第11章 分子荧光分析法
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荧光分析
荧光—荧光分析法
光致发光：以光源来激发而发光 磷光—磷光分析法
电致发光：以电能来激发而发光—原子发射光谱法 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光(研究 热点） 化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分 析法
4
警报水母 冷光扇菇
发光虫 叶状栉水母
灯笼蘑菇 萤火虫
夏威夷短尾乌贼 5
腰鞭毛虫
二、分子荧光分析法的特点
配一标准溶液浓度为Cs， Cs与未知液浓度Cx相 近，并在相同条件下测定它们的荧光强度
未知液 标准液
If x = KCx 比较 If s = KCs
I fx Cx I fs Cs
Cx Cs I fx 若有试剂空白，测得的荧光强度减去空白后 I fs
Cs I fx I f 0 I fs I f 0
激光荧光分析 时间分辨荧光分析 同步荧光分析 胶束增敏荧光分析
46
以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度 为横坐标
If
浓度
C1 C2 C3 C4 C5 Cx Ifx
荧光强度 If1 If2 If3 If4 If5 Ifx
Cx
C
33
2. 荧光猝灭法
把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性 若荧光物质 M 与猝灭剂 Q 生成不发荧光的基态配合物
式中为荧光量子效率，又根据Beer定律
Ia = I0 - It = I0(1- e - l C)
I0和It分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得
If = I0(1- 10 - l c) = I0(1- e -2.3 l c)
31
整理得： If =2.3 I0 lc
当入射光强度I0 和l一定时，上式为：
光致发光：以光源来激发而发光 磷光—磷光分析法
电致发光：以电能来激发而发光—原子发射光谱法 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光(研究 热点） 化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分 析法
4
警报水母 冷光扇菇
发光虫 叶状栉水母
灯笼蘑菇 萤火虫
夏威夷短尾乌贼 5
腰鞭毛虫
二、分子荧光分析法的特点
配一标准溶液浓度为Cs， Cs与未知液浓度Cx相 近，并在相同条件下测定它们的荧光强度
未知液 标准液
If x = KCx 比较 If s = KCs
I fx Cx I fs Cs
Cx Cs I fx 若有试剂空白，测得的荧光强度减去空白后 I fs
Cs I fx I f 0 I fs I f 0
激光荧光分析 时间分辨荧光分析 同步荧光分析 胶束增敏荧光分析
46
以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度 为横坐标
If
浓度
C1 C2 C3 C4 C5 Cx Ifx
荧光强度 If1 If2 If3 If4 If5 Ifx
Cx
C
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2. 荧光猝灭法
把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性 若荧光物质 M 与猝灭剂 Q 生成不发荧光的基态配合物
式中为荧光量子效率，又根据Beer定律
Ia = I0 - It = I0(1- e - l C)
I0和It分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得
If = I0(1- 10 - l c) = I0(1- e -2.3 l c)
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整理得： If =2.3 I0 lc
当入射光强度I0 和l一定时，上式为：
第十一章荧光分析法
15
16
5）荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态 (S1 → S0)发射荧光的过程约为： 10-7～10 -9 s 。由于振动弛豫 和内转换损失部分能量，发射荧光的能量比分子吸收的能量小， 波长要长； 6）磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态 （ T1 → S0跃迁）；磷光能量更低，波长更长。 发光速度很慢： 10-4～10 s ，光照停止后，可持续一段时间
hγ（荧光）
几率小（禁阻）
10-8s
hγ（磷光）
10-4~10s
能量： S2 ＞T2 ＞ S1 ＞ T1 ＞ S0
6
7
8
1）振动弛豫 激发态分子通过与溶剂分子碰撞而将部分能量传
递给溶剂分子，其电子由同一电子能级激发态的较 高振动能级回到最低振动能级的过程。10-12 s 2）内部能量转换
两个电子激发态能级相差较小，振动能级部分重 叠，电子由高电子能级转移到低电子能级的过程。
9
10
1）振动弛豫 激发态分子通过与溶剂分子碰撞而将部分能量传
递给溶剂分子，其电子由同一电子激发态的较高振 动能级回到较低振动能级的过程。10－12 2）内部能量转换
两个电子激发态能级相差较小，振动能级部分重 叠，电子由高电子能级转移到低电子能级的过程。
11
12
3）外部能量转换 激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子碰撞以热
21
二、荧光与分子结构 1.分子产生荧光必须具备的条件 1）具有合适的结构—有强的紫外可见吸收； 2）具有一定的荧光量子产率。
荧光量子产率：
发射荧光的光子数
f 吸收激发光的光子数
2.荧光寿命：除去激发光源后，分子的荧光强 度降低到最大荧光强度的1/e所需要的时间
16
5）荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态 (S1 → S0)发射荧光的过程约为： 10-7～10 -9 s 。由于振动弛豫 和内转换损失部分能量，发射荧光的能量比分子吸收的能量小， 波长要长； 6）磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态 （ T1 → S0跃迁）；磷光能量更低，波长更长。 发光速度很慢： 10-4～10 s ，光照停止后，可持续一段时间
hγ（荧光）
几率小（禁阻）
10-8s
hγ（磷光）
10-4~10s
能量： S2 ＞T2 ＞ S1 ＞ T1 ＞ S0
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1）振动弛豫 激发态分子通过与溶剂分子碰撞而将部分能量传
递给溶剂分子，其电子由同一电子能级激发态的较 高振动能级回到最低振动能级的过程。10-12 s 2）内部能量转换
两个电子激发态能级相差较小，振动能级部分重 叠，电子由高电子能级转移到低电子能级的过程。
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1）振动弛豫 激发态分子通过与溶剂分子碰撞而将部分能量传
递给溶剂分子，其电子由同一电子激发态的较高振 动能级回到较低振动能级的过程。10－12 2）内部能量转换
两个电子激发态能级相差较小，振动能级部分重 叠，电子由高电子能级转移到低电子能级的过程。
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3）外部能量转换 激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子碰撞以热
