TAKARA公司的5' full RACE说明书
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TaKaRa Code：D315
5’-Full RACE Kit
(10 次量)
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内容
页码
●制品说明
1
wk.baidu.com
●制品内容
1
●保存
2
●试剂盒原理
2
●特异性引物的设计要求
3
●试剂盒特点
3
●RNA 样品制备
3
●试剂盒使用注意
4
●使用 Control HL60 Total RNA 时的 5′RACE 实验例 4
●实验样品的 5′RACE 操作方法
【试剂配制】 用于 RNA 实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，3 小时以上）或用上述方法进行 DEPC 水处理灭菌后 的玻璃容器盛装（也可使用 RNA 实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用 0.1%的 DEPC 处理后进 行高温高压灭菌。RNA 实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。
引物序列（5’→ 3’） CATGGCTACATGCTGACAGCCTA CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG AGGTAGGTGATGTTCCGAGAGCGT TTGGAGTCGCCCTCAGCAGAGAT
长度 23 mers 34 mers 24 mers 23 mers
2． 同时进行几个样品的反应时，应先配制各种试剂的混合液（Master Mix），然后再分装到每个反应管 中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实 验操作或实验之间产生的误差。
3． 使用Alkaline Phosphatase（Calf intestine）、Tobacco Acid Pyrophosphatase、T4 RNA Ligase、 Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）和RNase Inhibitor等酶类时，应轻轻混匀，避免起 泡，分取之前要小心离心收集到反应管底部。由于酶粘度高，分取时应慢慢吸取。
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前请一定认真阅读！
1． 进行 5′RACE 实验时，为提高 RACE 结果的可信度，应同时进行 TAP（-）和 M-MLV（-）的负对 照实验。TAP（-）即：RNA 经去磷酸化反应后不进行 TAP 处理，直接进行 5′RACE Adaptor 的 连接及后续实验，以验证 RNA 去磷酸化是否充分。如果充分，RT-PCR 将不能扩增。但是，真正进 行 TAP（-）负对照实验时，由于不能保证 100%的去磷酸化，往往会有 RT-PCR 扩增结果，但其扩 增片段长度一般不同于目的片段。M-MLV（-）即：5′RACE Adaptor 连接反应后进行 RT 反应时 不添加 M-MLV，以排除基因组 DNA 污染造成的假阳性结果。如果 M-MLV（-）的负对照实验没有 特异性扩增，说明 5′RACE 结果来源于 mRNA。
●RNA 样品制备
本试剂盒是扩增 cDNA 5′末端全长的试剂盒。RNA 的完整性和纯度会影响 5′RACE 的结果。而制备 RNA 的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的 RNA 分解酶的污染。因此，在实 验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套，使用 RNA 操作专用实验台，在操作过程中避免讲话等等。 通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。
不能形成复杂结构。 4. 引物 3′端的 3～4 个碱基不要与配对引物形成互补序列。
●试剂盒特点
原理
RNA 模板 基因种类 扩增片段大小 反转录酶 扩增特点
使用 Tobacco Acid Pyrophosphatase 去掉 mRNA 的 5′帽子结构，连接接头后 进行 cDNA 5′末端的全长扩增。 适用于所有真核生物的 Total RNA。 可适用于丰度较低或者较难扩增的基因。 最长能得到 3.2 kbp 的 PCR 扩增产物。 Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）无RNase H活性，反转录能力强。 采用 Nested PCR 方法，大大提高了 PCR 扩增的特异性及灵敏度。
6 μl 50 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 80 μl 200 μl 400 μl 40 μl 32.5 μl 2.5 μl 20 μl 10 μl
5 μl 2×1 ml
For 5′RACE PCR Reactions（50 次量）：
