第六章 重组体克隆的筛选和鉴定
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只有带有插入片断的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
Southern blot 筛选
结果
（1）原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
（2）R-环检测法
1）原理： DNA-RNA杂交。
2）选择过程
用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
2. 过程
凝胶放射自显影
硝酸纤 载体和插 维素滤膜 入的cDNA
总mRNA
杂交
硝酸纤 载体和插 cDNA基因的 维素滤膜 入的cDNA mRNA
洗脱
cDNA编 码的蛋白
电泳
cDNA编 码的蛋白
硝酸纤 载体和插 维素滤膜 入的cDNA
cDNA基因的
mRNA
体外翻译
收集
35S标记的氨基酸
五、DNA-蛋白质相互作用筛选法
专门设计检测能同DNA特异结合的蛋 白质因子。
硝 待测蛋白质
酸
能与蛋白质结 合的DNA序列
放射性标记
纤
维
硝
素
酸
滤
纤
膜
维
素 滤
待测蛋白质
能与蛋白质结 合的DNA序列
放射性标记
膜
一般克隆与筛选策略
第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法
一、哺乳动物基因转移的选择标记
1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk）
第五节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并 且表达出相应的蛋白质的外源基因。 一、放射性抗体检测法
1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为几种作用方式：
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。
Immuno Blotting
④结果 单抗blotting 结果
多克隆抗体 Blotting的 结果
第六节 转译筛选法
借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选 择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选 其产物是否符合预期。
第六章 重组体克隆的筛选和鉴定
第一节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法 1. 原理：
pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
1. 原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组 可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
放射自显影
三、杂交抑制转译法
1. 原理 mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链 后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被 抑制）。
核糖体 小亚基
核糖体单链mRNA 大亚基
能翻译
mRNA DNA
核糖体 小亚基
核糖体 大亚基
不能翻译
2. 过程
四、杂交释放转译法
1. 原理：
在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA 与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释 放出与它对应的mRNA，进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基 因产物（如分子量、免疫源性等）。
第四节 核酸杂交检测法
一、原理：
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素 32P 或 125I 。
（2）非放射性标记 荧光素
二、核酸杂交检测方法
1. Southern blotting
用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒 载体），再用探针杂交。
抑制 TTP
dUMP
氨甲喋啉 抑制 dCTP
dATP
③次黄嘌呤的补救作用 细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和dCTP。
④胸苷酸激酶的补救作用
TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利 用培养基中的胸苷（T）合成TTP，存活。
T tk 抑制 TTP
dUMP dATP
氨甲喋啉 抑制 dCTP 补救 次黄嘌呤
（1）TK选择原理
①四氢叶酸的必要性
真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸
提供甲基。
二氢叶酸
DHFR
四氢叶酸
二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）
②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用
氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似 物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻 断dATP、dCTP和dTTP的合成：
孔底
（2）一抗结合 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 一抗
（3）二抗结合 加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二 抗冲洗掉。二抗只识别一抗。 二抗
二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物 酶、脲酶等）。
（4）显色反应
加入无色的底物，被二抗上所带的酶催 化反应转变成有色物质（或发光）。
（5）比色
（2）TK选择过程
① HAT培养基：
含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。 (hypoxanthine，aminopterin，thiymidine） ② 宿主细胞
质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A
外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的
抗A抗体质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。
1. 原理 抗原wk.baidu.com—抗体凝集反应。
2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中， 当插入基因的表达产物被细菌分泌到 菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉 淀圈”。
酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无
色的底物转变为有色的物质（或发光），再 通过比色测定有色物质的含量（或光强度）， 从而推测目标分子的含量。
待测基因 产物蛋白
一抗
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
二抗
酶
无色的底物
有色的产物
比色观察 19
2. ELISA检测的一般步骤 （1）固定样品 将待测样品加入96孔微量滴定板 （microtiter plate）的孔中，干燥后 就被固定在孔底。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
1.原理：
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（SDS-PAGE）： ① SDS:
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的 蛋白质维持线性状态，并与蛋白质 结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： （Polyacrylamide gel electrophoresis）
在电场的作用下线性 蛋白质链在聚丙烯酰 胺凝胶介质中向正极 移动，移动的速率主 要取决于其分子量大 小（链的长短），从 而把不同分子量的肽 链分开。
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第三节 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打 印出结果。