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二、荧光与分子结构 1.分子产生荧光必须具备的条件 1）具有合适的结构—有强的紫外可见吸收； 2）具有一定的荧光量子产率。
荧光量子产率：
发射荧光的光子数
f 吸收激发光的光子数
2.荧光寿命：除去激发光源后，分子的荧光强 度降低到最大荧光强度的1/e所需要的时间
第十一章 荧光分析法.ppt2
⑹磷光发射 激发态分子经过系间跨越到达激发三重态 后，并迅速的以振动弛豫到达第一激发三重态 (T1)的最低振动能级上，第一激发三重态分子 的最低振动能级上，第一激发三重态分子 经发射光子返回基态。此过程称为磷光。 经发射光子返回基态。此过程称为磷光。 磷光发射是不同多重态之间的跃迁(T 磷光发射是不同多重态之间的跃迁(T1→ S0) 属于“禁阻”跃迁， 属于“禁阻”跃迁，因此磷光的寿命比荧光要 长 的多，约为10 10s。所以， 的多，约为10-3s～10s。所以，将激发光从磷 光样品移走后，还常可观察到发光现象， 光样品移走后，还常可观察到发光现象，而荧 光发射却观察不到该现象。 光发射却观察不到该现象。
⑸体系间跨越 系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁 该过程是激发态电子改变其自旋态， 该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多 重性发生变化的结果。 重性发生变化的结果。 当两种能态的振动能级重叠时， 当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几 率增大。 率增大。 S1→T1即是单重态到三重态的跃迁，即较低单 即是单重态到三重态的跃迁， 重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠， 重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠，这 种跃迁是“禁阻”跃迁。 种跃迁是“禁阻”跃迁。
⒉荧光发射光谱 通过固定激发波长，扫描发射(即荧光测定) 通过固定激发波长，扫描发射(即荧光测定) 波长所获得的荧光强度( 波长所获得的荧光强度(F)—发射波长(λem)的关 发射波长( 系的曲线为荧光发射曲线。 系的曲线为荧光发射曲线。 荧光光谱反映了在相同的激发条件下， 荧光光谱反映了在相同的激发条件下，不同 波长处分子的相对发射强度。 波长处分子的相对发射强度。 荧光光谱可用于荧光物质的鉴别， 荧光光谱可用于荧光物质的鉴别，并作为荧 光测定时选择恰当的测定波长或滤光片。 光测定时选择恰当的测定波长或滤光片。
第十一章 分子发光―荧光、 磷光和化学发光光谱法Molecular .
已逐步形成一支在这个研究领域中的工作队伍，研究内
容2已020从/6/15经典的荧光分析方扩展到新近发展起来的新技术。
返回第一张
上一张幻灯片 下一张幻灯片
§11－1 分子荧光和磷光光谱法
1．产生机理
在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动 能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化 学能或光能等到)后天激发为激发态。激发态是很 不稳定的，它得很快地释放出能量又重新跃迁回 基态。若分子返回基态时以发射的电磁辐射(即光) 的形式释放能量，就称为“发光”；如果物质的 分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的 电磁辐射，称为荧光和磷光。现从分子结构理论 来讨论荧光和磷光的产生机理。
进入二十世纪以后，荧光现象被研究得更多了，在理论 或实验技术上都得到极大的发展。特别是随着激光、计 算机和电子学的新成就及技术的引入，大大推动了荧光 分析法在理论上及实验技术的发展，出现了许多新的理 论和新的方法。
在我国，二十世纪五十年代初期仅有极少数的分析工作
者从事荧光分析方面的研究工作。到了 下一张幻灯片
磷光也是某些物质受紫外光照射后产生的光。1944年 Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的不同概念，指出磷光 是分子从亚稳的激发三重态跃迁回基态所发射出的光， 它有别于从激发单态跃迁回基态所发射的荧光。磷光分 析法由于其有某些特点，几十年来的理论研究及应用也 不断得到发展。
2020/6/15
返回第一张
上一张幻灯片 下一张幻灯片
处于分子基态单重态的分子轨道上的电子，激发 时不能直接跃迁至第一激发三重态轨道上（不符 合光谱选择定则），但处于单重激发态的轨道上 的电子，可以通过体系跨越（系间窜跃），转移 到三重态轨道上；在这个过程中，处于激发态的 电子自旋发生变化，这个过程需要时间较长，故 处于三重激发态的寿命为10－4~1s；当其由三重激 发态的最低振动能级跃迁回基态时产生磷光。
2014第十一章荧光分析法解析
A. 苯 B. 联苯 C. 萘 D. 芴 E.蒽 （5）下列说法中正确的是（ ）
A. 长共轭结构使得分子的荧光波长向短波方向移动。 B. 分子的刚性越强，荧光强度越小。 C. 给电子取代基可导致荧光增强。 D. 吸电子取代基可导致荧光增强。
Cx
Fx Fs
F0 F0
C s
31
第三节 荧光分光光度计和分析新技术
滤光片荧光计 滤光片－单色器荧光计 荧光分光光度计
32
一、荧光分光光度计
1. 主要部件
源发光源（氙灯）、激发单色器、样品池、发射单色器、检测系统
荧光分光光度计结构示意图 1.光源
2、4、7、9. 狭缝 3.激发单色器
5.样品池 6.表面吸光物质 8.发射单色器 10.检测器 11.放大器 12.指示器 13.记录器
内部能量转换
当两电子激发态能量相差较小以致其振动能级有重 叠时，受激分子由高电子能级转移致低电子能级的 过程。
（振动失活在同样多重态间进行，如S2* S1*）
5
术语
外部能量转换 激发态分子与溶剂或其它溶质碰撞，以热能的形 式释放能量的过程。
体系间跨越 处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的 多重性发生变化的过程，如S1* T1*
率即为1/ f。
F t F 0 e Kt F 荧光强度
K 衰减常数
F f F0 / e F0e K f
1 / e e K f
K1 1
K 1 f
F 0 / F t e Kt e t / f ln F 0 t
Ft f
12
荧光效率
发射荧光的光子数
f 吸收激发光的光子数
物质的荧光效率在0～1之间，0.1～1时有分析价值。
A. 长共轭结构使得分子的荧光波长向短波方向移动。 B. 分子的刚性越强，荧光强度越小。 C. 给电子取代基可导致荧光增强。 D. 吸电子取代基可导致荧光增强。
Cx
Fx Fs
F0 F0
C s
31
第三节 荧光分光光度计和分析新技术
滤光片荧光计 滤光片－单色器荧光计 荧光分光光度计
32
一、荧光分光光度计
1. 主要部件
源发光源（氙灯）、激发单色器、样品池、发射单色器、检测系统
荧光分光光度计结构示意图 1.光源
2、4、7、9. 狭缝 3.激发单色器
5.样品池 6.表面吸光物质 8.发射单色器 10.检测器 11.放大器 12.指示器 13.记录器
内部能量转换
当两电子激发态能量相差较小以致其振动能级有重 叠时，受激分子由高电子能级转移致低电子能级的 过程。
（振动失活在同样多重态间进行，如S2* S1*）
5
术语
外部能量转换 激发态分子与溶剂或其它溶质碰撞，以热能的形 式释放能量的过程。
体系间跨越 处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的 多重性发生变化的过程，如S1* T1*
率即为1/ f。
F t F 0 e Kt F 荧光强度
K 衰减常数
F f F0 / e F0e K f
1 / e e K f
K1 1
K 1 f
F 0 / F t e Kt e t / f ln F 0 t
Ft f
12
荧光效率
发射荧光的光子数
f 吸收激发光的光子数
