免疫组化实验步骤汇总
免疫组化实验的详细步骤
免疫组化实验的详细步骤1. 制备组织切片- 将组织固定在适当的固定液中(如甲醛溶液)- 通过脱水、清理和浸蜡等步骤制备石蜡包埋块- 使用切片机将包埋块切成4-6微米厚的切片- 将切片贴附到载玻片上2. 脱蜡和水化- 将载玻片浸入二甲苯或者相似的溶液中,去除石蜡- 使用梯度浓度的乙醇溶液(100%,95%,70%)逐步水化切片3. 抗原修复- 抗原修复是一个关键步骤,可以暴露被固定过程掩盖的抗原表位 - 常用的方法包括加热诱导抗原修复和酶促抗原修复4. 内源性过氧化物酶或者生物素的封闭- 使用3%的过氧化氢溶液处理切片,以封闭内源性过氧化物酶活性 - 对于利用生物素-亲和素系统的实验,需要使用生物素封闭试剂进行封闭5. 加入封闭液- 使用含有蛋白质成分的封闭液(如牛血清白蛋白)处理切片- 这一步可以阻止抗体的非特异性结合6. 加入一抗- 将特异性的一抗(如小鼠抗人蛋白单克隆抗体)稀释至适当浓度- 滴加到切片上,在湿盒中于4℃过夜或37℃温育1-2小时7. 加入二抗- 洗去未结合的一抗- 加入与一抗种属相匹配的二抗(如生物素标记的羊抗小鼠抗体)8. 加入探针- 对于酶促反应型免疫组化,加入酶标记的亲和素(如过氧化物酶-亲和素复合物)- 对于荧光免疫组化,加入荧光标记的亲和素9. 显色- 酶促反应型:加入适当的染色底物(如),产生可见的棕黄色沉淀- 荧光免疫组化:不需要此步骤10. 染色和封片- 用苏木素对细胞核进行复染- 用封片剂和覆盖玻片封闭切片,制成永久装片11. 观察结果- 使用光学显微镜或荧光显微镜观察目的蛋白的分布和表达情况以上是免疫组化实验的一般步骤,具体操作细节可能因实验目的和具体方法而有所调整。
准确无误的实验步骤需要参考相关文献和说明。
免疫组化实验步骤流程
免疫组化实验步骤流程1.样品制备：a.组织样品：从动物或人体获得的组织样品首先需要固定在福尔马林中，然后通过蜡包埋技术将组织固定在蜡块中。
之后，将蜡块切成薄片，然后将薄片分别放置于载玻片上。
b.细胞样品：将细胞悬浮液放置在载玻片上，并用福尔马林进行固定。
2.抗原恢复：固定的组织或细胞样品经过脱水和脱脂处理后，需要通过抗原恢复来揭示隐藏的抗原。
抗原恢复的方法可以是热处理、酶切或化学处理等。
3.形成蛋白结合位点：将载玻片上的样品用蛋白结合剂如牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶或生物素素蛋白结合剂等进行封闭处理，以防止非特异性结合。
4.孵育抗体：a.主抗体：将特异性的首要抗体加入到样品中，与目标抗原结合形成抗原抗体复合物。
b.辅助抗体：添加荧光素或酶标记的次抗体，与主抗体结合，以扩大信号的产生。
5.洗涤：用缓冲液洗涤载玻片，以去除未结合的抗体和其他无关物质。
6.信号增强：a.酶标记的实验，为了增加信号强度，可以加入荧光素或发光底物。
b.荧光标记的实验，可以直接观察荧光。
7.显色：在酶标记的实验中，加入染色底物以产生可见的颜色，从而定位并显示目标抗原的存在。
8.盖玻片：在涂抹适当封片剂后，将载玻片盖上一片封片玻片，以保护样品并减少光的干扰。
9.显微镜观察：使用显微镜观察载玻片下的样品，并通过图像系统进行图像捕捉和分析。
10.结果评估：评估图像和数据以确定抗原的表达和分布情况。
根据实验目的，可以进行半定量或定量的数据分析。
需要注意的是，免疫组化实验中的条件、试剂和步骤会因实验目的不同而略有差异。
因此，在进行实验前需仔细阅读相关文献和制定适合的实验方案，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化试验步骤
免疫组化试验步骤第一步：标本处理1.收集样本：选择适当的组织或细胞样本，如活体组织、固定组织切片或悬液细胞。
2.固定样本：使用适当的固定剂，如乙醛或甲醛，对活体组织进行固定，使其保持形态和抗原性。
对于细胞悬液，可以将其离心收集，并用固定剂固定在载玻片上。
第二步：抗原暴露1.脱蜡和再水化：对于固定的组织切片，将其从石蜡脱蜡，并通过一系列浓度逐渐降低的乙醇溶液进行再水化。
这将使得抗体能够更好地与组织中的抗原结合。
2.抗原恢复：有时，抗原可能由于固定和脱蜡过程中的处理而发生损失。
此时，可以使用草酸、酶或高温等方法进行抗原恢复，以暴露隐藏的抗原。
第三步：阻断非特异性结合活性1.非特异性结合抑制：为了防止抗体结合到非特异性组织或细胞上，需要对样本进行预处理。
可以使用一种含有蛋白质（如牛血清蛋白）的缓冲液，在样本中进行非特异性结合的阻断。
第四步：抗体结合1.抗体选择：选择能够与目标抗原特异性结合的抗体。
根据需要选择一抗或二抗，并确保它们具有卓越的特异性和亲和力。
2.抗体检测：将选定的抗体加入样本中，将其与样本中的目标抗原结合。
可以通过直接标记或间接标记的方式将抗体与反应物进行结合。
第五步：染色和可视化1.染色方法：对于直接标记的抗体，可以使用染色物质（如荧光染料或酶底物）直接对抗体进行染色。
对于间接标记的抗体，可以使用特异性的二抗结合剂与一抗结合，并使用染色物质进行可视化。
2.显微镜观察：将样本放置在显微镜下观察，并通过荧光显微镜或酶标仪等设备进行图像捕获和分析。
第六步：结果分析1.图像分析：对于荧光染色的样本，可以使用图像处理软件对图像进行分析，包括定量测量染色的强度和分布。
