酵母菌的分离筛选方法

酵母菌的分离筛选方法

酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条

件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明，

菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色，

圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。

含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。

1.培养基：

1.1葡萄糖50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L KH2PO4

2.5g/L

Na2HPO40.5g/L MgSO41g/L FeSO4 0.1g/L 酵母膏 0.5g/L 孟加

拉红 0.03g/L PH4.5-5.0 （富集用）

★1.2乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用

蔗糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱

布过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培

养用）（富集用）

★1.3麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过

滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤，

10-15波林，氯霉素0.1g/L PH6.0-6.4 121℃ 20min

（分离保存用）灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用）

★1.4虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨5.0g/L 葡萄糖10g/L

KH2PO41.0g/L MgSO40.5g/L 孟加拉红0.033g/L 氯霉素0.1g/L 琼

脂15g/L PH自然

（分离纯化用）

★1.5 豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g 黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L

1.6察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用

蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾0.5g/L 硫酸镁0.5g/L 硫酸亚铁0.01g/L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。

2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。

实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。

3.筛选：

分离：取集菌液适当稀释，吸取0.1-0.2ml梯度菌液（至少两个两个平衡），涂布于马铃薯-葡萄糖麦芽汁或虎红培养基平板，也可采用混菌法或蘸取集菌菌液直接划线，（平放12h后倒置培养），25℃培养48h，低温酵母菌15℃高温酵母菌 35℃ 40℃ 45℃，形成清晰菌落。在培养皿底划分小方格，待菌落生长良好后，用放大镜或低倍镜，观察每格内每个菌落编号并描述，颜色表面边缘切面等，再制片在高倍镜下观察各菌株的个体形态，做好记录。选择不同菌落分别接于麦芽汁斜面，25℃培养48小时备用。

纯化：培养基与分离培养基相同，否则，不同培养基菌落会改变形态，决不能认为菌落外观相同菌属于同一种。菌落外观相近的菌落，只能挑取一至数个菌落为代表进行纯化。常用方法为平板划线分离法：挑取单菌落于平板划线纯化菌株，25-28℃ 2-3d，选择菌生长快菌落大典型继续纯化，每个分离物至少经两次划线，结合镜检保持菌株的纯度，对于保存菌株也应定期检查纯度。纯化的菌株转接于麦芽汁斜面25-28℃ 2d 待鉴定或用灭菌液体石蜡封面于4℃冰箱保存。

筛选：性能测定：根据不同需要，选择不同性能测定方法。

产气性能比较：采用杜氏管发酵法，将斜面菌种两环接种于麦芽汁或豆芽汁液体培养基中（可以分两次加培养基），28℃振荡培养48h，产气时间和产气量。

产酒精能力测定：采用蒸馏法测酒精含量。

产香能力测定：通过嗅觉鉴定。

附：不同酵母菌的形态特征：

酿酒酵母：在麦芽汁琼脂培养基上，菌落与细菌相似，比细菌大而厚，不透明，表面光滑，湿润粘稠，乳白色，形成假菌丝。单细胞，形状有圆形椭圆形等，大小不一。在麦芽汁中，沉淀表面形成环状膜。不能利用硝酸盐。

产朊假丝酵母：在麦芽汁琼脂培养基上菌落为乳白色，平滑，有光泽或无光泽，边缘整齐呈菌丝状。细胞呈圆形椭圆形和圆柱形等。能利用硝酸盐为氮源。

实例1：大曲中酵母菌的分离及鉴定

1.富集培养：取5g样品，在试管中加入10ml麦芽汁培养基，同时加入一滴乳酸摇匀，25-28℃24h，后取1ml菌液转入另10ml麦芽汁培养基试管中培养25-28℃ 24h，稍长(过长则霉菌长出)。培养液变浊产膜或沉淀。观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。

要求：较高的糖50g/l，抑菌剂孟加拉红0.03 g/L（许多细菌放线菌和快速生长的霉菌），PH 4.5。或用乳酸（5ml）-马铃薯（200g）-葡萄糖（20g）培养基富集。

2.酵母菌分离：平板划线涂布或混菌均可。取集菌菌液，梯度稀释，取10-5 10-6 10-7,0.1ml菌液涂布虎红培养基上，25-28℃ 48h（若