物质的荧光效率在0～1之间，0.1～1时有分析价值。
第十一章荧光分析法
荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快，10-9~10-
6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光
马上熄灭
无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射去激
消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光，荧光波长 比激发光波长长。 荧>激
第十三页，编辑于星期一：三点 二十五分。
VR
S2
（三）金属螯合物的荧光
• 大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物
都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定
• 不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与Mn+形成螯
合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光
• 例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+— Al3+、Mg2+
形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强
ISC：系间窜跃
ISC VR
T1
S0
S0
吸光 吸光 荧光
磷光
图 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图
第十六页，编辑于星期一：三点 二十五分。
二、荧光、磷光与分子结构的关系
• 了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产生
荧光，在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么特征 以便更好地运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧 光的物质产生荧光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光 体变成强荧光体
最有用的荧光体
（二）荧光磷光与有机化合物结构的关系
• 物质只有吸收了紫外可见光，产生 *n *跃迁，
产生荧光
• *与n *跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103，
寿命短
• *跃迁常产生较强的荧光， n *跃迁产生的
荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光
分析化学第11章--荧光分析法
2.荧光光谱： 固定激发光波长 (λex)，改变荧光 波长(λem) ，测 定F,以 λem 为横 坐标，F为纵坐标 作图，得荧光光 谱.
F
a
b
300 图
400
500 nm
硫酸奎宁的激发光谱(a) 和荧光光谱(b)
两个光谱的作用： 1）可用来鉴别荧光物质； 2）进行荧光测定时选择适当测定 波长的依据。
λ磷光>λ荧光
(二)荧光的激发光谱和发射光谱 荧光物质的两个特征光谱 1.激发光谱(excitation spectrum): 表示不同激发波长的辐射引起的物质 发射某一波长荧光的相对效率。 固定荧光波长(λem) ，改变激发光波 长(λex) ，测定F荧光强度，以激发 光波长(λex)为横坐标，荧光强度为 纵坐标作图，得激发光谱。
2)电子能态的多重性： M=2S+1 S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0 M=2S+1=1 对应基线单重态； 对于激发态 s1=1/2,s2=1/2, S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍 低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： hv 基态分子 激发单重态(s1*,s2*) 激发三重态
第11章 荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
第十一章 荧光分析方法
5
在某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自 旋方向的改变，这时分子的两个电子的自旋方向 相同，自旋量子数都为1／2，总自旋量子数s等 于1，这时分子处于激发三重态(2s+1＝3)。 S0+hν→T1
6
激发单重态与激发三重态的区别：
激发单重态分子是抗磁性分子，激发三重 态分子是顺磁性分子；
激发单重态的平均寿命大约10-8s，激发三 重态的平均寿命大约10-4~1s； 电子由S0→S1，S2等的跃迁较容易，属于允 许跃迁。电子由S0→T1，T2等的跃迁较难发 生，属于禁阻跃迁。
23
（二）有机化合物分子结构与荧光的关系
能够发射荧光的物质同时具备两个条件：即有 强的紫外—可见吸收和一定的荧光效率。 1．长共扼结构 绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环、因为芳香环和杂环分子具有长共轭的π—π* 跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度(荧光效率) 越大，而荧光波长也长移。
24
31
5．散射光
当一束平行单色光照射在液体样
品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光
子与物质分子相碰撞，使光子的运功方向发生
改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
光子和物质分子发生弹性碰撞时，发生能量
的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，这种
散射光称为瑞利光。其波长与入射光波长相同。
32
光子和物质分子发生非弹性碰撞时．在光子 运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发 生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分 子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入 射光稍长或稍短的光，这种散射光称为拉曼光。 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入 射光波长更长的拉曼光。
12
② 磷光(phosphorescence)发射：经过体系间跨越 的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动 能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活 一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出 光辐射，这种光辐射称为磷光。 T1→S0+hνp 磷光发射时间较长，约10-4-10s。 激发光停止后，磷光可持续一段时间。 电子由S0→T1为禁阻跃迁，需由S1经过体系间跨越 转化为T1。 同一分子的S1→S0 比T1→S0 的能级差大，磷光 的波长比荧光波长长
在某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自 旋方向的改变，这时分子的两个电子的自旋方向 相同，自旋量子数都为1／2，总自旋量子数s等 于1，这时分子处于激发三重态(2s+1＝3)。 S0+hν→T1