2.定量分析：根据样本中染色物质的强度和分布，可以计算抗原的相对表达量，并与其他样本进行比较和统计分析。
以上就是免疫组化试验的主要步骤。
根据实验的具体要求和抗体的选择，步骤中的一些细节可能会有所不同。
不过总体来说，这些步骤提供了一种标准的操作方法，用于研究蛋白质在细胞和组织中的分布和表达情况，并在生物医学研究、诊断和治疗中发挥重要作用。
免疫组化的操作流程
免疫组化的操作流程免疫组化是一种在细胞或组织中检测特定抗原或抗体的方法。
免疫组化广泛应用于医学诊断、生命科学研究和药物研发等领域。
下面是免疫组化的操作流程。
1.样本处理：首先，需要准备待检测的样本。
样本可以是组织片、细胞悬液或液体样本（如血清或尿液）。
对于组织样本，通常需要固定、切片和脱水等处理步骤，以保持细胞和组织的结构和形态。
2.抗原修复：组织样本中的抗原通常会在固定处理过程中被破坏或失活。
为了恢复抗原的免疫反应性，需要进行抗原修复步骤。
常用的抗原修复方法包括加热诱导抗原修复和酶诱导抗原修复。
3.抗原检测：制备好的样本可以用于检测抗原。
抗原检测通常通过选择与目标抗原特异性结合的一组试剂，如特异性抗体或亲和素。
这些试剂将与待检测样本发生特异性结合，从而形成特定的抗原-抗体结合物。
4.一次抗体结合：首先，将样本与一次抗体结合。
一次抗体是与目标抗原结合的特异性抗体。
待检测样本与一次抗体一起孵育，使其与目标抗原发生特异性结合。
5.洗涤：为了去除未结合的一次抗体和其他非特异性结合物，需要进行洗涤步骤。
洗涤可以用缓冲液溶液进行多次重复，以确保样本的纯净性。
6.二次抗体结合：接下来，需要将与检测物发生特异性结合的二次抗体与样本反应。
二次抗体是与一次抗体特异性结合的抗体。
这些二次抗体通常与标记物结合，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。
7.洗涤：与一次抗体结合后，需要再次进行洗涤步骤，以去除未结合的二次抗体和其他非特异性结合物。
8.标记物探测：二次抗体中的标记物将通过检测技术进行可视化。
最常用的检测技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），其中酶标记物与底物反应产生可见的颜色变化。
其他常用的标记物包括荧光染料、生物素-链霉亲和素等。
9.观察和分析：最后，需要使用光学显微镜或显微镜等工具观察标记物，并进行结果分析。
可以根据标记物的位置、数量和强度等进行定量和定性的分析。
总之，免疫组化操作流程包括样本处理、抗原修复、抗原检测、一次抗体结合、洗涤、二次抗体结合、洗涤、标记物探测和观察分析等步骤。
免疫组化实验步骤完整版
免疫组化实验步骤完整版步骤1：标本采集和固定首先，需要从待检测样本中采集组织或细胞。
可以使用手术切片、活体组织、培养的细胞等作为标本。
然后，将采集的样本固定在载玻片或切片上，以保持其结构和形态的完整性。
步骤2：抗原暴露和体细胞抗原消除接下来，需要处理标本以使抗原裸露出来，并消除非特异性的抗体结合和细胞膜结合的抗原。
这一步骤常常涉及对组织或细胞的预处理，例如用石蜡脱脂、酶解抗体和孵化等。
步骤3：抗体特异性结合选择特异性的抗体用于检测待测蛋白质。
这些抗体可以是直接标记的一抗，或间接标记的二抗。
一抗是专门与目标抗原结合的抗体，而二抗则可以与一抗结合，以提高信号的灵敏度和特异性。
这一步骤中还需要选择适当的阴性对照，即未携带待检测抗原的样本。
步骤4：探针检测根据需要，可以使用不同的探针来检测目标分子。
常用的探针有标记的一抗、荧光探针、放射性标记物等。
标记的一抗可以直接结合抗原，然后使用染色剂进行可视化；荧光探针则通过荧光显微镜进行检测；放射性标记物可以通过放射自显影等方法进行检测。
步骤5：显色和对比计数将荧光、酶标记或放射性标记的物质显色，以便于检测和计数。
在染色的过程中，需要防止非特异性的染色，例如使用阻断剂、胶原等。
步骤6：结果分析根据观察到的染色强度、分布模式等结果，分析待测蛋白质在样本中的表达情况。
这可能需要与阴性对照和阳性对照进行比较，以确定实验结果的可靠性。
步骤7：图像捕获和分析使用显微镜或其他成像设备，将荧光、染色或放射性标记的图像捕获下来。
可以使用图像分析软件来计算和比较样本中的染色强度、面积等参数。
步骤8：数据统计和结果报告根据实验结果进行数据统计和分析，并将结果记录在报告中。
报告应包括样本信息、实验方法、结果和结论等内容，并根据需要进行解释和讨论。
总结：免疫组化实验是一种广泛应用于研究、诊断和治疗的方法。
它的步骤包括标本采集和固定、抗原暴露和体细胞抗原消除、抗体特异性结合、探针检测、显色和对比计数、结果分析、图像捕获和分析、数据统计和结果报告。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的存在和定位。
其步骤包括样本制备、抗原去原、阻断试验、一次抗体处理、二次抗体处理、显色和镜检。
下面将详细介绍每个步骤：1.样本制备：收集需要检测的样本，可以是细胞、组织或体液。
样本收集后，需要进行固定和切片处理，以保持细胞和组织结构的完整性。
2.抗原去原：蛋白质在组织中可能会被结构和其他因素影响，使其在免疫组化实验中难以被检测到。
