动植物细胞培养技术
选修3-2.2动物细胞工程
植物组织培养和动物细胞培养的比较
比较项目 植物组织培养 细胞全能性 固体培养基 蔗糖 植物激素
已分化的组织→愈 伤组织→胚状体、 丛芽→完整植株
动物细胞培养 细胞增殖 液体培养基 葡萄糖 动物血清
动物组织→单个细 胞→细胞悬液→原 代培养→传代培养
原理
培养基状态 培养基特有成分 培养过程 生长特点 接种前处理 培养目的
动物细胞培养过程中需注意的问题 2、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？ 胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外， 长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损 伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。
二、动物细胞培养的条件
1、无菌、无毒的环境
添加一定量的抗生素，定期更换培养液
2、营养
可以补充培养 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素等 基中缺乏的物 质如生长因子， 通常需加入动物血清等一些天然成分 保证细胞顺利 的生长增殖
此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、 习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克 隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可 能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供 体动物100%的复制。
一、动物细胞核移植技术和克隆动物
3、体细胞核移植技术的应用前景
受精卵发育成新个体的生殖方式。
无性生殖：不经过两性生殖细胞结合，直接由母体
的一部分发育成新个体的生殖方式。如细胞有丝分裂、 植物组织培养、动物体细胞核移植等。
克隆：群细胞或者生物个体。现在指个体水平的 核移植技术、细胞水平的动物细胞培养、基因水平的 DNA复制等。
⑷为什么用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以 内的细胞？ 培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，
第五章 动植物细胞培养
◆ 动物克隆技术的建立
1962年，英国学者Grudon 把非洲爪蟾小肠上皮细胞的 核注入同种或异种非洲爪蟾 未受精卵中，约有1%的重组 卵发育成为成熟蛙。 1997年，哺乳动物克隆 羊多利的诞生。 动物器官克隆为生物医 药材料开辟新。
（三） 动物细胞培养的特性 ◆动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能差； ◆生长速度缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生
第二节 动植物细胞的培养
5.2.1 动物细胞的培养 （一） 培养方法
非贴壁依赖性细胞的培养：来源于血液、淋巴组 织的细胞，许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些 转化细胞属于这一类型，其可采用类似微生物培养的 方法进行悬浮培养。 贴壁依赖性细胞的培养：大多数动物细胞，包括 非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞属于这一 类型，它们需要附着于适量正电荷的固体或半固体的 表面上生长。
表51动植物微生物细胞的培养特征种类比较项目微生物动物细胞植物细胞大悬浮生长小营养要求生长速率代谢调节环境敏感细胞分化剪切应力敏感传统变异筛选技术细胞或产物浓度110m可以简单快倍增时055小时内部不敏感无低广泛使用较高10100m多数细胞需附着表面才能生长非常复杂慢倍增时间15100小时内部激素非常敏感有非常高不常使用低10100m可以但易结团无单个细胞较复杂慢倍增时间2474小时内部激素能忍受广泛范围有高有时使用低5
（二） ◇
培养方式
分批培养
分批式培养是指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养细胞不断 生长，同时产物也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养。分批 培养 过程特征如图5-1。
pH、温度、DO 废产物 条件
营养物 时间 图5-1 动物细胞分批式培养过程的特征
◇ 分批补料式培养
分批补料式培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜的条件 下接种细胞，进行培养，而在此过程中随着营养物质的不断消耗，不断地向 系统中补充新的营养成分，直到整个培养结束后取出产物。分批补料式培养 过程的特征如图5-2所示。
动植物细胞大规模培养
动物细胞大规模培养技术-培养基组成
二、动物细胞培养基组成及制备
1、培养基组成
天然培养基
使用最早，营养成分高，也最为有效。 成分复杂，个体差异大，来源也缺乏，因而使用受到限制。 动物血清是细胞培养中用量最大的天然培养基
合成培养基
