毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用

收稿:2008年8月,收修改稿:2008年9月

　3国家自然科学基金项目(N o.20875009)和国家重点基础研究发展规划(973)项目(N o.2007C B914101)资助33C orresponding author e 2mail :qu fengqu @

毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸

适配体筛选中的应用

3

屈　锋

133

　刘　允1　任肖敏1　赵新颖2　张经华

2

(1.北京理工大学生命科学与技术学院　北京100081;2.北京市理化分析测试中心　北京100089)

摘　要　核酸适配体是指通过指数富集配体系统进化(SE LEX )技术从随机寡核苷酸文库中筛选得到的

高亲和性与特异性的寡核苷酸序列配体。毛细管电泳是高效、快速、低成本的微量分离分析技术。应用毛细管电泳高效、快速筛选核酸适配体是近几年出现的新方法。本文介绍了核酸适配体筛选过程中的主要分离方法如亲和色谱、醋酸纤维素膜、凝胶电泳和磁性分离等方法,并对近年来毛细管电泳在核酸适配体中的亲和作用研究以及用于核酸适配体筛选(CE 2SE LEX )的主要方法(ECEE M ,NECEE M ,N on 2SE LEX 和三者比较)和研究进展进行了综述。

关键词　核酸适配体　毛细管电泳　核酸适配体筛选中图分类号:O65718;Q524　文献标识码:A 文章编号:10052281X (2009)07Π821576207

Application of C apillary E lectrophoresis in Aptamers

Study and Aptamers Sieving

Q üFeng

133

　Liu Yun 1

　Ren Xiaomin 1

　Zhao Xinying 2

　Zhang Jinghua

2

(1.School of Life Science &T echnology ,Beijing Institute of T echnology ,Beijing 100081,China ;

2.Beijing Center for Physical and Chemical Analysis ,Beijing 100089,China )

Abstract Aptamers ,DNA or RNA olig onucleotides obtains by systematic ev olution of ligands by exponential enrichment (SE LEX )from a random olig onucleotide library ,which exhibit high affinity and specificity to a wide variety of targets.Capillary electrophoresis ,a micro 2separation method with advantages of high performance ,high speed and low cost ,has been applied in aptamers sieving in recent years.This article introduces the separation methods in aptamers sieving process such as affinity chromatography ,nitrocellulose filter ,gel electrophoresis ,magnetic bead separation and s o on.The aptamer affinity interaction studied by capillary electrophoresis ,the methods of CE 2SE LEX (ECEE M ,NECEE M ,N on 2SE LEX and com paris on of them )in aptamer sieving and advances of CE 2SE LEX are reviewed.

K ey w ords aptamers ;capillary electrophoresis ;aptamer sieving

Contents

1　Introduction

2　Separation methods in SE LEX

3　Studied of aptamers affinity interaction by capillary

electrophoresis

4　Capillary electrophoresis methods in aptamers sieving

411　NECEE M 412　ECEE M 413　N on 2SE LEX

414　C om paris on of NECEE M ,ECEE M and N on 2SE LEX 5　Application of CE in aptamers sieving 6　Prospects

第21卷第7Π8期2009年8月

化　学　进　展

PROG RESS I N CHE MISTRY

V ol.21N o.7Π8

　Aug.,2009

1　引言

SE LEX技术(systematic ev olution of ligands by exponential enrichment),即指数富集配体系统进化技术,通过靶分子与大容量化学合成的随机寡核苷酸(主要是ssDNA和RNA)文库作用,将所形成的靶分子2寡核苷酸复合物与游离寡核苷酸分离,再利用PCR体外扩增技术对形成复合物的寡核苷酸进行扩增。通过对可与靶分子特异结合的寡核苷酸进行数轮反复的体外筛选、扩增,达到指数级富集的效果,最终获得与靶分子有特异结合作用的核酸适配体。

1990年,Tuerk[1]和E llington等[2]先后筛选出针对不同靶分子并具有独特结构的RNA和ssDNA序列,并将其称为“aptamer”。Tuerk[1]研究了噬菌体T4 DNA聚合酶(gp43)与mRNA的核糖体结合位点的相互作用,并从含110bp的随机RNA库中筛选出了gp43的RNA aptamer。E llington等[2]从含150bp随机序列的RNA库中筛选出6种有机小分子染料(cibacron blue3G A,reactive red120,reactive yellow86, reactive brown10,reactive green19和reactive blue4)的aptamer。1992年,E llington等[3]又从一个含157bp 的随机序列ssDNA库中筛选出3种染料(cibacron blue、reactive green19和reactive blue4)的aptamer。