因此，需要进行抗原去原处理。
常用的方法有热处理、酸碱处理、酶解处理等。
3.阻断试验：细胞和组织常常会存在非特异性结合位点，会使得后续的免疫反应变得模糊不清。
为了减少这种非特异性结合，需要进行阻断试验。
常用的阻断试验方法有牛血清白蛋白（BSA）、动物血清等。
4.一次抗体处理：在一次抗体处理步骤中，需要准备与目标蛋白质特异性结合的一次抗体。
将制备好的一次抗体加入样本中，使其与目标蛋白质发生反应，并形成抗原抗体复合物。
5.二次抗体处理：一次抗体只能与抗原结合，无法提供光学信号。
因此需要加入与一次抗体结合的二次抗体，该二次抗体与荧光物质或酶偶联，可以提供可视化信号。
常见的二次抗体有HRP（辣根过氧化物酶）、荧光染料等。
6.显色：通过加入合适的显色底物，可以使得与二次抗体结合的酶产生可见的颜色反应。
常用的显色底物有DAB（3,3'-二氨基联苯），其在酶的作用下会产生棕色的显色产物。
7.镜检：最后一步是使用光学显微镜对样本进行观察和分析。
通过镜检可以确定抗原存在的位置和分布情况，并对结果进行定量分析。
总结：免疫组化是一种确定蛋白质存在和分布的重要实验技术。
通过以上步骤的顺序操作，可以获得可靠的结果。
实验人员需要熟悉每个步骤的操作方法，并根据实验样本的要求进行调整和优化，以获得准确和可重复的结果。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。
2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。
步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。
2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。
3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。
步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。
2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。
步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。
抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。
2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。
孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。
步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。
2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。
步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。
2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。
步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。
常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。
2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。
步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。
2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。
步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。
2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。
这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。
免疫组化原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，用于检测组织切片中特定抗原的分布和表达水平。
它结合了免疫学和组织学的原理，能够在组织切片上定位和检测抗原，并通过染色方法将抗原可视化，从而实现对抗原的定性和定量分析。
免疫组化实验的步骤通常包括固定、脱脂、抗原修复、抗体和检测步骤。
下面将详细介绍每个步骤的操作和常用试剂。
1.组织固定：组织固定的目的是保持组织结构完整并固定细胞的抗原。
常用的固定试剂包括10%中性缓冲福尔马林（10% neutral buffered formalin，NBF）和乙醇等。
2.脱脂：脱脂是将组织切片中的脂质去除，以提高抗体对抗原的结合效率。
常用的脱脂试剂包括二甲苯、甲醛和乙醚等。
3.抗原修复：抗原修复是为了使被固定的组织恢复原样，增强抗原的可检测性。
抗原修复的方法包括热处理、酶解法和pH调整等。
