制备分离 Ｉ
阎 芳
（ 中国科 学院感 光化 学所， 北京 １００） ０１１
成色剂是彩色感光材料中的主要助剂， 曝光后 经显影可形成不同的影像。它们都是分子量较大的 复杂有机分子， 且合成路线冗长。 尽管产物经过重结 晶， 但仍然难免有一些未反应物或副产物杂质， 影响 产品质量。 例如在合成品红成色剂 Ｉ 总是存在相 时， 当多的原料 ， 二者化学性质相近， 用经典柱色谱技 术无法分开； 用制备薄层色谱， 由于其Ｒ 值相差极 ｆ 小， 分离也很困难。我们采用高效液相色谱制备分 离， 可以使产物达到很高的纯度要求。 品红成色剂的结构式为：
程序的改进
牛磺酸是一种 由胱 氨酸转化而来 的 － 氨基酸 。
［ 周成贵、 玮等， １ ］ 孙 色谱 ９４，７（９１ （）２４１９） ． ［ 周立东等， ２ ］ 《 大型精密仪器专业学习班讲义— 氨基 — 酸分析仪器和方法》 ， 广东省科委条件处，．， ８． Ｐ１１ ３ ９ ［ 沈仁权等， ３ ］ 《 基础生物化学》上 ， 海科学出版社，．９ Ｐ６，
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（2）固定相
离子交换剂，最常用的是乳胶薄壳型离子交换
树脂小球，根据功能基可分为：强酸型（磺酸 基团）、强碱型（季铵基）、弱酸型（羧酸）、 弱碱型（伯、仲、叔胺）
（3）流动相
双柱抑制型：分离阳离子，一般采用无机酸如 HCl ， HNO3 等；分离阴离子，一般采用NaOH、NaHCO3/NaCO3。 单柱非抑制型：分离阳离子，用低浓度的HCl，HNO3等；
化学键合相色谱法 液固色谱法 离子对色谱法 离子色谱法 体积排阻色谱法
1. 化学键合相色谱法
（1）分离机理
正相键合相色谱法：固定相的极性大于流动相的极 性，适用于分离油溶性或水溶性的极性或强极性化 合物。 分配机理：分配系数 x为溶质，M为溶剂
[ SiO2 R NH 2 x] Kp [x M ]
E AB
[ A B ]O , 萃取系数 [ AW ][ BW ]
[ A B ]O K E [ B ，分配系数 AB W] [ AW ] k E AB [ B ]
W
（2）固定相、流动相和离子对试剂
固定相：多为C18,C8反相键合相 流动相：以水为主的缓冲液，或水- 甲醇、水 -乙腈等混合溶剂
（2）固定相
Si 固 定 相 表 面 O Si O Si O OH OH C18H37SiCl3 OH 固 定 相 表 面 O Si O Si O O O Si C18H37 Si O
疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等 极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。
常用固定相
类型
C-18 C-8
5．检测系统
紫外检测器
示差折光检测器 荧光检测器 电导检测器
（1）紫外检测器
固定波长的紫外检测器
可变波长的紫外检测器
二极管阵列检测器
固定波长的紫外检测器
Z型流通池结构
可变波长的紫外检测器
二极管阵列检测器
二极管阵列检测器之三维图
二极管阵列检测器之Isoabsorbance Plot
往复泵原理示意图
往复泵
梯度洗提
梯度洗提
即程序控制流动相的组成，使在整个分离过程中，溶剂 强度按照特定的变化规律增加。 优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范 围内。
缺点：检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决
于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。
梯度洗提流程
溶剂A 溶剂B 溶剂A 溶剂B
反相键合相色谱法：固定相的极性小于流动相的极 性，适于分离非极性、极性和离子性化合物。应用 最广泛
反相键合相色谱法的疏溶剂 机理：
溶质进入极性流动相后，排挤 部分溶质分子，其疏水基团由 于流动相的斥力推动而直接与
非极性固定相上的烷基缔合，
构成单分子吸附层，这种作用 时可逆的。当流动相极性减小
时，这种疏溶剂斥力下降。
（1）分离机理
以固体吸附剂为固定相的液相色谱法。由于溶 质分子和流动相分子在吸附剂表面的吸附活性
中心上进行竞争吸附，这种竞争吸附形成不同
溶质在吸附剂表面的吸附、解吸平衡。平衡常
数的不同导致不同溶质得以分离。
（2）固定相
极性固定相：硅胶、氧化镁、氧化铝等 非极性固定相：活性炭、高分子多孔微球、 碳多孔微球等
响应特性
选择性检测器，如芳烃类化合物的检测
灵敏度高，可检测10-9g/mL的物质 线性范围宽，104-105 对温度及流动相的改变不敏感 适合梯度洗提
HPLC常规检测器
应用举例
波长的选择
（2）示差折光检测器
结构
响应特性
通用性检测器
低灵敏度
基线易受温度的影响
不适合梯度洗提
荧光检测器
结构
响应特性
选择性检测器。如PAH，蛋白质
高灵敏度，比紫外高约1000倍
适合梯度洗提
应用举例
电导检测器
结构
响应特性
选择性检测器，对离子型化合物有响应
灵敏度高 受温度的影响 不能梯度洗提
讨论：液相色谱检测器的选择
1. 2. 3.