合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合 成的，具有一定的组成。 它给细胞提供了一个近似体内生存环境，又便于控制和标 准化的体外生存环境。 合成培养基的种类虽多，但一般都含有氨基酸、维生素、 碳水化合物、无机盐和一些其它辅助性成分。
营养成分 尽管植物细胞能在简单的合成培养基生长，但营养成
分对植物细胞培养和次生代谢产物的生成仍有很大的影响。营养 成分一方面要满足植物细胞的生生长所需，另一方面要使每个细 胞都能合成和积累次生代谢产物。普通的培养基主要是为了促进 细胞生长而设计的，它对次生代谢产物的产生并不一定最合适。
植物细胞大规模培养技术-培养因素
从培养方式来看，动物细胞无论是贴壁培养或是悬浮培养， 均可采用分批式、分批补料式、半连续式、连续式等多种培 养方式。从培养系统来看，主要采用中空纤维培养系统和微 载体系统，且以灌注式连续培养方式为佳。
动物细胞大规模培养技术-培养方法
三、动物细胞培养方法和环境要求
2、动物细胞培养的环境要求
影响动物细胞生长、繁殖的环境因素很多，主要有细胞生长 的支持物、气体交换、培养温度、pH、渗透压及其它因素等 方面。
一、植物细胞培养基组成及制备
植物细胞培养，不同培养阶段必需采用不同培养基。培养基 主要由碳源、有机氮源、无机盐、植物生长激素、有机酸和一些 复合物质组成。
碳源
蔗糖或葡萄糖是常用的碳源。通常增加培养基中蔗糖的含量，可 增加培养细胞的次生代谢产物量。
动物细胞和植物细胞培养反应器
六叶罗式搅拌器实物图
后来，有人使用锚式搅拌器和螺旋式搅拌器进行植物细胞的培养，
也取得了较好的效果。一般认为螺旋式搅拌器效果最优。
锚式搅拌器和螺旋搅拌器植物细胞培养反应器
吸筒式搅拌器和帆式搅拌器也常用于植物细胞的悬浮培养中， 其结构如下图所示。吸筒式搅拌器的结构原理在本章动物细胞培养 反应器中会有详细介绍，帆式搅拌器结构相对简单，由四片较大的 搅拌叶组成。这两种搅拌在使用时转速都不高，一般在30～80转/分。
吸管式搅拌器和帆式搅拌器
搅拌桨是用尼龙丝编织带制成帆形，搅拌轴用磁力驱动旋转， 转速为20~50r/min，氧气通过插入溶液中的硅胶管扩散到培养 液内，以维持培养液内一定的溶解氧水平。
带帆形搅拌器的连续灌注系统培养反应器
/sbs.asp?id=118
第
三
章
植物细胞和动物细胞 培 养 反 应 器
动植物细胞培养与微生物细胞培养有很大的不同。 动物细胞培养与微生物培养区别： • 动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固 体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、 葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括pH、 溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监 测和控制。 植物细胞培养与微生物培养区别： • 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细胞培养一 般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，以及植物细胞生 长较微生物要缓慢，长时间的培养对无菌要求及反应器的设计也提 出特殊的要求。
悬浮培养瓶
小规模悬浮培养
3、固定化培养：是指采用吸附（固体吸附剂）、共价贴附 （与固相载体结合）、共价交连（用试剂处理使细胞间形 成桥而絮结）、包埋（将细胞包埋在多孔材料内）等方法 将细胞固定在支持物上，或将细胞嵌入微囊或高分子聚合 物的网络中进行培养。该方法对贴壁依赖性细胞与非贴壁 依赖性细胞均适用。
12-2 植物和动物细胞工程
12.2 植物和动物细胞工程考点一 植物细胞工程1．细胞工程的概念2．植物组织培养技术(1)理论基础——植物细胞的全能性(2)概念：是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。
(3)操作流程→诱导生芽 →诱导生根 →移栽成活(4)操作实例——菊花的组织培养3．植物体细胞杂交技术(1)概念：将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
(2)原理：体细胞杂交利用了细胞膜的流动性，杂种细胞培育成杂种植株利用了植物细胞的全能性。
(3)操作过程(4)意义：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种等。
4．植物细胞工程的应用(1)植物繁殖的新途径(2)作物新品种的培育(3)细胞产物的工厂化生产①次生代谢物：是一类小分子有机化合物，在植物抗病、抗虫等方面发挥作用，也是很多药物、香料和色素等的重要来源。
②细胞产物的工厂化生产：人们利用植物细胞培养来获得目标产物的过程。
③植物细胞培养：是指在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技术。
[概念检测](1)棉花根尖细胞经诱导形成幼苗能体现细胞全能性。
(√)(2)愈伤组织是外植体经脱分化和再分化后形成的。
(×)(3)在愈伤组织培养中加入细胞融合的诱导剂，可获得染色体加倍的细胞。
(×)(4)再生出细胞壁是植物体细胞原生质体融合成功的标志。
(√)[教材拾遗]1．(教材P38)将两个不同种的植物细胞A和B去除细胞壁后，经一定的方法促融，只考虑两两融合，可以形成几种融合细胞？哪种融合细胞才是符合要求的？下一步该如何处理？提示：3种；AB融合细胞是符合要求的；筛选融合细胞，让杂种细胞再生出细胞壁。
