检测细胞生长刺激--采用SynergyTM HT 检测应激细胞中活性氧 (ROS) 生成

采用Synergy TM HT检测应激细胞中活性氧 (ROS) 生成

－检测细胞生长刺激

Paul Held Ph. D1, and Kheng Newick2

1Senior Scientist, Applications Dept., BioTek Instruments, Inc.

2Graduate Student, Cell and Molecular Biology Program, University of Vermont

关键词：AlphaScreen® ，cAMP分析，激酶分析

有关对能够刺激或抑制细胞生长的生物学制剂的研究，一直

以来是细胞生物学家最为感兴趣的领域。其中一项是对刺激

细胞中活性氧家族（ROS）生成的检测。虽然许多方法都可

以用来评估活性氧家族，但是荧光探针的使用已成为目前研

究的首选方法。本文介绍了使用Synergy™ HT检测DCF

荧光染料，并以此来检测和分析由于细胞生长刺激所引起的

ROS的产生。

介绍

活性氧（ROS）用于描述来源于分子氧的活性分子和自由基

的数目。原本认为活性氧家族只在吞噬细胞进行宿主防御时

才被释放。近期的研究表明，活性氧在细胞信号转导中起到

一定作用，包括细胞凋亡、基因表达、以及细胞信号级联反

应的激活1。虽然关于活性氧的具体作用目前还知之甚少，

但是其物理性质使之成为细胞第二信使理想的候选物。ROS

分子很小，消失前只在很小的范围内发生弥散。此外，还有

多种调控机制与ROS的降解有关。同时，一些酶也被认为

能够产生活性氧基团，NADPH氧化酶是最有代表性的酶1。NADPH氧化酶的激活受到复杂系统的调控，其中涉及G蛋白Rac2。在休眠细胞中，膜包裹的异源二聚体多肽(p22-phox 和 gp91-phox)含有血红素基团和FAD基团，可以在NADPH 氧化酶未激活的情况下，使来自细胞质的NADPH电子经过细胞膜到达分子氧1。普遍认为，当gp91-phox多肽作为一个质子泵时会发生电荷补偿。在受到刺激时，一些多肽( p47-phox, p67-phox 和 p40phox )转运至细胞膜的内表面，形成一个充分活跃的具有NADPH氧化酶活性的酶复合物（图1）。活化复合物中含有G蛋白Rac，刺激后从GDI解离，与GTP 结合并与膜联合2。聚集的复合物随后催化氧和氢离子形成过氧化氢（图1）。

DCF反应

为了观察活性氧家族的形成，需要使用荧光检测仪。由H

2

DCFDA-AM形成的醋酸酯是一种膜永久分子（membrane permanent molecule），可以通过细胞膜。一旦进入细

胞，细胞内酯酶作用于分子，形成非荧光基团H

2

DCFDA，该物质具有离子性，因此被困在细胞内。ROS参与的

H

2

DCFDA氧化反应,将该分子转化为DCF（2’,7’dichlorodihydrofl uorescein），DCF具有很强的荧光信号。刺激后，活性氧产生的终产物导致荧光信号随时间而增加（图2）。

图1. NADPH氧化酶的激活。

材料和方法

原发性间皮瘤细胞在含有10％FCS的DMEM培养液中进行培养。细胞经胰蛋白酶消化后计数，并用新鲜的培养基悬浮，浓度为30,000个/mL。使用MicroFlo蠕动泵分液器(BioTek)，将细胞接种到Corning24孔板(货号:3337)，37°C培养。第二天，改为无血清培养基，并将细胞放置在培养箱中孵育过夜。细胞和染料在含有5μM H2DCFDA-AM的新鲜DMEM培养液(不含酚红)中37°C孵育30min，CO

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浓度为5%。随后用新鲜的培养基洗涤细胞两次，将没有发生特异性结合的染料去除。清洗后，将含有实验条件所需物质的培养基加入，用动力学法检测荧光信号。使用Synergy HT微孔板检测仪(BioTek)在37℃下进行检测。检测采用485/20nm的激发滤光片和528/20nm的发射滤光片，PMT的灵敏度设置为55。采用底部读数，每隔30秒读一次数，共检测45分钟。