1×cDNA Dilution Buffer II 5′RACE Outer Primer（10 μM） 5′RACE Inner Primer（10 μM）
【本试剂盒以外需要自备试剂】
① 扩增目的基因的下游特异性引物。 ② PCR用DNA聚合酶。推荐使用扩增性能良好的TaKaRa LA Taq®（TaKaRa Code：DRR02AM）或
保真性能极高的PrimeSTAR™ HS DNA Polymerase（TaKaRa Code：DR010）。 ③ PCR 产物克隆试剂（如：T 载体等）。 ④ 苯酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）。 ⑤ 氯仿。 ⑥ 异丙醇。 ⑦ 100%预冷乙醇。 ⑧ 70%预冷乙醇。
●保存: -20℃
●试剂盒原理
5′-Full RACE 的扩增原理图
-2-
【操作步骤】 1. 使用 Alkaline Phosphatase（Calf intestine）［简称 CIAP］去掉 Total RNA 中裸露的 5′磷酸基团。 2. 使用 Tobacco Acid Pyrophosphatase ［简称 TAP］去掉 mRNA 的 5′帽子结构，保留一个磷酸基
特异性引物 GSP2 和 5′RACE Inner Primer 进行 Inner PCR 反应。PCR 产物可以进行 DNA 克隆 或直接进行 DNA 测序。
●特异性引物的设计要求
请使用引物设计专用软件进行设计，大体要求如下： 1. 引物长度以 20-28 nt 为宜。 2. 引物中的 GC 含量一般为 45%-55％，GC、AT 分布均匀，应尽量避免局部富含 GC 或 AT。 3. 引物最好不形成二级结构（发夹结构等），与 5′RACE Outer Primer 和 5′RACE Inner Primer
-3-
【使用器具】 尽量使用一次性塑料器材，若用玻璃器材时应在使用前按下列方法进行处理。 （1）用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37℃下处理 12 小时。 （2）然后在 120℃下高压灭菌 30 分钟以除去残留的 DEPC。 RNA 实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其他实验。
5 μl 10 μl 10 μl
* 1 此 Buffer 带有颜色，长时间保存有时会产生沉淀，请离心后取上清使用，不会影响反应性能。 * 2 用于扩增 Human Prohibitin（PHB）基因 5′末端约 750 bp 的 DNA 片段。
-1-
【各种引物序列】
引物名称 5′RACE Outer Primer 5′RACE Inner Primer 5′RACE Control Outer Primer 5′RACE Control Inner Primer
行 5′RACE 实验。 3． 高特异性的 5′RACE 扩增。套式 PCR 法的使用，大大提高了 5′RACE DNA 片段扩增的特异性。
4． 长片段 5′RACE扩增。试剂盒中使用了本公司特殊改良的M-MLV（RNase H-）反转录酶，反转录性
能良好，使长片段的RT-PCR扩增成为了可能。
●制品内容（10 次量）
【制备方法】 推荐使用TaKaRa RNAiso Reagent系列产品或其他RNA提取试剂或试剂盒进行RNA的提取。使用 Catrimox-14TM RNA Isolation Kit Ver.2.11（TaKaRa Code：DWA005）可从血液中快速提取高纯度 的Total RNA。
●试剂盒使用注意
For RNA Treated Reactions（10 次量）：
Alkaline Phosphatase（Calf intestine）（16 U/μl） 10×Alkaline Phosphatase Buffer（MgCl2 Free） Tobacco Acid Pyrophosphatase（0.5 U/μl） 10×TAP Reaction Buffer 5′RACE Adaptor（15 μM） T4 RNA Ligase（40 U/μl） 5×RNA Ligation Buffer*1 40% PEG#6000 3 M CH3COONa（pH5.2） NA Carrier RNase Inhibitor（40 U/μl） Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）（200 U/μl） 5×M-MLV Buffer dNTP Mixture（10 mM each） Random 9 mers（50 μM） RNase Free dH2O
400 μl 100 μl 100 μl
For Control Reactions（5 次量）：
Control HL60 Total RNA（1 μg /μl）*2 5′RACE Control Outer Primer（10 μM）*2 5′RACE Control Inner Primer（10 μM）*2
团。 3. 使用 T4 RNA Ligase 将 5′RACE Adaptor 连接到去帽后的 mRNA 上。 4. 以上述 3 的mRNA作为模板，使用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-），Random 9 mers