3．(教材P38“拓展应用”)为什么“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想象的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？提示：主要原因是生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯—番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，故不能像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达。
动植物细胞培养的主要区别
动植物细胞培养的主要区别第一篇:《动物细胞培养与植物细胞培养的区别》动物细胞培养与植物细胞培养的区别动植物细胞培养的主要区别1.培养基不同：植物细胞（固体培养基），动物细胞（液体培养基）动植物细胞培养的主要区别2.培养基的成分不同：动物细胞培养必须利用动物血清，植物组织培养则不需要，而需要加入植物生长激素3.产物不同：植物组织培养最后一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般不能表达其全能性，因此得到的是只含同一种的细胞的一个细胞系（或者叫细胞群）。
4.原理不同：植物组织培养的原理为植物细胞的全能性，动物细胞培养的原理为细胞的增殖。
动植物细胞培养的主要区别5.过程不同：植物组织培养的过程为脱分化和再分化，动物细胞培养的过程为原代培养和传代培养7.培养目的不同：植物组织培养是为了快速繁殖和获得无病毒植株，动物细胞培养是获得生物制品。
根据培养方式：贴壁细胞培养，半悬浮细胞培养，悬浮细胞培养第二篇:《动物细胞培养和植物细胞培养的比较》动物细胞培养与植物组织培养的对比第三篇:《全国林业有害生物防治知识竞赛题含答案》害预测预报工作的通知》要求，一般常灾区每0.5万一1万亩，偶灾区每亩，无灾区每2万一5万亩，应设一名测报员或病虫情调查员。
在大片林区，可适当增加测报员或病虫情调查员的调查监测面积。
（答案：1万一2万）39、《关于进一步加强森林病虫害预测预报工作的通知》要求，要以或进行病虫情调查，掌握面上的病虫害发生情况。
（答案：林班；小班）40、《关于加强林业有害生物监测预报和突发疫情信息管理的通知》（造防函81号）要求，为了加强林业有害生物监测预报和突发疫情信息报告的管理，各地要严格按照有关要求，新发生（发现）的危险性和发生严重在50公顷以上的林业有害生物必须在日内上报国家林业局。
（答案：7）二、选择题１、1999年以来，我国先后建立了个国家级森林病虫鼠害中心测报点（简称国家级中心测报点）。
（答案：D）Ａ.183；Ｂ.510；Ｃ.490；Ｄ.1000２、《国家级森林病虫害中心测报点管理办法》要求：国家级中心测报点发布的主测对象和当地主要病虫鼠害的预报准确率应为。
动植物细胞培养
CO2的含量水平对细胞的生长 同样相当重要
研究发现,植物细胞能非光合地固定一定浓度 的CO2,如在空气中混以2%～4%的CO2能够 消除高通气量对长春花细胞生长和次级代谢物 产率的影响.因此,对植物细胞培养来说,在 要求培养液充分混合的同时,CO2和氧气的浓 度只有达到某一平衡时,才会很好地生长,所 以植物细胞培养有时需要通入一定量的CO2气 体.
填充床/流化床反应器
填充床反应器
流化床反应器
膜反应器
三,影响细胞培养因素
细胞种质影响 外界因素影响 光照影响 光对黄酮化合物形成的影响,培养物在光照特别 是紫外光下黄酮及黄酮类醇糖苷积累的所有酶活性均 增加.通常光照采用荧光灯,或者荧光灯和白炽灯混 合,其光强度是300～10000lx(6～100m/m2s)可以 连续光照,也可以每天光照12～18h. pH 培养基成分的影响:
第二节 动物细胞培养技术
动物细胞培养开始于本世纪初,到1962年规模 开始扩大,发展至今已成为生物,医学研究和 应用中广泛采用的技术方法,利用动物细胞培 养生产具有重要医用价值的酶,生长因子,疫 苗和单抗等,已成为医药生物高技术产业的重 要部分.大规模动物细胞培养在生物技术产业 化进程中显示出强大的潜力. 利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世 界生物高技术产品市场份额的50%.
已有商品市售无血清培养基主要有下述3 类: ①基本合成培养基; ②基本合成培养基加生长因子; ③基本合成培养基加组织抽提物.
合成培养基的种类虽多,但一般都含有氨 基酸,维生素,碳水化合物,无机盐和 一些其它辅助性成分. 在细胞培养中,大多数细胞需要谷氨酰胺 作为能源和碳源 复杂培养基都含有核苷,柠檬酸循环中间 体,丙酮酸,脂类,氧化还原剂如抗坏 血酸,谷胱甘肽等及其他各种化合物.
第六章 动植物细胞培养
第一节
动植物细胞培养的特性
一、动物细胞培养的特性
技术发展历史：
1907年，美国，Harrison首次将蛙的神经组织在试管内培养 成功。 1950年，Enders及同事发表第一篇在培养细胞中生长病毒的 报告。 1972年，Knazek等创立中空纤维细胞培养技术，使细胞体外 培养扩展为大规模培养。 1986年，Demo生物公司用微囊化技术大规模培养杂交瘤细胞 生产单克隆抗体获得成功。 随后，动物细胞培养技术日趋完善。