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激发单重态与激发三重态的区别：
激发单重态分子是抗磁性分子，激发三重 态分子是顺磁性分子；
激发单重态的平均寿命大约10-8s，激发三 重态的平均寿命大约10-4~1s； 电子由S0→S1，S2等的跃迁较容易，属于允 许跃迁。电子由S0→T1，T2等的跃迁较难发 生，属于禁阻跃迁。
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（二）有机化合物分子结构与荧光的关系
能够发射荧光的物质同时具备两个条件：即有 强的紫外—可见吸收和一定的荧光效率。 1．长共扼结构 绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环、因为芳香环和杂环分子具有长共轭的π—π* 跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度(荧光效率) 越大，而荧光波长也长移。
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5．散射光
当一束平行单色光照射在液体样
品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光
子与物质分子相碰撞，使光子的运功方向发生
改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
光子和物质分子发生弹性碰撞时，发生能量
的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，这种
散射光称为瑞利光。其波长与入射光波长相同。
32
光子和物质分子发生非弹性碰撞时．在光子 运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发 生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分 子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入 射光稍长或稍短的光，这种散射光称为拉曼光。 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入 射光波长更长的拉曼光。
12
② 磷光(phosphorescence)发射：经过体系间跨越 的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动 能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活 一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出 光辐射，这种光辐射称为磷光。 T1→S0+hνp 磷光发射时间较长，约10-4-10s。 激发光停止后，磷光可持续一段时间。 电子由S0→T1为禁阻跃迁，需由S1经过体系间跨越 转化为T1。 同一分子的S1→S0 比T1→S0 的能级差大，磷光 的波长比荧光波长长
第十一章 荧光分析法复习过程
第十一章荧光分析法一、选择题1．荧光分析法是通过测定( )而达到对物质的定性或定量分析。
A、激发光B、磷光C、发射光D、散射光2．下面( )分析方法不属于分子发射光谱法。
A、紫外一可见分光光度法B、荧光分析法C、磷光分析法D、化学发光分析法3．荧光发射光谱含有( )个发射带。
A、1B、2C、3D、不一定4．下列关于荧光光谱的叙述错误的是（）A、荧光光谱的形状与激发光的波长无关B、荧光光谱与激发光谱一般是对称镜像C、荧光光谱属于分子的受激发射光谱D、荧光激发射光谱与紫外吸收光谱重合5．下列叙述错误的是（）A、荧光光谱的最长波长和激发光谱的最长波长相对应B、荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应C、荧光光谱的形状与激发光波长无关D、荧光波长大于激发光波长6．激发态分子经过振动弛豫回到第一电子激发态的最低振动能级后，经系间窜越转移至激发三重态，再经振动弛豫降至三重态的最低振动能级，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级，这种光辐射称为( )。
A、分子荧光B、分子磷光C、瑞利散射光D、拉曼散射光7．关于振动弛豫，下列叙述中错误的是( )。
A、振动弛豫只能在同一电子能级内进行B、振动弛豫属于无辐射跃迁C、通过振动弛豫可使处于不同电子激发态的分子均返回到第一电子激发态的最低振动能级D、振动弛豫是产生Stokes位移的原因之一8．荧光寿命指的是( )。
A、从激发光开始照射到发射荧光的时间B、受激分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态所需的时间C、从除去激发光光源至分子的荧光熄灭所需的时间D、除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1／e所需的时间9．关于荧光效率，下面叙述不正确的是（）A、具有长共轭的π→π﹡跃迁的物质具有较大的荧光效率B、分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大C、顺式异构体的荧光效率大于反式异构体D、共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影响不同10．采用下列( )措施可使物质的荧光效率提高。
第十一章荧光分析法.ppt
散射光干扰及消除
散射光：当一束平行光投射在液体试样上，大部分 被吸收或透过，小部分由于光子和物质分子相碰撞， 使光子的运动方向改变，而向不同方向散射形成的 光。
散射光包括瑞利散射光和拉曼光
瑞利散射光：无能量的交换，λ散射≈λ激发
拉曼光： 有能量转移， λ散射> <λ激发
干扰的消除
1）改变激发光的波长；
单色器1
样品池
单色器2
垂直方向
放大 与
记录
检测器
荧光仪特点
与分光光度计的主要差别
① 垂直测量方式, 消除透射光影响 ② 两个单色器，激发和发射，常用光栅
1 光源 A、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B、气体放电灯：氢、氙、汞，
常用氙灯（波长： 250-700nm） C、激光光源 2 单色器
闪耀光栅
3 检测器 光电倍增管
5.弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成 强荧光衍生物以提高测量灵敏度。
故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可 用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚 广。
思考题
• 1.荧光和磷光在产生机制上有什么不同？
• 2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？
• 3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（ ）。
6.（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。
7. 荧光光谱的特征？
1. 所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射 出比入射光( )。
A. 波长长的光线
B. 波长短的光线
C. 能量大的光线
D. 频率高的光线
2. 下列说法正确的是(
)
A 荧光发射波长永远大于激发波长
B 荧光发射波长永远小于激发波长
荧光分析法精品PPT课件
内部能量转换
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
（二）长共轭结构
λex 205nm 286nm
356nm
λem 278nm 321nm