常用的抗原修复试剂包括热解剂例如EDTA缓冲液、Tris-EDTA缓冲液，酶解剂例如胰蛋白酶和蛋白酶K，以及甲酸、盐酸等酸性溶液。
4.抗体：5.检测：检测步骤用于将抗原-抗体复合物可视化。
这通常通过染色方法完成。
常用的染色方法包括免疫酶标记、免疫荧光和免疫金标记等。
免疫组化实验所需的试剂种类繁多，下面列举一些常用的试剂：1. NBF（10% neutral buffered formalin）：用于组织固定，保持组织形态完整。
2.二甲苯：用于脱脂步骤，去除组织中的脂质。
3.甲醛：用于脱脂步骤。
4.乙醚：用于脱脂步骤。
5.EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。
6. Tris-EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。
7.胰蛋白酶：用于抗原修复的酶解剂。
8.蛋白酶K：用于抗原修复的酶解剂。
9.盐酸：用于抗原修复的酸性溶液。
10.一抗：选择特异性良好的一抗抗体，常用的有多克隆和单克隆抗体。
11.二抗：用于检测一抗结合的抗体，常用的二抗有反兔、反小鼠或反人的多克隆抗体。
免疫组化详细步骤
免疫组化步骤取组织、固定、制片(脱水、透明、浸蜡、包埋）、切片、烤片、抗原修复、滴加抗体一、取组织二、固定三、制片1、脱水透明的酒精梯度和时间70％酒精20min 80%酒精1h90%酒精1h 95％酒精Ⅰ2h95％酒精Ⅱ2h 无水乙醇Ⅰ15min无水乙醇Ⅱ15min 无水乙醇Ⅲ15min二甲苯酒精1：1 15min 二甲苯Ⅰ25min二甲苯Ⅱ25min 二甲苯Ⅲ15min2、浸蜡:石蜡融化后，在石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各浸蜡1h3、包埋四、切片烤片用切片机切片，取完整组织切片放于37℃温水中展片，取完整组织于载玻片上，并放入到60℃的烤箱中烤6个小时五、脱蜡至水六、抗原修复配置柠檬酸抗原修复液于微波中煮沸，在高压锅内放入自来水煮沸(不盖锅盖），将装有煮沸的抗原修复液的烧杯置于高压锅内，将水化后的玻片放入煮沸的抗原修复液中，盖上锅盖，待其压力达到最大时维持三分钟七、取出玻片，水浴逐渐降温直至完全冷却八、将玻片放置于塑料板上，滴加3％的过氧化氢室温孵育10min，以阻断内源性过氧化氢酶，10min过后PBS冲洗2次×3分钟九、除去PBS（甩干或者吸水纸吸干），每张切片滴加第一抗体（稀释相应倍数），4℃过夜十、PBS冲洗3次×2分钟，除去PBS液,每张切片滴加聚合物增强剂，室温孵育10min十一、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加酶标抗兔聚合物，室温孵育10min十二、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加新配制的DAB（二氨基联苯胺)，室温孵育2～10分钟，显微镜观察十三、苏木精复染:苏木精复染5min，水洗3min，0。
1%HCl浸提两次,水洗3min，反蓝液数秒，水洗十四、脱水透明：70％酒精3min、80％酒精3min、90％酒精3min、无水乙醇3min、二甲苯Ⅰ3min、二甲苯Ⅱ3min十五、封片。
免疫组化试验步骤
免疫组化试验步骤
免疫组化试验是一种常用的实验方法，以下是一般的免疫组化试验步骤：
1. 组织制备：将要分析的组织样本切片，通常使用冷冻切片或石蜡包埋切片。
2. 抗原解表：将切片进行脱变性处理，通常使用甲醛或乙醇溶液进行固定。
3. 抗体制备：选择合适的抗体，通常包括主抗体和辅助抗体。
主抗体可以是单克隆或多克隆抗体，用于特异性识别目标抗原。
辅助抗体主要是用于信号增强，如荧光标记或酶标记。
4. 抗体处理：将抗体溶液加到脱变性的切片上，使其与靶抗原结合。
可以进行孵育，增加结合效率。
5. 洗涤：使用缓冲液或洗液对切片进行多次洗涤，去除未结合的抗体。
6. 信号显现：根据实验目的，可以使用荧光信号或酶信号进行检测。
如果使用荧光信号，可以用荧光显微镜观察；如果使用酶信号，可以使用底物显色法，如DAB法或ABC法。
7. 洗涤：再次对切片进行洗涤，去除信号显现过程中的底物或荧光引物。
8. 盖片封装：将切片用透明胶片或硬化剂封装在玻片上，以保护样本。
9. 观察和分析：将封装好的切片放在显微镜下观察，并使用图像分析软件对结果进行定量分析。
以上是一般免疫组化试验的步骤，实际操作可能会根据实验目的与条件有所调整。
免疫组化步骤
步法免疫组化实验步骤详解: 1•脱蜡：脱蜡要达到将原组织玻片上的石蜡充分脱掉的目的，加热只是为了加速石蜡的溶解；
二甲苯1（15min 60 度）--二甲苯15min 60 度）--100% 乙醇
（10min）--90% 乙醇（5min） --80%乙醇（5min）--70% 乙醇（5min）--
蒸馏水（5min）
2•抗原修复（微波修复法）：目的是让蛋白抗原充分暴露
1）柠檬酸盐溶液：（PH: 6.0） 500ml不同的蛋白应采用不同的抗原修复条件，比如说膜蛋白PDGFRA的煮沸时间不能过长；核蛋白KI67 及包浆蛋白应充分煮沸；
2）E DTA修复液（PH: 9.0）稀释后体积是 500ml cox2 及 PDGFRA!