维生素：是维持细胞生长的一种生物活性物质，它 们在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞的代 谢有重大的影响。 糖类：多数合成培养基都含有葡萄糖，它主要由糖 酵解作用代谢形成丙酮酸，并可转化乳酸或乙酰乙 酸进入柠檬酸循环形成CO2。对胚胎细胞和转化细胞， 乳酸在培养基中的积累特别明显。 无机离子：是细胞的重要组成部分之一，参与了细 胞的代谢活动。培养基中的无机离子除K+、Na+等外， 还含有Fe2+、Zn2+、Cu2+等微量离子。
生物反应工程原理
李艳 教授
生物科学与工程学院 lymdh5885@ ly5885@
第六章 动植物细胞培养
动植物细胞培养技术：将动植物组织、器官在适当 的培养基上进行离体培养的技术。 组织：指由结构和功能相似的细胞和细胞间质组成， 具有一定形态和生理功能的聚集体。 器官：指机体中具有特殊结构和完成特殊功能的分 化部分。 组织与器官培养：在人工条件下，使它们得以继续 生存或发展的一种培养方法。
1、动物细胞培养的环境要求 2、培养基组成 3、常用的合成培养基 4、培养基制备应考虑的因素
动植物细胞培养的基本原理和操作技巧
动植物细胞培养的基本原理和操作技巧细胞培养是生物学中十分重要的实验技术，可用于各种细胞学、遗传学或生化学的研究。
其中，动植物细胞培养是两大主要领域之一。
本文将对这两种培养细胞类型的基本原理和操作技巧进行介绍。
一、动物细胞培养动物细胞培养是利用无菌条件下的细胞生长基质，通过检测和调整培养环境中的养分浓度、温度、pH值、气体成分等因素，使细胞在体外无限制增殖和分化的技术。
因此，准确掌握动物细胞的培养技术是进行多种细胞学研究的重要基础。
（一）培养基的配制动物细胞培养的基础是培养基的配制。
一般而言，动物细胞培养基可以分为无血清和含血清的培养基两类。
其中，含血清的培养基可以促进细胞生长，因此被广泛使用。
不过，含有血清组分的培养基不仅具有生物反应性，而且批次差异较大，因此需要进行良好的质量控制。
（二）细胞的分离和培养常常采用酶溶解技术将组织中的细胞分离出来，并将其移至培养基中。
其中，组织的分离能力受细胞的外表形态、黏附性等表现的影响。
一般情况下，将由細胞附着在培养基上的组织片漂浮在果葡糖溶液中，比起用酶方案更有效。
在进行培养的过程中，要注意培养基的更换和细胞生长的密度，避免过度生长导致的细胞死亡。
（三）细胞的冻存和解冻细胞的冻存和解冻是进行细胞培养的必须环节。
动物细胞在液氮中冰冻保存时，为保证细胞的完整性及生物活性，需进行冻存液的配置，加数种抗氧化物可提高细胞的存活率。
而在解冻后，应注意细胞的复苏需要时间，因此在解冻后加多种生长因子能够大大提高细胞复苏的效率。
二、植物细胞培养植物细胞培养是将植物细胞通过无性繁殖技术分离、培养在含有营养和生长因子的培养基上，使其在人工环境下继续生长和分化的技术。
其应用范围较广，不仅可用于植物的育种、遗传改良及叶绿素合成的研究，同时还被广泛用于研究植物药物、糖果等领域。
（一）培养基的配制植物细胞培养基在元素组成上与动物细胞培养基有所不同，其中可以添加植物生长素、糖、氨基酸和维生素等物质。
动植物细胞组织培养技术现状及应用实例
动植物细胞组织培养技术现状及应用实例动植物细胞组织培养技术是现代生物科学研究的重要工具，它可以应用在药物研发、农业生产、环境保护等领域。
本文将介绍动植物细胞组织培养技术的现状及应用实例。
一、植物细胞组织培养技术现状植物细胞组织培养技术是指将植物组织、细胞或器官移植到营养饲料中，通过调节培养条件和营养液组成，使其在无土、无阳光的条件下进行生长和繁殖的技术。
植物组织培养技术主要包括植物愈伤组织培养、植物无菌播种等。
目前，植物细胞组织培养技术的应用已经从传统的植物繁殖转移到了植物产生抗性、药用物质和基因转化等方面。
植物组织培养技术的主要应用之一是在植物育种中，例如通过合适的培养条件和营养液配方，可以促进植物遗传变异，产生新的变异体，为植物育种繁殖提供新的材料。
此外，植物组织培养技术还可以用于植物基因工程研究，如通过组织培养体系，将外源基因导入到植物体内，实现对植物性状的基因编辑和调控。
二、植物细胞组织培养技术应用实例1.丹参组织培养产生丹参酮丹参是一种常见的中药材，丹参酮是其中最重要的活性成分之一。
通过植物组织培养技术，可在无污染的条件下，得到大量优质的丹参组织，从中提取出丹参酮，具有较高的药效价值。
2.马铃薯组织培养繁殖马铃薯是世界上重要的蔬菜和淀粉作物之一。
植物组织培养技术可以通过组织切片、愈伤组织的诱导等手段，实现马铃薯的高效繁殖，为农业生产提供了更为丰富的资源。
3.玫瑰无菌苗繁殖玫瑰是世界上重要的观赏花卉之一，通过植物组织培养技术可以实现无菌苗繁殖，克服传统繁殖方式中的传播病害风险，提高玫瑰繁殖的效率和质量。
4.菜豆组织培养产生抗病性菜豆菜豆是我国重要的经济作物之一，由于受病害、虫害、籽粒质量等因素的影响很大，因此，使用植物组织培养技术进行抗性育种具有重要的经济意义。
菜豆组织培养技术可大大缩短育种周期，提高育种效率，是菜豆育种的重要手段之一。
三、动物细胞组织培养技术现状动物细胞组织培养技术是指将动物细胞移植到营养液中，以其自身的生殖能力、分化能力和功能表现进行生长和繁殖的技术。
动物细胞工程常用的技术手段
核移植
胚胎细胞核移植
体细胞核移植 〔难度高〕
受体细胞：MⅡ期的卵 母细胞
第十三页，共四十五页。
Ａ母绵羊 卵细胞
Ｂ母绵羊 乳腺细胞
多莉羊的培育过程
细胞质
细胞核
细胞核移植
融合后的卵细胞
卵裂
早期胚胎
胚胎移植
C母绵羊子宫 妊娠 分娩 多莉羊
第十四页，共四十五页。
克隆动物的研究意义
D．分裂增殖的能力强
第四十三页，共四十五页。
4.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于---