404nm
φf
0.11
0.29
0.36
结论：π电子共轭程度越大，荧光强度（荧 光效率）越大，荧光波长长移
（三）分子的刚性和共平面性
联苯φf 0.2
C H2
芴φf 1.0
OH O
N
NM g 1 /2
（三）分子的刚性和共平面性
1. 一般情况下，随着温度的升高，溶液中荧光物 质的荧光效率和荧光强度将降低。 2. 原因: 温度升高时，分子运动速度加快，分子 间碰撞几率增加， 使无辐射跃迁增加， 从而降低 了荧光效率
3 酸度对荧光的影响
苯胺在下列哪种条件下荧光强度最强？
A pH＝1
B pH＝3
C pH＝13
D pH＝8
当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸 度对荧光强度有较大影响，主要是因为在不同 酸度中分子和离子间的平衡的改变。
硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱
荧光光谱的特征
1、荧光光谱的形状与激发波长无关 产生原因： 荧光发射是从特定的激发态返回基态 荧光光谱的强度与激发波长有关
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
（二）长共轭结构
λex 205nm 286nm
356nm
λem 278nm 321nm
404nm
φf
0.11
0.29
0.36
结论：π电子共轭程度越大，荧光强度（荧 光效率）越大，荧光波长长移
（三）分子的刚性和共平面性
联苯φf 0.2
C H2
芴φf 1.0
OH O
N
NM g 1 /2
（三）分子的刚性和共平面性
1. 一般情况下，随着温度的升高，溶液中荧光物 质的荧光效率和荧光强度将降低。 2. 原因: 温度升高时，分子运动速度加快，分子 间碰撞几率增加， 使无辐射跃迁增加， 从而降低 了荧光效率
3 酸度对荧光的影响
苯胺在下列哪种条件下荧光强度最强？
A pH＝1
B pH＝3
C pH＝13
D pH＝8
当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸 度对荧光强度有较大影响，主要是因为在不同 酸度中分子和离子间的平衡的改变。
硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱
荧光光谱的特征
1、荧光光谱的形状与激发波长无关 产生原因： 荧光发射是从特定的激发态返回基态 荧光光谱的强度与激发波长有关
分析化学第11章--荧光分析法
第11章 荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
[化学]荧光分析法
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3
第十一章 荧光分析法
第一节 荧光分析法的基本原理
第二节 第三节 荧光定量分析法 荧光分光光度计和其他荧光分析技术
4
第十一章 荧光分析法
第一节 荧光分析法的基本原理
第一节 荧光分析法的基本原理 一、分子荧光 （一） 荧光的产生 1. 分子的能级与跃迁
物质分子体系中存在着电子能级、振动能级和转动能级 室温时，多数分子处在电子基态最低振动能级（S0），当 受到一定辐射能的作用时，就会发生能级之间的跃迁。 基态(S0)→激发态(S1*、S2*、激发态振动能级)：吸收特 定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；（吸收） 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、 激发态寿命最短的途径占优势； （发射）
─(CH=CH)2─
φf =ห้องสมุดไป่ตู้.28 φf =0.68
21
─(CH=CH)3─
第十一章 荧光分析法 第一节 荧光分析法的基本原理
二、荧光与分子结构 （二）有机化合物分子结构与荧光的关系 1. 共轭效应 * → 跃
lex lem f
苯 205nm 278nm 0.11
萘 286nm 321nm 0.29
发射荧光的光子数 φf 吸收激发光的光字数
一般物质的f在0~1之间 荧光量子产率与物质吸收的能量以何种形式释 放有关，若能量都以无辐射跃迁形式释放，外转换 过程速度快，则不出现荧光发射。
20
第十一章 荧光分析法 第一节 荧光分析法的基本原理
二、荧光与分子结构 （二）有机化合物分子结构与荧光的关系 1. 共轭效应 * → 跃迁 芳香族化合物、五元杂环上取代苯基 共轭程度越大,荧光效率越大，波长长移
21第十一章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理二荧光与分子结构二荧光与分子结构二有机化合物分子结构与荧光的关系二有机化合物分子结构与荧光的关系跃迁芳香族化合物五元杂环上取代苯基共轭程度越大荧光效率越大波长长移chch028chch06822第十一章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理二荧光与分子结构二荧光与分子结构二有机化合物分子结构与荧光的关系二有机化合物分子结构与荧光的关系ex205nm286nm356nmem278nm321nm404nm011029036维生素aex327nmlem510nm23第十一章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理二有机化合物分子结构与荧光的关系二有机化合物分子结构与荧光的关系酚酞无荧光荧光黄1024第十一章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理二有机化合物分子结构与荧光的关系二有机化合物分子结构与荧光的关系8羟基喹啉弱荧光红色荧光34苯并芘强荧光物质25第十一章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理二有机化合物分子结构与荧光的关系二有机化合物分子结构与荧光的关系取代基的作用给电子基增强荧光
分子荧光分析法教学课件
应用领域与优势
应用领域
分子荧光分析法广泛应用于生物、医学、环境等领域，如生物体内的物质检测、医学诊断、环境污染物监测等。
优势
分子荧光分析法具有高灵敏度、高选择性、非破坏性等特点，能够实现快速、准确地检测物质，尤其适用于痕量 物质的检测。此外，荧光分析技术还可以与其他技术联用，如色谱分离技术、质谱技术等，进一步提高检测的准 确性和可靠性。
发展历程与现状
发展历程
分子荧光分析法自20世纪初诞生以来，经历了多个发展阶段 ，包括荧光物质的发现、荧光分析技术的建立、荧光探针的 应用等。
现状
目前，分子荧光分析法已经成为一种广泛应用于生物、医学 、环境等领域的高灵敏度、高选择性的分析方法。随着技断提高。
将荧光分析法应用于生物、医学、环境等领域， 拓展其应用范围。
创新技术
不断探索新的荧光分析技术，提高检测效率和准 确性。
加强交叉融合
与化学、物理、生物等领域进行交叉融合，推动 荧光分析法的创新发展。
THANKS 感谢观看
微型化
将荧光分析法应用于微流控芯 片和纳米材料中，实现微型化
、便携式检测。
荧光分析法面临的挑战与机遇
挑战
荧光分析法的干扰因素较多，如光散 射、背景荧光等，需要克服这些干扰 以提高检测准确性。
机遇
随着新材料、新技术的不断涌现，荧 光分析法将有更多的应用领域和潜在 市场。
荧光分析法的未来发展方向
拓展应用领域
分子荧光分析法教学课件
• 分子荧光分析法概述 • 荧光分析法的基本原理 • 荧光分析法的分类 • 荧光分析法的实验技术
• 荧光分析法的应用实例 • 荧光分析法的未来展望
01 分子荧光分析法概述
定义与原理
荧光分析法ppt课件
37
28
续前
给电子基团
3、pH影响 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