尽管ssDNA和RNA有所差别,但SE LEX技术筛选到的ssDNA aptamer与RNA aptamer都是以相同方式识别和结合靶分子,都是通过寡核苷酸链内碱基相互作用折叠形成稳定的特殊三维结构,如发卡、假结、凸环、G2分体等,并构成了与靶分子的特异结合位点。与一般的亲和作用配体相比,aptamer的亲和力高,特异性强,稳定性好,而且容易制备及修饰。此外aptamer所针对的靶分子范围极广,蛋白质类分子(受体蛋白、酶、膜蛋白、抗体、生长因子等)、激素、肽、药物分子、糖、有机染料及小分子、无机离子等理论上均存在其对应的aptamer。Aptamer具有高度的分子识别能力,其与靶分子结合的特异性可与抗体媲美。由于它是通过化学合成获得,故不仅稳定性明显优于抗体,而且比抗体更容易制备。在疾病诊断和药物治疗等领域的应用研究中,aptamer与抗体相比,其分子量小,因此更易穿过细胞膜,具有易被血液清除且无免疫原性等突出优点[4]。因此aptamer被誉为“人工抗体”。

Aptamer的获得依赖于SE LEX技术的应用。在筛选aptamer过程中,高效快速的分离游离寡核苷酸和aptamer2靶分子复合物是提高筛选速度和效率的关键,也是限制SE LEX技术发展的一个难点。毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)作为一种微量分析方法已广泛应用于各种生物大分子、药物分子、有机酸和无机离子的分析,且具有分离速度快、分辨率高、操作简单、样品用量少和研究成本低等明显优势。CE还是研究靶分子与配体亲和作用的重要方法之一。近几年的研究结果表明CE用于aptamer的筛选可使筛选效率和筛选速度大大提高,是一种新的高效筛选方法(CE2SE LEX)。

2　SE LEX筛选中的分离方法

SE LEX技术筛选aptamer的筛选过程是:(1)通过化学合成的方法制备一个寡核苷酸库,对于一个碱基数为n的寡核苷酸库,它包含4n个不同的寡核苷酸序列。这些单链核苷酸由于链内碱基间的配对、静电作用及氢键作用等发生自身折叠,形成一些稳定的三维空间结构。(2)将这些具有空间结构的寡核苷酸序列与靶分子作用,结合形成稳定的复合物。(3)选择适宜的分离方法将结合靶分子的序列与未结合靶分子的序列分离,收集与靶分子结合的寡核苷酸分子。(4)以结合的寡核苷酸分子为模板进行PCR扩增,获得一个亲和性更强的新的寡核苷酸库。将此新库用于下一轮筛选,如此进行多次循环,最后对所得的序列进行测序。在aptamer筛选过程中,随着循环次数的增加,富集到靶分子上的DNA或RNA序列的亲和作用越来越强,直到其亲和作用达到饱和,即富集到的DNA或RNA序列占据了靶分子上所有的结合位点,由此产生了高亲和力的aptamer。

应用SE LEX技术筛选aptamer的关键步骤之一是对结合靶分子的序列与未结合靶分子序列进行高效分离。亲和色谱是常用的分离方法之一,即将大量靶分子固定在琼脂糖或葡聚糖固定相上,使寡核苷酸库溶液作为流动相通过。溶液中的寡核苷酸与靶分子发生亲和作用而结合到固定相上,再将结合的寡核苷酸进行洗脱,即可得到aptamer。在亲和色谱分离中,靶分子能否有效地固定在固定相上以及对aptamer的洗脱决定了分离的效率。Storm o等[5]以锌指蛋白EG R为靶分子进行aptamer筛选,指出亲和色谱法作为SE LEX技术中的分离方法可以有效地获得更多的DNA结合位点,且aptamer2蛋白质复合物易于与游离DNA分离。硝酸纤维素膜超滤法是另一种较常用的分离方法。一定孔径的硝酸纤维素超滤膜可以选择性地截留复合物而使游离的寡

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第7Π8期屈　锋等　毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用