---------------------------〔
〕A
A.培养基不同；
B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；
C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；
D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培
养成植株。
胰蛋白酶 单个细胞
细胞
剪碎
制成 悬浮
去掉组织
液
间蛋白
无限传代
细胞系
动物细胞培养不能
最终培养成生物体
第八页，共四十五页。
细胞株
动物细胞培养条件：
1、无菌、无毒的环境
〔添加一定量的抗生素，定期更换培养液〕
2、营养
〔葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清
等。〕3、温度和PH来自保证细胞顺利的生 长增殖
36.5+〔-〕0.5度, 7.2-7.4
培育成功，证明动物细胞也具
有
。
⑸请举例说明克隆绵羊培育成 功的实际意义： 。
黑面绵羊去 白面绵羊卵 核卵细胞 腺细胞核 a
重组细胞 电脉冲处理
早期胚胎 b
另一头母绵羊子宫
动物细胞培养
第二章
细胞工程
第一节动物细胞培养
什么叫细胞工程？
细胞工程是指应用细胞生物学和分子 生物学的原理和方法，通过细胞水平或细 胞器水平上的操作，按照人们的意愿来改 变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一 门综合科学技术。
1.1细胞培养的概念
是细胞工程中最基础的技术， 它是把机体的某一组织或器官取 出，分散为单个细胞，使其在人 工培养条件下继续生存、生长、 甚至增殖的过程。
原理：细胞增殖
1.2动物细胞培养的条件：
1.无菌、无毒的环境: 培养液和所有培养用具进行无菌处理 措施：培养液中加抗生素，定期更换培养液 2.营养: 糖、氨基酸、无机盐、微量元素、促生长因
4．动物细胞工程常用的技术手段中，最基础的是 （ ） A.动物细胞培养 B.动物细胞融合 C.单克隆杭体 D.胚胎、核移植 5．在动物细胞培养中有部分细胞可能在培养条件下无 限制地传代下去，这种传代细胞称之为: A．原代培养 B．传代培养 C．细胞株 D．细胞系 6．卫生部2005年4月6日发布了《苏丹红危险性报告评 估》，报道中提到苏丹红一号是一种人工色素(工业染 料)，它在人体内代谢生成相应的胺类。科研人员欲采用 一定的技术手段探究苏丹红是否对人体有危害，你认为 采取下列哪种技术手段最合适： A．动物细胞融合 B．动物细胞培养 C．胚胎移植 D．核移植
5、在动物细胞培养的有关叙述中，正确的是（B ）
A．动物细胞培养的目的就是为了获得大量的细胞分 泌蛋白 B．动物细胞培养前要用胰蛋白酶处理使细胞分散 C．细胞遗传物质的改变发生于原代培养过程中 D．培养至50代后继续传代的细胞是细胞株 6、在动物细胞培养中有部分细胞可能在培养条件下无 限制地传代下去，这种传代细胞称之为（ D ） A．原代培养 B．传代培养
动植物细胞培养产酶
合成其所对应的酶；mRNA稳定性差的，就随着细胞生长进入
平衡期而停止酶的生物合成； 不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长 而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞 生长一段时间甚至在平衡期后， 酶才开始合成并大量积累。
第三节 酶生物合成的模式
理想的酶合成模式
发酵产酶， 为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合 成模式应是延续合成型：在发酵过程中没有生长期和产酶期的 明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平 衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。 对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先 进技术,选育得到优良的菌株, 并通过工艺条件的优化控制, 使他 们的生物合成模式更加接近于延续合成型。
and
Monod的工作：
第三节 酶生物合成调节
第三节 酶生物合成调节
3、分解代谢物阻遏：
分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直 接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程 中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。
第三节 酶生物合成的模式
细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历调整 期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段 。 把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续 合成型，中期合成型和滞后合成型。
。 机与速度。
4.结构基因：决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关 系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。