4、荧光熄灭的影响 荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或熄灭的现象。 引起荧光熄灭的物质为荧光熄灭剂 常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化 合物、重氮化合物、羰基化合物。
29
续前
返3回5
小结： 掌握
• 基本概念：荧光、振动弛豫、内部能量转换、外部能量转换、体系间跨越及磷光； 激发光谱与荧光光谱
• 基本理论：溶液荧光光谱的特征；物质发射荧光的条件；荧光定量分析的依据、 条件及方法
• 熟悉：影响荧光强度的因素（分子结构和外界条件）
了解
• 荧光分析仪器
36
练习：
P297，思考题 3、5，8
13
续前 影响体系间跨越几率增大的因素：
➢含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。 原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运 动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反 转的发生。
➢在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生几率。
返回14
续前 4、荧光（fluorescence）
30
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与散射光谱(b)
激发320nm
激发350nm
荧光448nm
荧光光谱
瑞利光320nm
散射光谱
拉曼光360nm
瑞利光350nm 拉曼光400nm
返3回1
11.3 荧光定量分析
1、荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射光干扰。
受激后，可在各个方向发射荧光， 在透过光的方向不易测定F。
5、散射光的干扰 散射光:当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，
28
续前
给电子基团
3、pH影响 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
4、荧光熄灭的影响 荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或熄灭的现象。 引起荧光熄灭的物质为荧光熄灭剂 常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化 合物、重氮化合物、羰基化合物。
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续前
返3回5
小结： 掌握
• 基本概念：荧光、振动弛豫、内部能量转换、外部能量转换、体系间跨越及磷光； 激发光谱与荧光光谱
• 基本理论：溶液荧光光谱的特征；物质发射荧光的条件；荧光定量分析的依据、 条件及方法
• 熟悉：影响荧光强度的因素（分子结构和外界条件）
了解
• 荧光分析仪器
36
练习：
P297，思考题 3、5，8
13
续前 影响体系间跨越几率增大的因素：
➢含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。 原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运 动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反 转的发生。
➢在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生几率。
返回14
续前 4、荧光（fluorescence）
30
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与散射光谱(b)
激发320nm
激发350nm
荧光448nm
荧光光谱
瑞利光320nm
散射光谱
拉曼光360nm
瑞利光350nm 拉曼光400nm
返3回1
11.3 荧光定量分析
1、荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射光干扰。
受激后，可在各个方向发射荧光， 在透过光的方向不易测定F。
5、散射光的干扰 散射光:当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，
第十一章 荧光分析法
４
（3）系间跨跃（isc） 单线态的较低振动能级（s1）与三重态 T1 的较高振动能 级有重叠，电子有可能发生自旋状态改变而发生系间跨跃。 如含有碘溴等分子系间跨越最常见。 （4）荧光发射： 通过内转换和振动驰豫，较高能级的电子均跃回到第一 电子激发态（S1）的最低振动能级（V0=0）上。处于激发单 重态的最低振动能级的分子，若以 10-9~10-7S 左右时间发射 光子回到基态的各振动能级，这一过程就有荧光发生，称为 荧光发射。 （5）磷光发射（P）： 分子经系间跨跃迁后，接着就发生快速振动驰豫而达到 三重激发态 T1 的最低振动能级（V=0）上，再跃迁到基态的 各振动能级就能发磷光。 （T：10-4~10S） （6）激发分子与溶剂分了或其它溶质分子间相互作用， 发生能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失，这一现象 称为“淬灭”。 二、激发光谱和发射光谱
波长相同，也可以不同，这一现象我们称为光致发光。最常
见 两 种 光 致 发 光 现 象 是 荧 光 （ Fluorometry ） 和 磷 光
（Phosphorscence）。
这两种过程的机理不同。
10-15s M+hr → M*
hr1→M hr→M
物质分子吸收光子能量而被激发，然后从第一激发态最
低振动能级返回到基态时各振动能级所发射出的光称为荧
１０
位阻使共平面下降则荧光减弱。例 P89 顺反异构体分子，顺式分子的两个荃团在同一侧，由于 位阻原因使分子不能共平面而没有荧光。 1-2 一二苯乙烯的反式结构有强烈荧光，而顺式异构体 （b）无荧光。
3.苯环取代基的类型： 芳香化合物的芳香环上，不同取代基对论化合物的荧光 强度和荧光光谱将有很大影响。规律如下： 给电子基团使荧光效率增强：如-OH,-NH2,-NHR,NR2,-OR 等； 吸电子基团：-COOH，-C=0，-NO2，-NO，-N=N-及卤素会 减弱甚至破坏荧光，且卤素随原子序数的增大，会使下 T1 体系的磷光增强，荧光减弱了解物质分子结构和荧光的关系， 可以帮助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质，或将 荧光强度不大或选择性不多的荧光物质转化为荧光强度大及 选择性高的荧光物质，以提高分析的效果。对 T1 电子共轭体 系作用小：-R，NH3+，-SO31-1
（3）系间跨跃（isc） 单线态的较低振动能级（s1）与三重态 T1 的较高振动能 级有重叠，电子有可能发生自旋状态改变而发生系间跨跃。 如含有碘溴等分子系间跨越最常见。 （4）荧光发射： 通过内转换和振动驰豫，较高能级的电子均跃回到第一 电子激发态（S1）的最低振动能级（V0=0）上。处于激发单 重态的最低振动能级的分子，若以 10-9~10-7S 左右时间发射 光子回到基态的各振动能级，这一过程就有荧光发生，称为 荧光发射。 （5）磷光发射（P）： 分子经系间跨跃迁后，接着就发生快速振动驰豫而达到 三重激发态 T1 的最低振动能级（V=0）上，再跃迁到基态的 各振动能级就能发磷光。 （T：10-4~10S） （6）激发分子与溶剂分了或其它溶质分子间相互作用， 发生能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失，这一现象 称为“淬灭”。 二、激发光谱和发射光谱
波长相同，也可以不同，这一现象我们称为光致发光。最常
见 两 种 光 致 发 光 现 象 是 荧 光 （ Fluorometry ） 和 磷 光
（Phosphorscence）。
这两种过程的机理不同。
10-15s M+hr → M*
