最新1分子生物学第六章-基因重组
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• 举例：
l噬菌体插入细菌基因组 l噬菌体从细菌基因组中切离
Site-specific recombination: ( 位点专一性重组） bacteriophage l insertion
1. l-encoded integrase (Int 整合酶): makes staggeredcuts 交错切点in the specific sites （15bp seq）
◆
DNA与其互补物在双链上快速配对反
应，产生异源双链连接
◆
，产生一个长的异
源双链DNA区带。
• SSB(单链结合蛋白)的存在刺激了这个反应
RecA catalyzes single-strand assimilation
RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end.
3. RecA-ssDNA filaments search the opposite DNA duplex for corresponding sequence (invasion).
4. Seal the nicks and form a four-branched Holliday structure
Haploid prokaryotes (单倍体生物原核同源重组）
Between the two homologous DNA duplex (where) • partially duplicated DNA of the chromosome • between chromosomal DNA and “foreign” DNA
• 一个链与另一个链 的连接点叫做重组 关节。
• 重组关节能沿着 DNA双链分子移动， 这种移动叫做枝状 迁移
• 在一条链被另一条 链取代的过程中， 分叉点可以沿任一 个方向移动
• 交差分子旋转 后形成一个平 面结构-----Holliday结构
细菌基国重组中的单链同化作用
single-strand assimilation
• Chi序列能刺激它周围附近的重组：
•
5’GCTGGTGG 3’
•
3’CGACCΒιβλιοθήκη BaiduCC 5’
• Chi序列在大肠杆菌中每5—10kb出现一次
• Chi是一个被RecBCD基因编码的酶的作用目标。
•RecBCD是有强烈降解DNA能力的核酸酶，在SSB存在 下，有解开DNA双链的酶活性和ATP酶活性，它在重组 中所起的作用便是提供带有自由3’端的单链DNA。
1分子生物学第六章-基因重组
遗传重组
• 重组recombination: 是已存在的遗传物质 产生新的组合的过程。
• 分子间或染色体间重组：离散的染色体混 合时产生新的组合。如真核染色体减数分 裂时的染色体独立分配。不依赖酶。
• 分子内或染色体内重组：通过DNA的剪切 和连接产生新的染色体类型。依赖酶。
5. Branch migration & resolving Holliday junction
Haploid prokaryotes (原核同源重组）
Resolving Holliday junction
二、位点专一性重组
• 非序列同源性 • 重组位点特异 • 由识别特异重组位点的酶指导 • 导致DNA序列发生重排
• 重组过程是可逆的， 但反应条件不同： 整合反应需要int产 物 和 IHF 因 子 ； 移 除反应还需要噬菌 体xis基因产物。
• xis基因产物决定噬 菌体是否进行复制
整合的过程:
A. 具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与 attP和attB位点结合；
B. Int的拓扑异构酶活性，使两条双链各自 断开一条单链，瞬间旋转然后交换连接， 形成Holliday中间提，
How: Holliday model
1. Nicks made near Chi (GCTGGTGG/each 4 kb) sites by a nuclease with recBCD.
2. RecA binds to ssDNA to form RecA-ssDNA.
Haploid prokaryotes (原核同源重组）
• RecA介导的DNA修复
重组热点
• 重组起始于双链破损。双链破损在轴素形成期 产生，在联会丝复合物形成阶断消失(~60min)
• 在染色体上容易发生双链破损的位点，称为重 组热点。
Chi序列刺激它周围附近的重组
• 与重组有关的基因称为Rec基因
• Rec突变体不能进行同源重组
• 大约10～20个与重组有关的DNA位点通过E. coli 的Rec基因突变体鉴定
2. Int and IHF (integration host factor encoded by bacteria): recombination and insertion
3. l-encoded excisionase (XIS): excision of the phage DNA
• 整合过程要求在 attp和attB之间进 行识别；而移除过 程则需要在attL和 attR之间进行识别
• DNA分子的单链部分通过碱基互补配对转移到 另一DNA双链分子中，称为单链吸收或单链同 化。
• 有三个必备条件：
◆
DNA分子必须有单链区
◆
DNA分子必须有自由3’端
◆
3’端必须设置在两分子互补区内
RecA催化单链的同化作用
• RecA催化单、双链DNA的反应分为三个阶段：
◆ RecA在单链DNA上慢慢聚合。
• 染色体的重 组包含部分 的物理性的 改变：破损 与再联合
两条DNA双链 分子的联接作 用是基因重组 的关健环节
细线期 偶线期 粗线期 双线期
终变期
在DNA双 链中制造 一个破损
同化作用
• 同源染色体两对 DNA双链在相应点 产 生 nick ， 一 条 单 链离开它的伙伴， 与另一个双链分子 的相应位置倒易位 置，创造了两个 DNA双链之间的连 系，这种连接在一 起的一对双链叫做 交差分子。
l噬菌体插入细菌基因组 l噬菌体从细菌基因组中切离
Site-specific recombination: ( 位点专一性重组） bacteriophage l insertion
1. l-encoded integrase (Int 整合酶): makes staggeredcuts 交错切点in the specific sites （15bp seq）
◆
DNA与其互补物在双链上快速配对反
应，产生异源双链连接
◆
，产生一个长的异
源双链DNA区带。
• SSB(单链结合蛋白)的存在刺激了这个反应
RecA catalyzes single-strand assimilation
RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end.