白的抗原修复的效果较好；
3.清洗：PBS 5min*3 次；
4.去除组织 H2O2 酶：3%H2O2 37 度 10min ；
5.清洗：PBS 5min*3 次；
6•—抗孵育：4度过夜；
过夜--过夜--过夜--过夜--过夜
7•取出玻片盒，放置于室温复温 30min （—般不做此步骤）；
8•—抗回收：将一抗回收标记清楚以备进行其他实验；
9.清洗：PBS 5min*3 次；
10•孵育二抗：37度30min ；二抗的添加主要是根据一抗的来源，抗
鼠、抗兔或者其他；
11.清洗： PBS 5min*3 次
12.DAB显色：DAB的显色时间主要取决于棕色颗粒的数目和浓度; 一般在3min-10min之间；
13•复染：用苏木精染色，根据显微镜下核的深度来判断；
14.蓝化：将染过的核放在水中10min左右；
15透明、封片：蓝化后的玻璃切片滴加中性树脂透明后封片；16•放置于65度烤箱，烘干，观察实验结果。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤1.溶解和固定样本：首先，将需要检测的细胞或组织样本固定在载玻片上。
最常用的固定剂包括甲醛和乙醇，固定时间可根据样本类型和大小来决定。
2. 渗透化处理：固定后的样本往往会产生较大的凝胶，渗透化处理是为了增加抗体的进入和细胞膜蛋白的释放。
渗透化处理一般使用皂类化合物如Tween-20、Triton X-100或SDS。
3.阻断非特异性结合：为了减少非特异性结合，需要进行阻断。
使用一种含有蛋白质（如牛血清白蛋白、胶原蛋白等）的缓冲液，将玻片上的固定样本浸泡数十分钟至数小时。
4.抗原恢复：一些蛋白质长时间固定后可能会导致其变性或掩盖其一些结构域，这种情况下需要进行抗原恢复。
抗原恢复有两种常见方法，热水浴和酶消化。
前者将玻片放在含有缓冲剂的热水中，后者则经过酶消化处理，例如使用胰酶。
5.抗体孵育：将特异性一抗加入到含有抗体绑定缓冲液中，然后将其滴加到玻片上，孵育在温和的条件下一段时间（通常为1小时至过夜）。
抗体结合到样本中的特定抗原上。
6.洗涤：洗涤步骤是为了去除非特异性结合的一抗和其他蛋白质。
使用含有适当洗涤缓冲剂（如磷酸盐缓冲液或PBS）的盛满容器，将玻片在其中轻轻漂洗数次。
8.再次洗涤：同样地，使用含有适当洗涤缓冲液的容器，将玻片在其中轻轻漂洗数次，去除非特异性结合的二抗。
9.信号放大：添加一种可视化或发光的底物使得免疫反应可见。
通常使用的方法有酶标记二抗、荧光染料标记的二抗或放射性标记的二抗。
10.显微镜观察：在光学显微镜下观察和记录实验结果。
使用显微镜观察样本，根据信号强度和位置对阳性和阴性结果进行评估。
这些步骤是一般免疫组化实验的基本步骤，但每个实验都有特定的条件和需求，可能需要对步骤进行修改和优化。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)是一种利用抗体与组织中的抗原特异性结合的技术。
它是一种重要的研究方法，可以用于检测和定位组织中的特定蛋白质和其他生化分子。
以下是免疫组织化学实验的一般操作步骤：1.样本处理：a.固定：将待检测的组织样本进行固定处理，以保持其形态结构并保留组织内的抗原。
b.切片：将固定的组织样本切成非常薄的切片（通常为3-5微米厚），并将其放置在载玻片上。
2.抗原解蓝（抗原恢复）：a.对于不同类型的组织样本，选择适当的抗原解蓝方法。
b.抗原解蓝可以通过加热、酶解或其他方法来恢复组织样本中的抗原。
3.阻断非特异性结合：a. 使用一种非特异性的蛋白质来阻断载玻片上未特异性结合的位点，例如牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)或小鼠免疫球蛋白(Mouse IgG)。
b.加入适当浓度的阻断剂，并孵育片玻片上的切片，以阻断非特异性结合位点。
4.主抗体孵育：a.加入含有特定抗原的主抗体溶液，其可以与组织样本中特定的抗原结合。
b.孵育片玻片上的切片，使主抗体与待检测的抗原结合。
5.洗涤：a.用缓冲液或PBS等洗涤溶液洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的主抗体。
6.二抗孵育：b.孵育片玻片上的切片，使辅助抗体与主抗体结合。
7.洗涤：a.再次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的辅助抗体。
8.信号放大：a.可根据需要，使用染色剂或底物来增强或显色识别待检测抗原的结合位置。
b.例如，使用荧光染料或酶底物，通过显微镜观察或光镜观察，可使抗原可视化。
9.洗涤：a.最后一次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的染色剂或底物。
10.封片：a.加入适当的封片剂，如富含丙酮的溶液，将载玻片上的切片封装起来，以保护切片和保存染色结果。
免疫组织化学是一种复杂的实验技术，需要仔细的操作和精确的控制条件才能得到准确的结果。
免疫组化实验设计
免疫组化实验设计主要包括以下几个步骤：
1. 实验目的：明确实验的目的和意义，确定要检测的蛋白类型、样本类型、实验参数等。
2. 样本准备：选取合适的样本类型，如组织切片、细胞涂片、细胞培养等，并进行预处理，包括固定、脱水、包埋等步骤。
3. 抗原修复：由于组织在固定过程中会发生蛋白之间交联及醛基的封闭作用，因此需要进行抗原修复，以便更好地暴露抗原。
4. 血清封闭：为了防止一抗与组织非特异性结合，需要进行血清封闭。