第三节 酶生物合成调节
2、原核生物酶合成调节的操纵子类型： （1）诱导 Induction 组成酶(constitutive enzymes)：细胞固有的酶类。 诱导酶(inducible enzymes：细胞为适应外来底物或其结构类似 物临时合成的一类酶。 。
动植物细胞培养的基本原理和操作技巧
动植物细胞培养的基本原理和操作技巧动植物细胞培养是一种重要的生物学技术，可以用来研究细胞生物学，生长发育，细胞分化，细胞遗传学等方面的问题。
其基本原理是将动植物组织中的细胞分离，并通过合适的培养基和条件来促进细胞的增殖和分化，使其在体外生长和繁殖。
1.细胞分离：首先将动植物组织样品进行无菌处理，然后将其分离成单个的细胞，可以通过机械切割，酶解、搅拌、过滤等方法进行。
2.细胞培养基：细胞培养需要合适的培养基，其中包含生长所需的营养物质，如糖类、氨基酸、维生素等。
同时，还需要添加适当的生长因子和激素，以促进细胞的增殖和分化。
3.细胞培养条件：细胞培养需要适宜的环境条件，如温度、pH值、湿度等。
一般来说，细胞培养的温度范围是20-30°C，pH值在6-8之间，无菌操作和生物安全措施也是重要的。
1.无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，否则会导致细胞的感染和杂交。
无菌操作包括对培养器具、培养基、工作表面进行消毒，使用无菌技术操作，以及避免感染源等。
2.细胞分离：细胞分离是细胞培养的关键步骤，需要根据组织类型和目的选择适当的方法。
对于植物细胞，可以使用酶解法将组织切割成小块，然后用酶解液消化细胞壁。
对于动物细胞，可以使用组织切割器具进行机械分离，或者用酶解液消化细胞间粘连。
3.细胞培养：将分离的细胞均匀地放置在含有适当培养基的培养器具上，继续培养。
培养器具可以是培养皿、试管等，培养基可以根据需要选择不同种类。
在培养过程中，需要定期观察细胞生长情况，及时补充培养基。
4.细胞增殖和分化：通过添加适当的生长因子和激素，可以促进细胞的增殖和分化。
生长因子可以是植物激素、生长因子，如植物生长素、激素等。
激素可以是动物生长激素、血清、培养基中的成分等。
这些因子能够模拟细胞在体内的生长环境，促进细胞发育和分化。
5.细胞传代：当细胞生长至密集，容器中细胞数量过多时，需要进行细胞传代，将细胞重新分离和培养。
细胞传代可以通过机械分离、酶解分离等方法进行，然后将细胞悬浮于新的培养基中继续培养。
动植物细胞的培养
大规模培养的方法
1. 悬浮培养：即让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。它适用于一切种类
的非贴壁依赖性细胞(悬浮细胞)，也适用于兼性贴壁细胞。该培养方法的优
点是操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模， 在培养设备的设计和实际操作中可借鉴许多有关细菌发酵的经验。不足之 处是由于细胞体积较小，较难采用灌流培养(perfused culture)，因此细胞密 度一般较低。目前在生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌罐式生物
养箱中价值的生物制品，如病毒疫苗、干扰素、
单克隆抗体等。
2. 应用于基因工程(作受体细胞)。 3. 检测有毒物质，判断某种物质的毒性。 4. 培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理
等方面的研究。
细胞的冻存和复苏
1. 细胞的冻存 细胞和整体生物一样，当温度降低时，它的代谢也降低，从而大大的延 长了它的存活期。因此目前为了保存细胞，都采用液氮低温(-196 ℃)冻存的 方法。用该法细胞可保存几年，甚至几十年。在冻存过程中，渗透压的改变 会影响到脂蛋白，使细胞膜破裂。为了防止电解质过分浓缩，可采用某些保 护剂，如甘油和二甲基亚砜。它们的相对分子质量低，溶解性好，容易渗入 细胞。在冷冻时，冷冻速度很重要，不能太快也不能太慢。太慢会产生冰晶 损伤细胞，太快不足以使水分排出。一般要求以 1℃/min 的速度下降为宜。 在无定速降温设备时，可按如下三种方法之一处理：①将安瓿(bù)放在 壁厚为 1.5 cm 的聚乙烯盒内，然后放在 -70℃ 冰箱内 2 h，再转入液氮。②先 将安瓿臵 4℃ 冰箱 4~5h 或过夜，再移至 -70℃ 冰箱内 2 h，再悬于液氮罐颈 口 1 h，最后浸人液氮。③放在冻存简易装臵内，里于液氮罐颈口，离液氮面 5~10 cm，2~3 h 后浸入液氮。
动物细胞工程常用的技术手段：
分散成单个细胞
1
2
细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，
称为细胞贴壁。
要求： 培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。
细胞的接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
3.动物细胞生长特性：
4.过程：
细胞悬浮液
10代细胞
50代细胞
D
1
2
动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于------------------------------（ ）
培养基不同；
动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；