进行反转录反应合成cDNA。 5. 使用下游外侧特异性引物 GSP1 和 5′RACE Outer Primer 进行 Outer PCR 反应，再使用下游内侧
8
●实验例
11
●Q&A
11
●制品说明
本试剂盒是高灵敏度、高特异性扩增 cDNA 5′末端全长的试剂盒。使用 RT-PCR 方法扩增目的 DNA 时， 一般很难得到全长的 cDNA 片段，在基因工程研究中，分析遗传基因的全长 cDNA 序列十分重要。RACE （Rapid Amplification of cDNA Ends）法能有效解决这一问题。TaKaRa 5′-Full RACE Kit 能够通过 已知的 cDNA 序列，高灵敏度、高特异性地扩增 cDNA 的 5′末端的全长序列。 本试剂盒应用了“去帽法”原理，Tobacco Acid Pyrophosphatase（TAP）可以去掉 mRNA 的 5′帽子 结构，使用 T4 RNA Ligase 将 5′RACE Adaptor 连接到 mRNA 的 5′端后，可以使用 5′RACE Adaptor 上的引物与已知序列部分的引物进行 RT-PCR 反应，高特异性地扩增 cDNA 5′末端的全长序列。 本试剂盒中含有完成 5′RACE操作的主要试剂。试剂盒中使用的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）经过了本公司的特殊改良，反转录性能良好，无RNase H活性，大大增加了反转录性能。结合使用 TaKaRa LA Taq®（TaKaRa Code：DRR02AM）进行PCR扩增时，其 5′RACE的扩增性能大大优于其 他同类产品。 本试剂盒应用了套式PCR原理，增加了PCR扩增的特异性与灵敏度，可以对少量样品或低丰度的基因进行 5′RACE实验，并且对长片段的 5′RACE扩增具有明显优势。5′RACE Inner Primer中含有BamH I 酶切位点，为克隆提供了方便。使用TaKaRa LA Taq®扩增得到的PCR产物的 3′端附有一个“A”碱基， 可直接克隆于T-Vector中。试剂盒中提供的Control HL60 Total RNA可作为Control RNA，使用Control Primer可扩增Human Prohibitin（PHB）基因 5′末端约 750 bp的DNA片段。 本试剂盒具有以下特点： 1． 扩增 cDNA 的 5′末端全长序列。应用了“去帽法”原理，可以有效扩增 cDNA 的 5′末端全长序列。 2． 高灵敏度的 5′RACE 扩增。采用了套式 PCR 法，对低丰度的基因或极少量的 RNA 样品同样可以进
5’-Full RACE Kit
(10 次量)
目录
内容
页码
●制品说明
1
wk.baidu.com
●制品内容
1
●保存
2
●试剂盒原理
2
●特异性引物的设计要求
3
●试剂盒特点
3
●RNA 样品制备
3
●试剂盒使用注意
4
●使用 Control HL60 Total RNA 时的 5′RACE 实验例 4
●实验样品的 5′RACE 操作方法
【试剂配制】 用于 RNA 实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，3 小时以上）或用上述方法进行 DEPC 水处理灭菌后 的玻璃容器盛装（也可使用 RNA 实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用 0.1%的 DEPC 处理后进 行高温高压灭菌。RNA 实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。
引物序列（5’→ 3’） CATGGCTACATGCTGACAGCCTA CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG AGGTAGGTGATGTTCCGAGAGCGT TTGGAGTCGCCCTCAGCAGAGAT
长度 23 mers 34 mers 24 mers 23 mers
2． 同时进行几个样品的反应时，应先配制各种试剂的混合液（Master Mix），然后再分装到每个反应管 中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实 验操作或实验之间产生的误差。
3． 使用Alkaline Phosphatase（Calf intestine）、Tobacco Acid Pyrophosphatase、T4 RNA Ligase、 Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）和RNase Inhibitor等酶类时，应轻轻混匀，避免起 泡，分取之前要小心离心收集到反应管底部。由于酶粘度高，分取时应慢慢吸取。
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前请一定认真阅读！