hr1→M hr→M
物质分子吸收光子能量而被激发，然后从第一激发态最
低振动能级返回到基态时各振动能级所发射出的光称为荧
１０
位阻使共平面下降则荧光减弱。例 P89 顺反异构体分子，顺式分子的两个荃团在同一侧，由于 位阻原因使分子不能共平面而没有荧光。 1-2 一二苯乙烯的反式结构有强烈荧光，而顺式异构体 （b）无荧光。
3.苯环取代基的类型： 芳香化合物的芳香环上，不同取代基对论化合物的荧光 强度和荧光光谱将有很大影响。规律如下： 给电子基团使荧光效率增强：如-OH,-NH2,-NHR,NR2,-OR 等； 吸电子基团：-COOH，-C=0，-NO2，-NO，-N=N-及卤素会 减弱甚至破坏荧光，且卤素随原子序数的增大，会使下 T1 体系的磷光增强，荧光减弱了解物质分子结构和荧光的关系， 可以帮助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质，或将 荧光强度不大或选择性不多的荧光物质转化为荧光强度大及 选择性高的荧光物质，以提高分析的效果。对 T1 电子共轭体 系作用小：-R，NH3+，-SO31-1
分子荧光分析法简介课件
荧光光谱的测量
总结词
荧光光谱的测量是荧光分析中的重要环节，通过测量可以得到待测物的荧光发射光谱和 激发光谱。
详细描述
在测量荧光光谱时，需要使用光谱仪在特定的激发波长范围内扫描，记录待测物的荧光 发射光谱和激发光谱。同时，还需控制实验条件，如温度、溶剂等，以确保测量结果的
准确性和可靠性。
荧光量子产率的测定
荧光寿命的测定有助于了解荧光染料的发光 持续时间和能量衰减规律，有助于深入理解 荧光分析的原理和应用。
详细描述
荧光寿命的测定通常使用脉冲或时间相关偏 振光谱技术进行。通过测量染料在不同时间 点的荧光强度，可以计算出荧光寿命。该参 数对于优化实验条件、提高荧光分析的灵敏
度和特异性具有指导意义。
CHAPTER 05
CHAPTER 03
分子荧光分析法的分类
荧光分光光度法
总结词
一种常用的荧光分析方法，通过测量荧光光谱和荧光强度，对荧光物质进行定性和定量分析。
详细描述
荧光分光光度法基于荧光物质在不同波长光的激发下会发出不同波长的荧光原理，通过测量荧光光谱和荧光强度 ，可以确定荧光物质的成分和浓度。该方法具有高灵敏度、高选择性等优点，广泛应用于生物、医学、环境等领 域。
时间分辨荧光分析法
总结词
一种高灵敏度的荧光分析方法，通过测量荧光物质在不同时间点的荧光强度，对荧光物质进行定性和 定量分析。
详细描述
时间分辨荧光分析法利用荧光物质在不同时间点的荧光特性，通过测量不同时间点的荧光强度，可以 消除背景荧光的干扰，提高检测的灵敏度和准确性。该方法具有高灵敏度、高分辨率等优点，在生物 、医学、环境等领域有广泛应用。
分子荧光分析法的应用实例
在环境监测中的应用
相关主题
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11.3
定量分析方法
11.3.1 荧光强度与浓度的关系 荧光是物质吸收光子之后发出的光，荧光强度(F)与荧光物 质吸收光的程度以及发射荧光的能力有关。测试荧光的方向与激 发光入射方向垂直，吸收池是四面透光的。
I = I 0 ⋅ e − 2.303εcl (Beer定律 ) F = K ′I 0 1 − e
C6H5 － CH3 C6H5 － OH C6H5 － OCH3 C6H5 － NH2 C6H5 － CN
11.2.4. 影响荧光强度的外部因素
⑴温度 ⑵溶剂 降低会温度使荧光强度增大。 溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧光波长 红移；若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质 电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变； 含重原子的溶剂(碘乙烷、四溴化碳)使荧光减 弱。 酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH有 关。【苯胺在pH7～12(分子形式)发生蓝色荧光;
芴φf＝1.0
本来不发生荧光或发生较弱荧光的物质,与金属离子形成络 合物后,如果刚性和共平面性增强,就可能发生荧光或荧光增强。 例如 8－羟基喹啉是弱荧光物质，与Mg2+、Al3+形成络合 物后，荧光就增强。
SO3Na OH N N O Mg1/2 CH3 N CH3 NaO3S CH3 N CH3
第11章
分子荧光分析法
Molecular fluorometry • • • • 11.1 11.2 11.3 11.4 概述 荧光光谱的基本原理 定量分析方法 荧光分析仪器和荧光法的应用
第11章的基本内容和基本要求
[基本内容] 荧光法的基本原理：分子荧光的发生过程，分 子结构与荧光的关系，影响荧光强度的外部因素。 荧光定量分析方法。 荧光分光光度计及仪器的较正。 [基本要求] 掌握荧光法的基本原理。熟悉荧光定量分析方 法。了解荧光计的结构及仪器的校正。
OH N ON OH HO N=N SO3Na
8-羟基喹啉
石榴茜素R
2. 有机化合物的荧光分析 荧光法在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能发生荧光, 脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光【如：荧光胺, 邻苯二甲醛, 及下表中的两种】。 部分有机化合物 的荧光分析条件，请 参阅P192.表11－3 许多合成药物， 天然产物， 中药提取物， 农药， 食品等， 都可用荧光分析 法测定。 名称 9-蒽基重 氮甲烷
8-羟基喹啉
8-羟基喹啉镁
①1-二甲胺基萘 -7-磺酸盐
②1-二甲胺基萘 -8-磺酸盐
相反，如果原结构共平面性较好，但在分子中取代了较大基团 后，由于位阻的原因使分子共平面性下降，则荧光减弱。 例如：上图 ①φ f＝0.75； ②φ f＝0.03 对于顺反异构体，顺式分子的两个基团在同一侧，由于位阻原因 使分子不能共平面而没有荧光。 例如 1，2－二苯乙烯反式有强烈荧光，而顺式没有荧光。
N(CH3)2
结构式
CH2N2
应用 某些羧酸
丹磺酰氯
SO2Cl
伯胺 仲胺 酚 氨基酸
11.4.3 药物制剂的应用实例
利血平的含量测定
11.4.4 荧光分析新技术
1 2 3 4 5 6 激光荧光分析法 时间分辨荧光分析 同步荧光分析 胶束增敏荧光分析 磷光分析法 化学发光和生物发光分析
⑸散射光的干扰
散射光(scattering light)：瑞利光、拉曼光 当一束平行光照射到吸收池上，大部分光线透过溶液，小部 分光线由于光子与物质分子相互碰撞，使光线偏离了原来的方向 而向不同角度散射，这种光称为散射光。 瑞利光(Reyleigh scattering light) 光子与分子发生弹性碰撞时，仅改变光子运动方向，不发生 能量交换，这种散射光称为瑞利光。特点是波长与入射光相同。
光源
检测器
放大 记录器
荧光分光光度计方框图
10.4.2
荧光法的应用
荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量分析，但是能发生 荧光的化学体系不多，这是荧光法的应用特点。 1. 无机化合物的荧光分析 无机物通过与荧光试剂(如下图)作用生成荧光螯合物而进行 荧光分析，非过渡金属离子的荧光螯合物较多，荧光试剂具有两 个(或以上)与MZ+形成螯合物的电子给予体官能团的芳香结构。 参阅P291.表11－2无机离子的荧光测定法 能引起荧光熄灭(猝灭)化合物，可用荧光猝灭法测定。
11.2.2激发光谱和发射来自谱• 任何荧光化合物都具有两种特 征光谱： 激发光谱——吸收光谱 发射光谱——荧光光谱 • 它们有三个特点：
⑴ 斯托克斯位移
像对称；
荧光波长总是 大于激发光波长。
⑵ 荧光光谱和激发光谱大致成镜
⑶ 荧光发射光谱的形状与激发光
波长无关。 无 论 用 λ=250 或 350nm 哪 一个作激发光源，所得荧光光 谱形状和峰的位置都是相同的.