动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；
动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培 养成植株。
A
重组细胞
早期胚胎
另一头母绵羊子宫
克隆绵羊多莉
a
b
电脉冲处理
妊娠、出生
⑴写出 ａ、ｂ所指的细胞工程各称：ａ ｂ 。 ⑵实施细胞工程ａ时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是： 。 ⑶多莉面部的毛色是 ，判断依据： 。 ⑷继植物组织培养之后，克隆绵羊培育成功，证明动物细胞也具有 。 ⑸请举例说明克隆绵羊培育成功的实际意义： 。
植物体细胞杂交的意义：
（二）动物细胞融合
1.过程：
诱导方式
物理法
化学法
生物法：
灭活的病毒
仙台病毒
紫外线
丧失感染性
（不感染细胞）
保留融合活性
（诱导细胞融合）
（二）动物细胞融合
1.过程： 灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面 细胞膜被病毒颗粒穿通 细胞膜连接 细胞融合，形成杂种细胞 （细胞膜具有一定的流动性）
主要用于制备
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6、激素和生长因素
合成培养基的优点：来源方便，标准化产品； 缺点：不能完全满足细胞的生长需求，通常还需要加入一定量 的天然培养基予以补充。
动物细胞的培养方式
⒈ 悬浮培养 让细胞自由的悬浮于培养基内生长繁殖。 ⒉ 贴壁培养 让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。 ⒊ 贴壁-悬浮培养 ⑴ 微载体培养 ⑵ 包埋和微囊培养 ⑶ 结团培养
理想微载体：
表面性质与细胞相容性好，适合附着、伸展、增殖
材料无毒性 惰性材料，不与培养基反应、不吸收营养
比重1.030-1.045g/ml，搅拌悬浮、静止沉降
溶胀后粒径60-250μm，差异不大于20μm 光学透明性好
基质软性，减少搅拌时损伤细胞
可耐1200C高温 经简单处理后可反复使用
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
原料充分、制作简便、价廉
B、悬浮型或非贴壁依赖型
非依赖型细胞能以悬浮的、游离的形态 进行深层培养。来源于血液、淋巴组织 的细胞和其他转化细胞均属于这一类型 细胞，可采用类似于微生物培养的方式 进行悬浮培养。悬浮培养时细胞呈圆形。
二、动物细胞系的获取和建立
游离动物细胞的制备 杂交细胞的获得 通过细胞融合技术，可将高效表达目标蛋白的异源 细胞的遗传物质转移至所选择的可快速增殖的亲本细胞 中，获得杂交细胞。 PEG诱导融合和电场诱导融合是目前常用的细胞促 融手段。 杂交细胞的筛选 筛选的机理是：将细胞融合后所得的各类型的细胞 混合物接种于选择性培养基上，终止同型双核或多核融 合子、异型多核融合子及未融合亲本细胞的繁殖。 目前最常用的筛选系统（或方法）有：HAT筛选系 统、抗药性筛选系统和营养互补筛选系统。
培养基
B、血清
1、常用血清：
小牛血清、胎牛血清、马血清、人血清
添加血清有助于细胞贴壁和生长。 2、血清提供的主要成分： 蛋白质、多肽、激素、代谢物和营养物、无机物
天然培养基的优点：营养成分丰富，培养效果好； 缺点：来源有限，成分复杂，个体差异大。
培养基
C、合成培养基
1、氨基酸 2、维生素 3、盐 4、葡萄糖 5、有机添加剂
非常复杂 较复杂 慢，倍增时间 慢，倍增时间 为15－100小 为24－74小时 时 内部、激素 内部、激素
动植物细胞培养和微生物培养的比较（续）
比较项目
微生物
哺乳动物细胞 非常敏感，仅 忍受很窄范围
植物细胞 能忍受广泛范 围
环境敏感性 细胞分化
剪切力敏感 传统变异、 筛选技术 细胞或产物 浓度
能忍受广泛范围 无
四、影响植物细胞培养的因素及优化策略
植物细胞培养基的组成
与动物细胞培养不同，植物细胞可在简单合成培养 基上生长。 （1）碳源
（2）有机氮源
（3）无机盐类 （4）植物生长激素 （5）有机酸 （6）复合物质
影响植物细胞培养的因素
（1）细胞的遗传特性 （2）温度 （3）pH值 （4）营养成分
（5）光
3、贴壁-悬浮培养
（1）微载体培养
扩大贴附面积、保持悬浮状态
葡聚糖类、聚苯乙烯类、胶原类
动物细胞微载体培养技术
贴壁依赖型细胞在微载体表面上的增殖，要经历粘附 和贴壁、生长及扩展成单层3个阶段。 提高细胞与微载体表面的相溶性，是提高细胞贴壁速 率和贴壁比率的必要条件。动物细胞在生理pH条件下 通常带负电荷，微载体需采用特殊处理技术使颗粒表 面带正电荷，具可润湿性。 用血清蛋白或合成蛋白、聚糖氨酸等物质包被于微载 体表面，可以促进细胞贴壁。 微载体有实心微载体和大孔微载体两大类。大孔微载 体培养动物细胞类似于包埋培养，细胞在孔内生长， 具有很高的安全性，搅拌引起的剪切损伤已不成为主 要考虑的因素。
一、动物细胞的类型
动物细胞的形态
A、贴壁依赖型
依赖型细胞的生长繁殖需要一个固体支撑物。体外培养时，依赖型细胞 通过改变表面形态形成称为“假足”的突出物，借以吸附在培养器皿内 壁或其他固体支撑物上。大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多 异倍体细胞和原核细胞均属此类型。