5. 一抗和二抗的选择：根据实验目的和样本类型，选择合适的一抗和二抗，并进行稀释比和孵育条件的优化。
6. 显色反应：通过化学反应使酶标记的抗体与显色剂进行显色反应，生成有色产物，以便后续观察和检测。
7. 观察和检测：采用显微镜观察样本，并记录实验结果。
根据需要，可以采用定量或半定量方法进行结果分析。
8. 实验结果的解释与结论：根据实验结果，解释实验结果的意义，并得出结论。
在免疫组化实验设计中，需要注意以下几点：
1. 保证实验的特异性：选择针对目标蛋白的一抗，并排除非特异性结合的干扰。
2. 控制实验条件的一致性：保证实验中各步骤的条件一致，以便准确比较不同样本的结果。
3. 注意实验的重复性：为了保证实验结果的可靠性和准确性，需要进行重复实验，并对结果进行统计分析和检验。
免疫组化试验步骤
免疫组化试验步骤1.标本的制备2.抗原复性与预处理标本制备后，需要对其进行脱蜡或脱冻处理以使抗体能够与抗原结合。
对于石蜡包埋样本，可以使用脱蜡液将蜡去除。
对于冷冻固定标本，可以将其浸泡在PBS等缓冲液中进行脱冻处理。
3.抗体选择与标记选择适当的一抗体来检测目标抗原。
一抗体可以来自动物源（如小鼠、兔子等），也可以是人源单克隆抗体。
一抗体通常需要与标记物结合以便于检测。
常用的标记物有酵素（如辣根过氧化物酶(HRP)）、荧光标记物（如荧光蛋白、荧光染料）、金标记物等。
标记后的抗体通过特异性抗原与其结合。
4.抗原检测将标记后的抗体加入标本中，使其与目标抗原结合。
可以选择直接检测法或间接检测法。
直接检测法中，标记的一抗体直接与目标抗原结合。
间接检测法中，先加入与目标抗原特异性结合的一抗体，再加入与一抗体特异性结合的二抗体。
二抗体同样需要进行标记。
5.可视化根据标记物的不同，可以采用不同的可视化方法。
对于酶标记物，可以通过酶底物的显色反应来观察染色结果。
对于荧光标记物，可以使用荧光显微镜观察荧光信号。
对于金标记物，可以利用金溶液的特异性反应观察金颗粒的形成。
6.分析与结果解读观察标本中的染色结果，并通过显微镜或图像分析系统获取图像。
对于定性分析，可以通过比较标本中目标抗原的染色强度与阴性对照进行评估。
对于定量分析，可以使用图像分析软件对染色强度进行定量分析。
7.结果解释与报告根据染色结果，结合临床资料和病理学知识进行结果解释，并将结果记录在报告中。
报告应清晰准确地描述染色结果，包括阳性与阴性反应的程度和分布等信息。
总结起来，免疫组化试验的步骤包括标本制备、抗原复性与预处理、抗体选择与标记、抗原检测、可视化、分析与结果解读以及结果解释与报告。
通过这些步骤，可以对组织和细胞中的目标抗原进行定性和定量分析，为生物医学研究和临床诊断提供重要的信息。
免疫组化实验步骤
(一)免疫组化：
1、脱蜡和水化：
石蜡切片置于二甲苯中浸泡5min×2，再在无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇和PBS中分别浸泡3分钟。
2、抗原修复：
微波炉加热：在容器内加入柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）后将组织芯片放入，中高火，加热5min，盖盖冷却15分钟，再加热3分钟，再开盖冷却20分钟。
3、染色
（1）PBS浸泡10分钟，3次。
（2）3%H2O2室温孵育30分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，
（3）PBS冲洗，10分钟，3次，血清封闭，室温孵育60分钟。
（4）滴加已稀释的一抗工作液，封口，4℃过夜。
（5）PBS冲洗，20分钟，3次。
（6）滴加生物素标记二抗100ul/片，室温孵育60分钟。
（7）PBS冲洗，10分钟，3次。
（8）滴加辣根酶标记链霉卵白素，室温孵育1h后PBS洗3 min×3。
（9）DAB显色剂显色100ul/片，3-10min，镜下观察，有棕黄色沉淀后自来水充分冲洗。
（10）苏木精复染，5-30分钟。
4、脱水封片
（1）50%乙醇、75%乙醇、90%乙醇中各浸泡1分钟。
（2）无水乙醇中浸泡2分钟，两次。
（3）无水乙醇和二甲苯1：1混合液浸泡2分钟。
（4）二甲苯浸泡2分钟，两次。
中性树脂封片。
免疫组化原理及步骤
免疫组化原理及步骤免疫组化是一种常用于研究细胞和组织中蛋白质的定位、表达及定量的方法。
其原理基于抗原与抗体之间的特异性结合。
在进行免疫组化实验时，通常需经历如下步骤：1. 取样与制片：从待研究的组织或细胞中取得样本，并将其固定在载玻片或切片上，以便后续的实验处理。
2. 抗原恢复：某些样本经过固定处理后，可能会造成抗原的损失或掩盖。
因此，为了使抗原能更好地被抗体识别，常需要进行抗原恢复的步骤。
一般而言，常用的抗原恢复方法包括加热处理、酶解或化学处理等。
3. 阻断非特异性结合：为了避免非特异性的结合，需使用一些非特异性抗体或蛋白质（如牛血清白蛋白、胶原蛋白等）来阻断待测抗体结合样本中的非特异性位点。
4. 抗体标记与孵育：选择特异性与待测抗原结合的一抗体，并将其标记上可视化信号或发光染料等。
在将该标记抗体和样本一同孵育的过程中，待测抗原会与一抗体发生特异性结合。
5. 洗涤：通过洗涤步骤，去除与抗体无关的非特异性结合物，以减少背景信号的干扰。
6. 可视化和显色：对于免疫组化实验，最终需要将特异性结合的抗原或抗体定位，并使其可视化。
这可以通过结合染色剂、酶标记或荧光标记等方法实现。
7. 评价与分析：最后，通过显微镜观察和图像分析等手段，对标记结果进行定性或定量的评价与分析。
可以使用计算机软件进行图像处理和定量分析以获取更准确的数据。