320
强 度
448 激发320nm 硫酸奎宁 350
448 激发350nm 硫酸奎宁
图11－6 硫酸奎宁在不同 波长激发下的荧 光光谱和散射光谱
(a) λ/nm 强 度 λ/nm
320 360
激发320nm 0.1mol/LH2SO4
350
激发350nm 0.1mol/LH2SO4 400
(b) λ/nm λ/nm
11.2.3. 分子结构与荧光的关系
1.荧光寿命和荧光效率 荧光寿命为除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大 荧光强度的一半所需的时间。荧光寿命为10－8∼10－10s。 荧光效率（φ在0∼1之间）： 发射荧光的光子数 ϕ= 吸收激发光的光子数 2.分子结构对荧光效率的影响 物质分子有强的紫外吸收和一定的荧光产率是发射荧光的两个 必备条件。分子结构中有紫外－可见吸收： π→π﹡跃迁(K带强吸收)或n→π﹡跃迁(R带弱吸收). ⑴长共轭结构 芳香环或杂环分子具有长共轭π→π﹡跃迁。 当共轭体系增长，λex和λem都将长移，荧光强度也会增大， 例如：苯、萘、蒽； 含长共轭双键的脂肪烃也可能有荧光，如维生素A等。
11.4 荧光分析仪器和荧光法的应用
11.4.1 荧光分光光度计
应用 既可用于定量分析，也可用于测绘激发光谱和荧光光谱 第一单色器(激发单色器)选择激发光波长(＞250nm的紫外光)。 第二单色器(荧光单色器)与激发光入射方向垂直， 选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。 第一 单色器 I0 样品 吸收池 F 第二 单色器 I
但是在pH<2和pH>13(离子形式)不能发生荧光】 化合物 相对荧光强度 C6H5OH C6H5O－ C6H5NH2 C6H5NH+3
⑶酸度
18
10
20
0
⑷荧光熄灭的影响
荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂或溶质分子的相互作用引 起荧光强度降低或荧光强度与浓度偏离线性关系的现象(荧光物 质浓度过大则有荧光自灭现象)。 例如 卤素离子、重金属离子、溶解氧分子、硝基化合物、 重氮化合物、羰基和羧基化合物，均为常见的熄灭剂。 应用 若加入某种荧光熄灭剂后，荧光强度的减小与熄灭剂 的浓度呈线性关系，则可以测定荧光熄灭剂的含量。
第三类取代基 对电子共轭体系作用较小，对荧光的影响不明
显。如 －R、－SO3H、－NH3＋等。
取代基的影响
化合物 C6H6（苯） C6H5－ COOH C6H5－NO2 C6H5 － Cl C6H5 － Br C6H5 － I 相对荧 光强度 10 3 0 7 5 0 化合物 相对荧 光强度 17 18 20 20 20
拉曼光(Raman scattering light) 光子与物质分子发生非弹性碰撞时，不仅改变光子运动方 向，而且发生能量交换，这种散射光称为拉曼光。特点： 当光子失去部分能量时，波长比入射光长(对荧光干扰最大)； 当光子多得到部分能量时，波长比入射光短。 干扰的消除 选择适当的激发光波长可消除拉曼光的干扰。
能 量 π* π* π*
π A基态
π B 激发 单重态
π C 激发 三重态
图11－1 单重态和 三重态的电子分布
2. 荧光的产生
(b) 振动驰豫 (c) 内部能量转换 (e)系间窜跃 S2 S1 T1
图11－2 荧光和磷光 产生示意图
S0基态 S1第一激发单重态 S2第二激发单重态 T1第一激发三重态
S0 (a)吸收 (d)荧光 (f)磷光 (g)外部能量转换(熄灭)
辐射跃迁 荧光发射 磷光发射 无辐射跃迁 振动弛豫 内 转 换 系间窜越 外 转 换
受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回 到基态所发出的辐射，荧光波长一般比激发光波长长 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的 辐射。 激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较 低振动能级的过程，其效率较高。 当两个电子能级非常接近以致其振动能级有重叠时， 电子由高能级回到低能级的过程。 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发 生变化的过程。 激发态分子与溶剂与其他溶质相互作用、能量转换而 使荧光(或磷光)减弱甚至消失的过程。荧光强度的减 弱或消失，荧光熄灭(或猝灭)。
F = K ′(I 0 − I )
(
− 2.303εcl
)
I0 F
I
当εcl 〈0.05时，I 0 一定，上式简化为 F = 2.3K ′I 0 εcl = Kc
荧光强度F与浓度c成线性关系，【K取决于荧光产率φ】 这是荧光分析法定量的依据。它比UV法灵敏度高。 11.3.2 定量分析方法 ①标准曲线法； ②比例法； ③多组分混合物的荧光分析。
续前
λex λem φf
苯 205nm 278nm 0.11
萘 286nm 321nm 0.29
蒽 356nm 404nm 0.36 维生素A λex＝327nm λem＝510nm
⑵分子的刚性和共平面性 有刚性结构的分子容易发荧 光，刚性和共平面性的增加 有利于荧光发射。 例如：联苯与芴