1、成纤维细胞（fibroblast 或mechanocyte type) 2、上皮细胞（epithilium cell) 3、游走细胞（wondering cell） 4、多形性细胞（polymorphic cell)
（3）植物细胞在培养中后期（对数生长期的 中后期）易凝集成为较大尺寸（300～400 μm） 的团块。细胞表面高分子粘性物质的存在是形 成细胞团的原因。细胞团的产生和生长使培养 液的流变学特性发生改变，培养液表观粘度增 大。 （4）植物细胞的培养过程通常为好氧过程。 植物细胞代谢所需的氧量低于微生物，适当地 控制供氧速度是保证植物细胞生长和产物代谢 的重要条件。
定特征的细胞株。
二倍体细胞有正常细胞的特点
①染色体组型是 2n 核型；
②贴壁依赖接触抑制；
③可传代培养50代；
④无致瘤性。
3、转化细胞系
通过某个转化过程形成的，常由于染色 体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点， 而获得无限增殖能力。 转化过程可以是自发的、人工的、从动 物肿瘤组织中建立。
4、融合细胞系
（6）搅拌和通气 （7）前体 （8）生长调节剂
愈伤组织器官发生途径
小 麦
芽分化 愈伤组织
再生苗
二、植物培养过程特性
植物细胞悬浮培养特性： （1）植物细胞的外形比微生物细胞大得多， 一般直径约30～100 μm，有纤维素细胞壁。 植物细胞虽有较强的抗张强度，但抗剪切能力 较弱，搅拌引起的高剪切力易损坏植物细胞的 结构。 （2）植物细胞生长速度慢，对数生长期中细 胞倍增时间通常为30～72 h。培养过程易染菌， 常在培养基中添加抗生素。
植物细胞培养技术
概述
植物组织和细胞培养 幼苗及较大植株的培养—植物培养
外植体增殖形成的愈伤组织培养—愈伤组织培养
离体细胞或较小细胞团的液体培养—悬浮培养
离体器官的培养—器官培养
胚胎的离体培养—胚胎培养
一、植物细胞的获取
外植体的选择：外植体的选择取决于研究或生产的目 的。必须正确地判断植株中合成所需的次生物质的主 要部位。 外植体的消毒与接种：消毒剂的选择及处理程序需依 外植体对消毒剂的敏感程度而定。次氯酸钠、过氧化 氢、高汞等消毒剂可供选用。 愈伤组织的生成：培养基中含有适量的生长调节物质 。 细胞株的建立：从愈伤组织得到游离细胞和小细胞团， 筛选并建立优良的单细胞无性繁殖系。 高产细胞株的筛选：筛选目标产物合成速度快的突变 株。
低 广泛使用 较高
有
非常高 不常使用 低
有
高 有时使用 低
四、动物细胞的大规模培养及过程控制
培养基
A、物理性质
1、pH值： 正常成纤维细胞：pH7.4—7.7；转化细胞：pH7.0—7.4。
酚红的呈色：
pH 呈色 6.5 黄色■ 7.0 橙色■ 7.4 红色■ 7.6 红带蓝■ 7.8 紫色■
2、温度 不同来源的动物细胞，其最适生长温度不同。 人和哺乳动物的最适生长温度是37 ℃，而昆 虫细胞的最适生长温度为25～28 ℃。动物细 胞的培养温度必须严格控制，允许波动范围在 ±0.25 ℃之内。 3、通气与搅拌 溶解氧是细胞代谢所必需的。动物细胞培养过 程中溶氧浓度必须适中，溶氧浓度过高可能对 细胞产生毒害作用，但当溶氧浓度过低时，又 成为细胞生长的限制因素。
1、悬浮培养 适合非贴壁依赖细胞、兼性贴壁细胞 操作简便、培养条件均一、传质和传氧较好、 易扩大培养规模 细胞体积小、难采用灌流培养、细胞密度低 通气搅拌罐式与气升式生物反应器
2、贴壁培养 适合贴壁细胞、兼性贴壁细胞 优/缺点与悬浮培养相反 在传代或扩大培养时需要酶将细胞从基质上 消化下来（胰酶、二乙烯四乙酸钠/EDTA、胰 酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA、胶原酶、链霉蛋 白酶、木瓜酶等）
2.3 动物细胞培养技术
1962年，实现了仓鼠肾细胞（BHK）的 大规模培养，这一成果标志着动物细胞 大规模培养技术的成熟与商业应用时代 的开始。 1975年，成功融合了小鼠B淋巴细胞和 骨髓瘤细胞，构建了能生产特定单克隆 抗体的杂交瘤细胞系。 1986年，首次成功地用微囊化技术大规 模培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体。
三、植物细胞培养方式
分批培养法：可实施两阶段培养的优化策略，第 一阶段以植物细胞最大增殖为主要控制目标，第 二阶段以次生物质最快合成为主要控制目标。 补料分批培养法：在对数生长期中后期，流加营 养物和/或前体物质，维持培养液中目标产物合成 所需的组分对于提高次生物质的生成速度是必要 的。采用半连续培养法，可延长产物合成期，有 利于提高目标产物的产率。
仙台病毒融合法 聚二乙醇融合法 电融合法
三、动物细胞培养特性
动植物细胞培养和微生物培养的比较
比较项目 大小 悬浮生长 营养要求 生长速率 代谢调节
微生物 1－10μm 可以 简单 快，倍增时间为 0.5-5小时 内部
哺乳动物细胞 10－100μm
植物细胞 10－100μm
可以，但易成 多数细胞需贴 团，无单个细 壁生长 胞
生产用动物细胞的要求
原代细胞
二倍体细胞系
转化细胞系
1、原代细胞 是直接取自动物组织器官经过粉碎消化而 获得的细胞悬液（109/g）。 需要大量动物，费钱费劳力。 鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、 淋巴细胞。
2、二倍体细胞系
原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞
成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一