1． 进行 5′RACE 实验时，为提高 RACE 结果的可信度，应同时进行 TAP（-）和 M-MLV（-）的负对 照实验。TAP（-）即：RNA 经去磷酸化反应后不进行 TAP 处理，直接进行 5′RACE Adaptor 的 连接及后续实验，以验证 RNA 去磷酸化是否充分。如果充分，RT-PCR 将不能扩增。但是，真正进 行 TAP（-）负对照实验时，由于不能保证 100%的去磷酸化，往往会有 RT-PCR 扩增结果，但其扩 增片段长度一般不同于目的片段。M-MLV（-）即：5′RACE Adaptor 连接反应后进行 RT 反应时 不添加 M-MLV，以排除基因组 DNA 污染造成的假阳性结果。如果 M-MLV（-）的负对照实验没有 特异性扩增，说明 5′RACE 结果来源于 mRNA。
●RNA 样品制备
本试剂盒是扩增 cDNA 5′末端全长的试剂盒。RNA 的完整性和纯度会影响 5′RACE 的结果。而制备 RNA 的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的 RNA 分解酶的污染。因此，在实 验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套，使用 RNA 操作专用实验台，在操作过程中避免讲话等等。 通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。
不能形成复杂结构。 4. 引物 3′端的 3～4 个碱基不要与配对引物形成互补序列。
●试剂盒特点
原理
RNA 模板 基因种类 扩增片段大小 反转录酶 扩增特点
使用 Tobacco Acid Pyrophosphatase 去掉 mRNA 的 5′帽子结构，连接接头后 进行 cDNA 5′末端的全长扩增。 适用于所有真核生物的 Total RNA。 可适用于丰度较低或者较难扩增的基因。 最长能得到 3.2 kbp 的 PCR 扩增产物。 Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）无RNase H活性，反转录能力强。 采用 Nested PCR 方法，大大提高了 PCR 扩增的特异性及灵敏度。
6 μl 50 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 80 μl 200 μl 400 μl 40 μl 32.5 μl 2.5 μl 20 μl 10 μl
5 μl 2×1 ml
For 5′RACE PCR Reactions（50 次量）：
1×cDNA Dilution Buffer II 5′RACE Outer Primer（10 μM） 5′RACE Inner Primer（10 μM）
【本试剂盒以外需要自备试剂】
① 扩增目的基因的下游特异性引物。 ② PCR用DNA聚合酶。推荐使用扩增性能良好的TaKaRa LA Taq®（TaKaRa Code：DRR02AM）或
保真性能极高的PrimeSTAR™ HS DNA Polymerase（TaKaRa Code：DR010）。 ③ PCR 产物克隆试剂（如：T 载体等）。 ④ 苯酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）。 ⑤ 氯仿。 ⑥ 异丙醇。 ⑦ 100%预冷乙醇。 ⑧ 70%预冷乙醇。
●保存: -20℃
●试剂盒原理
5′-Full RACE 的扩增原理图
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【操作步骤】 1. 使用 Alkaline Phosphatase（Calf intestine）［简称 CIAP］去掉 Total RNA 中裸露的 5′磷酸基团。 2. 使用 Tobacco Acid Pyrophosphatase ［简称 TAP］去掉 mRNA 的 5′帽子结构，保留一个磷酸基
特异性引物 GSP2 和 5′RACE Inner Primer 进行 Inner PCR 反应。PCR 产物可以进行 DNA 克隆 或直接进行 DNA 测序。
●特异性引物的设计要求
请使用引物设计专用软件进行设计，大体要求如下： 1. 引物长度以 20-28 nt 为宜。 2. 引物中的 GC 含量一般为 45%-55％，GC、AT 分布均匀，应尽量避免局部富含 GC 或 AT。 3. 引物最好不形成二级结构（发夹结构等），与 5′RACE Outer Primer 和 5′RACE Inner Primer
-3-
【使用器具】 尽量使用一次性塑料器材，若用玻璃器材时应在使用前按下列方法进行处理。 （1）用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37℃下处理 12 小时。 （2）然后在 120℃下高压灭菌 30 分钟以除去残留的 DEPC。 RNA 实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其他实验。
5 μl 10 μl 10 μl
* 1 此 Buffer 带有颜色，长时间保存有时会产生沉淀，请离心后取上清使用，不会影响反应性能。 * 2 用于扩增 Human Prohibitin（PHB）基因 5′末端约 750 bp 的 DNA 片段。
-1-
【各种引物序列】