总之，免疫组化的原理在于利用抗原与抗体的特异性结合来对蛋白质进行检测与定位。
在实验过程中，需要进行样本取样与制片、抗原恢复、非特异性结合阻断、抗体标记与孵育、洗涤、可视化和显色、评价与分析等一系列步骤。
这些步骤均为确保实验结果的准确性和可靠性所必需的。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤1.血样制备：-采集血液样本，离心分离血浆或血清。
-用PBS洗涤血浆或血清，去除杂质。
2.组织固定：-采集待检组织样本，用缓冲福迪液进行固定。
常用的福迪液包括4%的甲醛和10%的中性缓冲福迪液。
-将组织固定在玻片上，通常通过石蜡包埋来保护组织样本。
3.切片：-使用旋转式或电动切片机将固定的组织切割成5-10μm厚的切片。
-将切片放置在带有去福迪剂密封的玻片上，然后进行脱脂和重水处理。
4.抗原恢复：-将切片浸泡在适当的抗原恢复缓冲液中，以恢复切片中的抗原结构。
-常用的抗原恢复方法包括热敏感抗原恢复、酶消化抗原恢复和酸碱抗原恢复等。
5.阻断非特异性结合位点：-使用适当浓度的蛋白抑制剂（如牛血清蛋白）在切片上进行阻断，防止非特异性结合。
-将切片在室温下孵育一段时间，以使蛋白抑制剂有效阻断非特异性结合。
6.抗体染色：-添加特定的初级抗体到切片上，与待检测的特定抗原结合。
-孵育切片，使初级抗体与抗原结合。
-将切片用PBS或缓冲盐水洗涤去除未结合的抗体。
7.信号放大：-添加合适的二级抗体到切片上，与初级抗体结合。
二级抗体可标记有荧光染料、酶或金粒等。
-孵育切片，使二级抗体与初级抗体结合。
-将切片用PBS或缓冲盐水洗涤去除未结合的二级抗体。
8.检测与成像：-根据二级抗体标记的方式，使用合适的检测方法进行信号放大。
-如果使用荧光标记的二级抗体，可以利用荧光显微镜观察和拍摄图像。
-如果使用酶标记的二级抗体，可以使用底物和显色试剂进行检测和成像。
9.结果分析：-观察并分析免疫组化染色结果，评估抗原的定位和表达情况。
-可以使用计算机图像分析系统进行定量分析和比较。
10.结论和报告：-根据实验结果，得出结论并撰写实验报告。
-将实验结果与已知文献资料进行对比和解释，讨论可能的研究价值和应用前景。
注意事项：-实验过程中需严格遵守无菌操作规范，以避免交叉污染和误差。
-选用合适的正对照和阴性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤
1 前期准备
免疫组化实验试验主要是利用细胞中含有特定标志物的抗体，来观察细胞中某些特定蛋白质的位置和分布情况，其前期准备工作有以下几点需要考虑：
1、要做免疫组化实验必须首先准备一些*抗体,即抗特定标志物的抗体；
2、准备标本培养环境，保证细胞存活活跃；
3、清点实验要用到的必要物质，检查是否所有实验材料都已准备就绪；
4、准备实验记录，如实验方案、实验步骤、实验结果等，以保证实验数据的准确性和可比性。
2 具体实验步骤
免疫组化实验是实验员非常关注的一个实验，下面罗列出其具体实验步骤：
1、将标本培养到细胞形成一定规模的培养皿；
2、冷冻切割：将细胞悬停的溶液，用-20度的硫酸乙酸或三氯甲烷冷冻，然后将其分割为明显的薄片；
3、将冷冻标本培养到特定的沉淀液中，然后以石蜡改变其物理性质，使蛋白质定置固定；
4、将固定的载体实验片上滴涂稀释的抗体，经一定的反应时间，使其与抗原结合；
5、以使抗体以及它所结合的标志物发挥发色效果，得以定位特定的蛋白质。
免疫组化实验往往被用来观察某个蛋白质在不同细胞水平和组织水平分布情况，从而形成具有一定科学依据性的认识，为临床医学研究和药物方案提供可靠的指导和依据。
免疫组化实验步骤及配方
免疫组化实验步骤及配方免疫组化实验是一种用于检测和定位特定蛋白质在细胞、组织或器官中表达的技术。
免疫组化实验包括一系列步骤，如抗原修复、非特异性结合抑制、免疫原和次级抗体处理、显色/荧光染色等。
下面将详细介绍免疫组化实验的步骤及配方。
1.抗原修复：抗原修复是为了恢复因组织固定而引起的抗原性损失。
一般使用高温或酶解方法进行抗原修复。
-高温方法：将组织切片置于高温缓冲液中加热，一般在95°C下加热15-20分钟。
-酶解方法：如胰酶消化、蛋白酶消化等。
例如，可以使用0.1%胰酶在37°C下进行酶解。
2.非特异性结合抑制：非特异性结合抑制是为了防止免疫试剂（如次级抗体）与非特异性蛋白结合，从而降低假阳性结果。
一般使用正常动物血清或胶体等进行非特异性结合抑制。
-正常动物血清：根据动物源种类（如小鼠、兔子等）选择相应的正常动物血清。
-胶体：如牛血清蛋白、牛血清白蛋白等。
可以在最终稀释液中加入1-2%的胶体。
3.免疫原处理：免疫原处理是为了增强目标抗原与抗体的结合效率，一般通过与次级抗体或酵素结合。
根据具体实验需求，可以选择荧光标记、酶标记或金标记等不同的方式进行免疫原处理。
-荧光标记：如荧光素等。
-酶标记：如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
-金标记：如胶体金、纳米金等。
4.次级抗体处理：次级抗体处理是为了增强免疫原与目标抗原之间的结合效应。
一般使用来自其他物种的抗体作为次级抗体。
根据不同实验需求，可以选择与荧光标记、酶标记或金标记结合的次级抗体。
-荧光标记：如青蒿素标记的抗兔荧光标记抗体等。
-酶标记：如HRP标记抗体、AP标记抗体等。
-金标记：如碳标记抗体、金标记抗体等。
5.显色/荧光染色：显色/荧光染色是为了可视化目标抗原的分布和定位。
根据不同的免疫标记试剂，可以选择适当的染色方法。
-显色：如DAB（3,3'-二氨基联苯）染色。