4.
5.
6.
7.
葡萄糖产品的含量测定 地下水中酚类化合物的分析 矿泉水中无机阴离子的测定 痕量氨基酸的分析 去痛片中有效成分的分析 链烷基磺酸盐的测定 蛋白质的分子量测定
分离阴离子，可用苯甲酸及其盐、酒石酸、柠檬酸等
（4）应用
分析无机阴离子的首选方法
还可用于分析无机阳离子，有机酸、碱，糖 类、蛋白质等。
应用举例
5. 体积排阻色谱法（SEC）
(1) 分离原理
以多孔凝胶为固定相，利用精确控制的凝胶孔径， 使样品中不同分子大小的组分得以分离。
VR=V0+KD·Vp
分子量的测定
（2）固定相
软质凝胶：如交联葡聚糖等，水相分离生化体系， 适于低、中压操作 半刚性凝胶：较高交联度的苯乙烯、二乙烯苯共聚
物，有机相洗脱，可承受10Mpa的压力
硬质凝胶
高交联度苯乙烯、二乙烯苯共聚物：凝胶渗透色谱法
多孔球形硅胶：凝胶过滤色谱法、凝胶渗透色谱法
羟基化聚醚多孔微球：凝胶过滤色谱法
+
阴离子交换：树脂—NR3+Cl-+X-=树脂—NR3+X -+Cl
-
不同的离子与树脂离子的交换能力（亲和能力）不
同，亲和力越大，离子越难洗脱，从而得以分离。
离子交换色谱与离子色谱的分离原理一样
离子色谱最大的改进是解决了微量组分的检
测问题
双柱抑制型：在分离柱和检测器之间加一个化学抑制 器，其作用有二，一是降低淋洗液的背景电导，二 是增加被测离子的电导值，改善信噪比。灵敏度高。 单柱非抑制型：淋洗液直接进入电导检测器。简单、 分辨率较好。
分析成本
分离能力
低
与柱的类型有关
高
较高
3. 高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较
经典液相色谱法 高效液相色谱法
粒径(μm)
柱前压力(atm) 分析时间 (h) 色谱柱长度(cm) 柱效(块/m) 样品用量(g)
75-600
0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
3-50（常用5-10）
溶剂的纯度要高且价格便宜
正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、
氯仿等，己烷为主体，加入质子接受体乙醚
或甲基叔丁基醚，质子给予体氯仿，偶极溶
剂二氯甲烷
反相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙醇及 其混合物等，以水为主体，加入质子接受体 甲醇，质子给予体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。
应用举例
2. 液固色谱法
（3）流动相
ε°越大，洗脱力越强。合适的洗脱强度可通 过混合溶剂来得到 硅胶为固定相时：以弱极性的正构烷烃为主体， 加入二氯甲烷等中等极性溶剂调节合适的洗脱
强度。
可用水对硅胶进行减活处理，或加入四氢呋喃、 乙腈、甲醇、异丙醇等改性剂
举例
（4）应用
中等分子量的油溶性样品如油品、脂肪、
芳烃等
0<KD<1.0
洗脱体积在 V0 和 V0 +Vp 之间，峰容量有限， 10-12 个峰 用于分离分子大小差大于10%的样品
分离原理示意图
使用水溶液的凝胶过滤色谱法（GFC），主
要用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖等。
使用有机溶剂的凝胶渗透色谱法 (GPC) ，主
要用于高聚物（如聚乙烯、聚氯乙烯等）
H=A+B/u+Cu A=2λdp B→0 C=?
迁移的流动相的传质阻力
滞留的流动相的传质阻力
高效液相色谱中的速率方程
Cd Dm H 2d p ( u Dm
涡流扩散项 纵向扩散 流动相传质
2 Cm d p
2 Cs d p
Dm
Cs d 2 f Ds
)u
滞留区传质
固定相内传质
2. 对速率方程的讨论
20-300 0.05-1.0 2-30 104-105 10-6-10-2
4. 高效液相色谱法的特点
高压
高速
高效
高灵敏度
5. 应用举例
丹参 Radix Salviae Miltiorrhizae
丹参的HPLC指纹图谱
二、高效液相色谱理论基础
1. 高效液相色谱中的速率方程
离子对试剂：四丁基铵正离子、十六烷基三 甲基铵正离子，ClO4-，十二烷基磺酸根等
（3）应用
有机酸、有机碱特别是强酸
强碱的分析，如羧酸、磺酸、
胺类、酚类、药物、染料等
4. 离子色谱法
(1) 分离机理
试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生反应： 阳离子交换：树脂—SO3-H++M+=树脂—SO3-M ++H
（3）流动相
改善分离主要通过固定相来实现。流动相的选
择原则是：溶解样品、与凝胶浸润、与检测器
匹配、粘度小。如四氢呋喃；缓冲溶液
（4）应用
大分子的分离分析 聚合物分子量分布的测定
应用举例
1.聚乙二醇40000
3.聚乙二醇3000
2.聚乙二醇10000 4.聚乙二醇1000 5.聚乙二醇
6. 液相色谱分离类型及条件选择
极性参数P’：溶剂与乙醇、二氧六环、硝基甲烷相 互作用的度量，比较全面的反映了溶剂的性质。