引物名称 5′RACE Outer Primer 5′RACE Inner Primer 5′RACE Control Outer Primer 5′RACE Control Inner Primer
行 5′RACE 实验。 3． 高特异性的 5′RACE 扩增。套式 PCR 法的使用，大大提高了 5′RACE DNA 片段扩增的特异性。
4． 长片段 5′RACE扩增。试剂盒中使用了本公司特殊改良的M-MLV（RNase H-）反转录酶，反转录性
能良好，使长片段的RT-PCR扩增成为了可能。
●制品内容（10 次量）
【制备方法】 推荐使用TaKaRa RNAiso Reagent系列产品或其他RNA提取试剂或试剂盒进行RNA的提取。使用 Catrimox-14TM RNA Isolation Kit Ver.2.11（TaKaRa Code：DWA005）可从血液中快速提取高纯度 的Total RNA。
●试剂盒使用注意
For RNA Treated Reactions（10 次量）：
Alkaline Phosphatase（Calf intestine）（16 U/μl） 10×Alkaline Phosphatase Buffer（MgCl2 Free） Tobacco Acid Pyrophosphatase（0.5 U/μl） 10×TAP Reaction Buffer 5′RACE Adaptor（15 μM） T4 RNA Ligase（40 U/μl） 5×RNA Ligation Buffer*1 40% PEG#6000 3 M CH3COONa（pH5.2） NA Carrier RNase Inhibitor（40 U/μl） Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）（200 U/μl） 5×M-MLV Buffer dNTP Mixture（10 mM each） Random 9 mers（50 μM） RNase Free dH2O
400 μl 100 μl 100 μl
For Control Reactions（5 次量）：
Control HL60 Total RNA（1 μg /μl）*2 5′RACE Control Outer Primer（10 μM）*2 5′RACE Control Inner Primer（10 μM）*2
团。 3. 使用 T4 RNA Ligase 将 5′RACE Adaptor 连接到去帽后的 mRNA 上。 4. 以上述 3 的mRNA作为模板，使用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-），Random 9 mers
进行反转录反应合成cDNA。 5. 使用下游外侧特异性引物 GSP1 和 5′RACE Outer Primer 进行 Outer PCR 反应，再使用下游内侧
8
●实验例
11
●Q&A
11
●制品说明
本试剂盒是高灵敏度、高特异性扩增 cDNA 5′末端全长的试剂盒。使用 RT-PCR 方法扩增目的 DNA 时， 一般很难得到全长的 cDNA 片段，在基因工程研究中，分析遗传基因的全长 cDNA 序列十分重要。RACE （Rapid Amplification of cDNA Ends）法能有效解决这一问题。TaKaRa 5′-Full RACE Kit 能够通过 已知的 cDNA 序列，高灵敏度、高特异性地扩增 cDNA 的 5′末端的全长序列。 本试剂盒应用了“去帽法”原理，Tobacco Acid Pyrophosphatase（TAP）可以去掉 mRNA 的 5′帽子 结构，使用 T4 RNA Ligase 将 5′RACE Adaptor 连接到 mRNA 的 5′端后，可以使用 5′RACE Adaptor 上的引物与已知序列部分的引物进行 RT-PCR 反应，高特异性地扩增 cDNA 5′末端的全长序列。 本试剂盒中含有完成 5′RACE操作的主要试剂。试剂盒中使用的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）经过了本公司的特殊改良，反转录性能良好，无RNase H活性，大大增加了反转录性能。结合使用 TaKaRa LA Taq®（TaKaRa Code：DRR02AM）进行PCR扩增时，其 5′RACE的扩增性能大大优于其 他同类产品。 本试剂盒应用了套式PCR原理，增加了PCR扩增的特异性与灵敏度，可以对少量样品或低丰度的基因进行 5′RACE实验，并且对长片段的 5′RACE扩增具有明显优势。5′RACE Inner Primer中含有BamH I 酶切位点，为克隆提供了方便。使用TaKaRa LA Taq®扩增得到的PCR产物的 3′端附有一个“A”碱基， 可直接克隆于T-Vector中。试剂盒中提供的Control HL60 Total RNA可作为Control RNA，使用Control Primer可扩增Human Prohibitin（PHB）基因 5′末端约 750 bp的DNA片段。 本试剂盒具有以下特点： 1． 扩增 cDNA 的 5′末端全长序列。应用了“去帽法”原理，可以有效扩增 cDNA 的 5′末端全长序列。 2． 高灵敏度的 5′RACE 扩增。采用了套式 PCR 法，对低丰度的基因或极少量的 RNA 样品同样可以进