结果

图3 显示了在特定实验条件下采用Synergy HT检测细胞刺激下DCF荧光信号强度的结果。PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)和血清均被认为可以在静息状态下刺激细胞的生长。这两种物质都会诱导DCF的荧光信号随着时间的增加而

增加，没有受到刺激的细胞则不会产生荧光信号的增加。

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图2. ROS 存在下荧光化合物DCF 的形成。

采用谷胱甘肽氧化酶作为阳性对照，因为该物质在细胞未受刺激的条件下仍可产生ROS 。如图3所示，已知刺激细胞增殖的物质也可诱导ROS 的生成，从而导致生产DCF 荧光信号。荧光信号的增加并非受限于底物的效力。含有谷胱甘肽氧化酶的孔会产生ROS ，H 2O 2，这些物质作为谷胱甘肽氧化反应的副产物，表明在整个实验中荧光信号不断增加。说明DCF 底物并非该分析的限制因素。

图3. 随时间增加检测到的刺激细胞中DCF 荧光信号。

细胞用浓度为1 mU/mL 的以下物质处理：谷胱甘肽氧化酶 (紫红色曲线)； 10 μM PMA (绿色曲线)；0.25% FBS 血清 (red)；未处理 (blue)

图4显示了刺激30分钟后采用终点法检测到的荧光信号。PMA 和血清与未刺激组相比，荧光信号都发生了显著增加。扣除由无DCF 对照代表的背景荧光强度，0.25%血清组是对照的3倍，1 μM PMA 刺激组是对照的5倍。讨论

实验数据表明Synergy HT 可用于检测初级间皮瘤细胞受到刺激后细胞内ROS 的产生。Synergy HT 可以检测到不同刺激方式下DCF 荧光信号相对于背景信号显著的变化情况。多种复合物都可以用来评估ROS 的产生。然而，有些化合物不一定适合在活体内检测活细胞。因此，反应复合物必须跨过完整的细胞膜。例如，高香草酸与过氧化氢在辣根过氧化物酶存在的条件下可以形成具有强烈荧光的化合物6

，但反应混

图4. PMA 和血清诱导过氧化氢生成，刺激30分钟后采用终点法对荧光信号进

行测量。

合物不能穿过细胞膜。在同等条件下，Amplex Red 也可用于检测活性氧。这些反应混合物只适合检测分泌的活性氧。化合物DCF 可通过完整的细胞膜并且和ROS 家族的过氧化氢相互作用，形成一种荧光基团，但不是这种分子必须的特性。DCF 实际上与自由基离子如羟基(HO•)或羟自由基(ROO•)的反应比与过氧化氢(H 2O 2)的反应强烈。过氧化氢特异性探针如Peroxyl Green1的研发将允许对过氧化氢的形成进行具体的分析5。目前还无法将DCF 的荧光信号转换为细胞内ROS 的实际浓度。DCF 与不同ROS 相互作用的效率不同。然而可以比较相对实验条件的变化对实验产生的影响，从而可以换算出“倍比差异”。Synergy 多功能微孔板检测仪家族为检测刺激细胞活性氧提供了很好的平台。仪器通过使用专门的光路系统—将深度阻挡滤光片/二相色镜与光电倍增管(PMT)将结合，从而提供了高灵敏度的荧光检测。在实验中严格将温度保持在37℃，该仪器最高控温范围可达65℃。Gen5软件(BioTek)用来控制仪器的各项功能，以及数据采集和处理。该软件可满足绝大多数常用的数据换算，曲线拟

合和数据分析。参考文献

1. Hancock, J.T., R. Desikan, S.J. Neill, (2001) Role of Reactive Oxygen Species in Cell Signaling Pathways. Biochemical and Biomedical Aspects of Oxidative

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