3. RecA-ssDNA filaments search the opposite DNA duplex for corresponding sequence (invasion).
4. Seal the nicks and form a four-branched Holliday structure
Haploid prokaryotes (单倍体生物原核同源重组）
Between the two homologous DNA duplex (where) • partially duplicated DNA of the chromosome • between chromosomal DNA and “foreign” DNA
• 一个链与另一个链 的连接点叫做重组 关节。
• 重组关节能沿着 DNA双链分子移动， 这种移动叫做枝状 迁移
• 在一条链被另一条 链取代的过程中， 分叉点可以沿任一 个方向移动
• 交差分子旋转 后形成一个平 面结构-----Holliday结构
细菌基国重组中的单链同化作用
single-strand assimilation
• Chi序列能刺激它周围附近的重组：
•
5’GCTGGTGG 3’
•
3’CGACCΒιβλιοθήκη BaiduCC 5’
• Chi序列在大肠杆菌中每5—10kb出现一次
• Chi是一个被RecBCD基因编码的酶的作用目标。
•RecBCD是有强烈降解DNA能力的核酸酶，在SSB存在 下，有解开DNA双链的酶活性和ATP酶活性，它在重组 中所起的作用便是提供带有自由3’端的单链DNA。
1分子生物学第六章-基因重组
遗传重组
• 重组recombination: 是已存在的遗传物质 产生新的组合的过程。
• 分子间或染色体间重组：离散的染色体混 合时产生新的组合。如真核染色体减数分 裂时的染色体独立分配。不依赖酶。
• 分子内或染色体内重组：通过DNA的剪切 和连接产生新的染色体类型。依赖酶。
5. Branch migration & resolving Holliday junction
Haploid prokaryotes (原核同源重组）
Resolving Holliday junction
二、位点专一性重组
• 非序列同源性 • 重组位点特异 • 由识别特异重组位点的酶指导 • 导致DNA序列发生重排
• 重组过程是可逆的， 但反应条件不同： 整合反应需要int产 物 和 IHF 因 子 ； 移 除反应还需要噬菌 体xis基因产物。
• xis基因产物决定噬 菌体是否进行复制
整合的过程:
A. 具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与 attP和attB位点结合；
B. Int的拓扑异构酶活性，使两条双链各自 断开一条单链，瞬间旋转然后交换连接， 形成Holliday中间提，
How: Holliday model
1. Nicks made near Chi (GCTGGTGG/each 4 kb) sites by a nuclease with recBCD.
2. RecA binds to ssDNA to form RecA-ssDNA.
Haploid prokaryotes (原核同源重组）
• RecA介导的DNA修复
重组热点
• 重组起始于双链破损。双链破损在轴素形成期 产生，在联会丝复合物形成阶断消失(~60min)
• 在染色体上容易发生双链破损的位点，称为重 组热点。
Chi序列刺激它周围附近的重组
• 与重组有关的基因称为Rec基因
• Rec突变体不能进行同源重组
• 大约10～20个与重组有关的DNA位点通过E. coli 的Rec基因突变体鉴定
2. Int and IHF (integration host factor encoded by bacteria): recombination and insertion
3. l-encoded excisionase (XIS): excision of the phage DNA
• 整合过程要求在 attp和attB之间进 行识别；而移除过 程则需要在attL和 attR之间进行识别
• DNA分子的单链部分通过碱基互补配对转移到 另一DNA双链分子中，称为单链吸收或单链同 化。
• 有三个必备条件：
◆
DNA分子必须有单链区
◆
DNA分子必须有自由3’端
◆
3’端必须设置在两分子互补区内
RecA催化单链的同化作用
• RecA催化单、双链DNA的反应分为三个阶段：
◆ RecA在单链DNA上慢慢聚合。
• 染色体的重 组包含部分 的物理性的 改变：破损 与再联合
两条DNA双链 分子的联接作 用是基因重组 的关健环节
细线期 偶线期 粗线期 双线期
终变期
在DNA双 链中制造 一个破损
同化作用
• 同源染色体两对 DNA双链在相应点 产 生 nick ， 一 条 单 链离开它的伙伴， 与另一个双链分子 的相应位置倒易位 置，创造了两个 DNA双链之间的连 系，这种连接在一 起的一对双链叫做 交差分子。