-荧光染色：根据使用的荧光标记试剂选择相应的染色方法，如DAPI 染色、FITC染色等。
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石蜡切片免疫组化实验步骤
石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行（From 徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案）：
1）材料的准备
在本实验室条件下推荐使用FAA（50% ethanol, 5% acetic acid,
3.7% 甲醛）固定材料。
FAA固定液（100ml），室温保存：
无水乙醇50ml
冰醋酸5ml
37%甲醛10ml
水35ml
第一天：组织固定
用FAA固定，详见“石蜡切片”protocol。
第二天：脱水
Solution time number of changes
one 50% ethanol 60 minutes
one 60 minutes 60% ethanol
one
60 minutes
*70% ethanol
以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。
* 组织可在70% ethanol 4℃可存放几个月
第三天：进一步脱水和浸蜡
1
以下所有步骤在4℃进行并不时轻摇
以下所有步骤在室温进行并不时轻摇
准备工作：60℃预热plus蜡片（Paraplast Plus）石蜡可反复融凝而去气泡
第四天：浸蜡2
将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。
再加1/4体积的蜡块至完全2
熔化后移至60℃。
几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。
第五天：浸蜡3
（）Paraplast Plus换蜡两次
第六天：浸蜡4
（）换蜡两次Paraplast Plus
第七天：浸蜡5
（）Paraplast Plus换蜡两次
准备工作：60℃预热Regular蜡片（Paraplast Regular）
第八天：包埋（包埋块可长久保存）
第九天及之后：
开始切片，切片应包括自己的片子及正负对照等。
事先打开烘片机至37度，在涂有多聚赖氨酸的玻片上加1~2ml的蒸馏水。
切好的片子3
轻至于加水的玻片上。
待所有片子准备完之后盖上盖子，烘片过夜。
用自来水及双蒸水清洗免疫组化专用塑料，放在烘箱烘干待用。
第二天：开始脱蜡（From 徐晓峰、朱老师整理的“石蜡切片”protocol）
Solution time number of changes
two 10 minutes 100%二甲苯
（用新买来的免疫组化塑料小盒，每一步只需加入试剂220~250毫升）抗原修复：
在切片还浸入酒精时，可以事先将煮锅清洗干净，用蒸馏水洗1~2遍，最后加入0.01M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)，煮沸(保持在95度左右)，将过完PBS的片子让入煮沸的锅中，煮片10~15 min。
然后将电磁炉关闭，自然冷却锅中切片（千万不要把片子拿出来，放在缓冲4
液中一起自然冷却至室温！！！）
将片子浸入PBS（PH=7.4）5 min。
重复一遍。
封闭：
在抗原修复时可以事先配制封闭液，用PBS（PH=7.4）配制3% BSA 的封闭液。
将PBS中的切片放入封闭液中，室温放置30分钟~1小时。
杂一抗：
在封闭时可先剪好与切片大小相当的封口膜，并准备加有少量水的塑料大盒，用卫生纸垫在塑料大盒中附带的塑料板上。
用封闭液稀释一抗(GFP兔多抗以1:100稀释，其它一抗需要另外尝试)。
将稀释完的一抗加在片子上，每张片子保证不少于100ul，用封口膜封上，检
查是否有汽泡，轻轻赶走气泡。
将片子放在塑料大盒中，盖上塑料盖子，放入冰库过夜。
杂二抗：
事先配制好TBS(PH=7.4)缓冲液，用TBS（PH=7.4）缓冲液稀释带有碱性磷酸酶(AP)标记的抗兔二抗，比例为1:200。
将塑料大盒从冰库中拿出，浸入TBS（PH=7.4）缓冲液中洗一抗，5min，重复3次，在洗一抗的过程中准备封口膜。
将片子上的残余缓冲液倒去（但片子5
必须保持湿润！！！）每张片子加不少于100ul的二抗稀释液，盖上封口膜，放入塑料大盒中，室温放置1~1.5小时。
洗二抗并显色
用TBS(PH=7.4)缓冲液洗二抗，5min,重复3次。
同时在暗处配制显色液（40ul溶液A+40ul溶液B+720ul水，可根据实际切片数量按比例配制显色液），剪切封口膜。
将片子至于暗处，倒去缓冲液，每张片子加不少于100ul的显色液，轻轻盖上封口膜，放于暗处进行显色。
每隔15分钟左右看一下片子是否开始显色(根据经验，加入显色液30min~1小时会开始显色,但是需要根据不同蛋白表达强弱，把握显色时间)。
发现显色之后需加蒸
馏水终止反应，再盖上盖玻片进行观察并拍照。
6
试剂：
1.0.01M PBS（PH=7.4）:
购买的小包装粉末，溶于1L水中，待粉末溶解后调PH值至7.4。
2. TBS:
2.4g Tris, 8.8g NaCl溶于1L水中，调PH值至7.4
3. 0.01M 柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)：
2.94g 柠檬酸三钠?2HO溶于1L蒸馏水中，用固体柠檬酸2调PH至6.0
4. 3%BSA封闭液
7.5g BSA溶于250毫升PBS(PH=7.4)中。
7。