3.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗 的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）
临床检验常用的单抗
四、免疫印迹（western blotting）法 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复 性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNADNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环 形结构。
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。
主要检测插入片 断是否被转录。
从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
3. Broome-Gilbert双位点检测法 检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
电泳buffer
电泳buffer
点样
电泳方向
③蛋白质电泳的分子
Da
量标准
已知分子量的蛋白质 混合液，与待测样品 一起电泳，为样品蛋 白质提供分子量估计。
商品化供应
道尔顿(质量单位, 等于 一氧原子质量的十六分 之一。 一克约为6×1023道尔顿
Dalton SDS PAGE
④凝胶中的蛋白质染色： 1）直接染色 考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可 褪色回收。
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
2）转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
（2）Western blotting
① Western（转膜）
电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法， 转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、 中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电 胶
膜
场的作用下横向转移
到正极一侧的膜上。 蛋白
（2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为 青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KIAampicillin）（蓝灰色）褪色。
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
三、酶联免疫吸附测定（ELISA）
Enzyme-linked immunosorbant assay
1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。
二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有 中止密码；（不破坏肽）。
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
第二节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
适用于mRNA转录丰度高的外源基因。 一、无细胞翻译系统
能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提 取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞 提取物系统。
二、转译筛选 载体+外源DNA 转录
mRNA 无细胞翻译系统 翻译 35S标记的肽链
35S标记的 甲硫氨酸
PAGE电泳
与预期的产物 分子量相符？
比较放射性 带纹的位置
Western装置
② Blotting 原理与ELISA相同。 PAGE胶 待测蛋白
硝酸纤 待测蛋白 一抗 二抗
维素膜
辣根过氧
化物酶
底物
产物， 并发出光
辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。
2）洗去未结合的一抗。
3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
Southern blot 筛选
结果
（1）原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
（2）R-环检测法
1）原理： DNA-RNA杂交。
2）选择过程
用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
2. 过程
凝胶放射自显影
硝酸纤 载体和插 维素滤膜 入的cDNA
总mRNA
杂交
硝酸纤 载体和插 cDNA基因的 维素滤膜 入的cDNA mRNA
洗脱
cDNA编 码的蛋白
电泳
cDNA编 码的蛋白
硝酸纤 载体和插 维素滤膜 入的cDNA
cDNA基因的
mRNA
体外翻译
收集
35S标记的氨基酸
五、DNA-蛋白质相互作用筛选法
专门设计检测能同DNA特异结合的蛋 白质因子。
硝 待测蛋白质
酸
能与蛋白质结 合的DNA序列
放射性标记
纤
维
硝
素
酸
滤
纤
膜
维
素 滤
待测蛋白质
能与蛋白质结 合的DNA序列
放射性标记
膜
一般克隆与筛选策略
第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法
一、哺乳动物基因转移的选择标记
1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk）
第五节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并 且表达出相应的蛋白质的外源基因。 一、放射性抗体检测法
1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为几种作用方式：
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。
Immuno Blotting
④结果 单抗blotting 结果
多克隆抗体 Blotting的 结果
第六节 转译筛选法
借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选 择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选 其产物是否符合预期。
第六章 重组体克隆的筛选和鉴定
第一节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法 1. 原理：
pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
1. 原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组 可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
放射自显影
三、杂交抑制转译法
1. 原理 mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链 后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被 抑制）。
核糖体 小亚基
核糖体单链mRNA 大亚基
能翻译
mRNA DNA
核糖体 小亚基
核糖体 大亚基
不能翻译
2. 过程
四、杂交释放转译法
1. 原理：
在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA 与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释 放出与它对应的mRNA，进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基 因产物（如分子量、免疫源性等）。
第四节 核酸杂交检测法
一、原理：
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素 32P 或 125I 。
（2）非放射性标记 荧光素
二、核酸杂交检测方法
1. Southern blotting
用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒 载体），再用探针杂交。
抑制 TTP
dUMP
氨甲喋啉 抑制 dCTP
dATP
③次黄嘌呤的补救作用 细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和dCTP。
④胸苷酸激酶的补救作用
TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利 用培养基中的胸苷（T）合成TTP，存活。
T tk 抑制 TTP
dUMP dATP
氨甲喋啉 抑制 dCTP 补救 次黄嘌呤
（1）TK选择原理
①四氢叶酸的必要性
真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸
提供甲基。
二氢叶酸
DHFR
四氢叶酸
二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）
②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用
氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似 物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻 断dATP、dCTP和dTTP的合成：
孔底
（2）一抗结合 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 一抗
（3）二抗结合 加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二 抗冲洗掉。二抗只识别一抗。 二抗
二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物 酶、脲酶等）。
（4）显色反应
加入无色的底物，被二抗上所带的酶催 化反应转变成有色物质（或发光）。
（5）比色
（2）TK选择过程
① HAT培养基：
含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。 (hypoxanthine，aminopterin，thiymidine） ② 宿主细胞
质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A
外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的
抗A抗体质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。
1. 原理 抗原wk.baidu.com—抗体凝集反应。
2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中， 当插入基因的表达产物被细菌分泌到 菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉 淀圈”。
酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无
色的底物转变为有色的物质（或发光），再 通过比色测定有色物质的含量（或光强度）， 从而推测目标分子的含量。
待测基因 产物蛋白
一抗
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
二抗
酶
无色的底物
有色的产物
比色观察 19
2. ELISA检测的一般步骤 （1）固定样品 将待测样品加入96孔微量滴定板 （microtiter plate）的孔中，干燥后 就被固定在孔底。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
1.原理：
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（SDS-PAGE）： ① SDS:
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的 蛋白质维持线性状态，并与蛋白质 结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： （Polyacrylamide gel electrophoresis）
在电场的作用下线性 蛋白质链在聚丙烯酰 胺凝胶介质中向正极 移动，移动的速率主 要取决于其分子量大 小（链的长短），从 而把不同分子量的肽 链分开。
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第三节 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打 印出结果。
3.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗 的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）
临床检验常用的单抗
四、免疫印迹（western blotting）法 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复 性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNADNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环 形结构。
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。
主要检测插入片 断是否被转录。
从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
3. Broome-Gilbert双位点检测法 检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
电泳buffer
电泳buffer
点样
电泳方向
③蛋白质电泳的分子
Da
量标准
已知分子量的蛋白质 混合液，与待测样品 一起电泳，为样品蛋 白质提供分子量估计。
商品化供应
道尔顿(质量单位, 等于 一氧原子质量的十六分 之一。 一克约为6×1023道尔顿
Dalton SDS PAGE
④凝胶中的蛋白质染色： 1）直接染色 考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可 褪色回收。
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
2）转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
（2）Western blotting
① Western（转膜）
电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法， 转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、 中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电 胶
膜
场的作用下横向转移
到正极一侧的膜上。 蛋白
（2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为 青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KIAampicillin）（蓝灰色）褪色。
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
三、酶联免疫吸附测定（ELISA）
Enzyme-linked immunosorbant assay
1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。
二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有 中止密码；（不破坏肽）。
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
第二节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
适用于mRNA转录丰度高的外源基因。 一、无细胞翻译系统
能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提 取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞 提取物系统。
二、转译筛选 载体+外源DNA 转录
mRNA 无细胞翻译系统 翻译 35S标记的肽链
35S标记的 甲硫氨酸
PAGE电泳
与预期的产物 分子量相符？
比较放射性 带纹的位置
Western装置
② Blotting 原理与ELISA相同。 PAGE胶 待测蛋白
硝酸纤 待测蛋白 一抗 二抗
维素膜
辣根过氧
化物酶
底物
产物， 并发出光
辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。
2）洗去未结合的一抗。
3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。