第四章动物细胞工程制药(1)_生物技术制药
第4章生物技术制药
细胞的生长不依赖支持物表面，可在培 养液中呈悬浮状态生长。
3、兼性贴壁细胞
兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性 贴壁细胞。如CHO细胞、小鼠L929细胞。 贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤 维细胞的形态，而当悬浮于培养基中生长 时则呈圆形。
二、动物细胞的生理特点
1、细胞的分裂周期
2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选 （1）DNA导入动物细胞方法
融合法
细胞融合法化学法物源自法病毒法重组逆转录病毒
DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法
脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法
原生质融合法 染色体介导法
显微注射法 重组DNA病毒
基因枪法 多瘤病毒样颗粒
2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
四、基因工程细胞的构建和筛选
1. 真核细胞基因表达载体的构建 2. 基因载体的导入和高效表达工 程细胞株的筛选
1、真核细胞基因表达载体的构建
（1）载体种类： 病毒载体： 牛痘病毒：广泛用于构建成多价疫苗， 腺病毒：基因治疗载体 逆转录病毒：基因治疗载体 杆状病毒：成功地用于1000多种外源基 因的高效表达。
② 其次是对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化 ③ 最后利用其扩增系统，不断增加其基因拷贝数， 从而获得高效表达而稳定的工程细胞株。
五、细胞库的建立
1. 除原代细胞外，其它的细胞株、细胞系都 需要建细胞库加以保存。 2. 按照我国和美国FDA的规定，用于生产的 工程细胞必须建立两个细胞库： ① 原始细胞库（master cell bank， MCB） ② 生产用细胞库（manufacture's working cell bank，MWCB）或称工作细胞库（working cell bank， WCB）。
生物技术制药教学大纲
第一章绪论（2学时）第一节生物技术概述1 生物技术的概念2 生物技术发展史第二节生物技术制药1 生物技术制药的概念2 生物技术在制药中的应用3 我国生物技术制药现状和发展前景4 医药生物技术发展展望第二章生物药物（10学时）1．生物药物的来源、特性、分类与制备。
（2学时）2．氨基酸类药物：氨基酸类药物研究概况；在医药中的应用；氨基酸生产。
（2学时）3．多肽、蛋白质类药物：多肽、蛋白质类药物的特点、分离纯化方法、工业生产制备过程。
（2学时）4．核酸类药物：概述（分类、应用）；生产方法；核酸类药物的制备。
（2学时）5．糖类药物：制备；纯化。
（2学时）第三章基因工程制药（8学时）通过本章学习，了解基因工程药物研制的意义，掌握基因工程药物的研制过程、研制方法。
1概述。
2基因工程药物生产的基本过程。
(2)3目的基因的获得：直接分离法；从基因文库中筛选；逆转录法；人工合成法。
4目的基因与运载体的体外重组：常用载体；目的基因与运载体的体外重组。
5重组分子导入受体细胞；导入方法；影响转化的因素；阳性重组体的筛选。
(2)6基因表达：大肠杆菌中的基因表达；真核基因在原核生物中的表达方式；真核基因在真核生物中的表达；真核基因在动物细胞中的表达。
(2)7基因工程下游技术；下游技术的要求；基因工程菌的稳定性；基因工程菌发酵。
8基因工程药物的分离、纯化：分离纯化的基本过程；分离纯化的技术。
9基因工程药物的质量控制:材料的质量控制;培养过程的质量控制;纯化工艺工程的质量控制。
(2)第四章动物细胞工程制药（8学时）1 概述：2 形态及生理特性。
（2）3 生产用的动物细胞：生产用动物细胞的要求；生产用动物细胞的获取。
4 基因工程细胞的构建和筛选；真核细胞基因表达载体的构建；基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选。
（2）5 动物细胞的培养条件和培养基6 动物细胞培养的基本方法（2）7 动物细胞大量培养的方法和操作方式8 动物细胞生物反应器及检测控制系统：搅拌式生物反应器；气升式生物反应器；流化床生物反应器。
动物细胞工程制药
动物细胞工程制药导语动物细胞工程制药是一种利用动物细胞进行生物制药的技术。
该技术已经取得了显著的进展，并在医药领域发挥着重要作用。
本文将介绍动物细胞工程制药的原理、应用和前景。
一、动物细胞工程制药的原理动物细胞工程制药是利用动物细胞系统表达和生产药物的一种技术。
其主要原理包括以下几个步骤：1.动物细胞培养：首先需要选择合适的动物细胞系，并进行培养。
常见的动物细胞系包括CHO细胞、HEK293细胞等。
细胞培养的条件包括培养基、培养温度、培养时间等。
2.基因克隆和转染：将药物的基因通过基因克隆技术导入到动物细胞中，使其具有产生目标药物的能力。
转染的方式包括质粒转染、病毒转染等。
3.细胞培养和增殖：转染后的细胞需要在培养条件下进行生长和增殖。
通常会添加适当的生长因子和培养基来促进细胞的生长。
4.产物分离和提纯：最后，通过适当的方法分离和提纯目标药物，可以使用离心、超滤、层析等技术进行分离纯化。
二、动物细胞工程制药的应用动物细胞工程制药已经广泛应用于医药领域，为药物的研发和生产提供了重要的技术支持。
其主要应用包括以下几个方面：1.蛋白质药物生产：利用动物细胞工程制药技术可以生产多种重要的蛋白质药物，如抗体、细胞因子等。
这些蛋白质药物在治疗癌症、免疫性疾病等方面具有重要作用。
2.疫苗生产：动物细胞工程制药技术也可以用于疫苗的生产。
通过导入相应的病原体基因到动物细胞中，使其产生病原体相关的抗原，从而制备疫苗。
3.基因治疗：动物细胞工程制药技术还可以用于基因治疗。
通过将目标基因导入到患者的细胞中，实现对基因相关疾病的治疗。
4.抗病毒药物：某些动物细胞工程技术还可以用于抗病毒药物的生产。
通过将抗病毒基因导入到动物细胞中，使其产生抗病毒蛋白，从而对抗病毒感染。
三、动物细胞工程制药的前景随着基因工程和生物技术的不断发展，动物细胞工程制药在未来的前景十分广阔。
以下是动物细胞工程制药的一些未来发展趋势：1.技术的进一步成熟：随着技术的不断发展，动物细胞工程制药技术将变得更加成熟，能够更准确、高效地生产药物。
生物技术制药教案
第一章绪论一、概述1、生物药物泛指包括生物制品在内的生物体的初级和次极代谢产物或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗疾病的医药品。
生物制品是指用细菌疫苗制成的供预防、治疗和诊断特定传染病的药品。
2、生物技术制药采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。
3、生物技术药物采用DNA重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质、治疗性抗体或核酸类药物。
4、生物技术以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种（品系）进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。
5、生物技术的内容基因、细胞、酶、发酵、生化、蛋白质、抗体、糖链工程和海洋生物技术。
6、生物技术的相关学科生物学（微生物学、分子生物学、遗传学）化学（生物化学、无机、有机、分析、物理化学）工程学（化学工程、电子工程）医学、药学、农学。
7、生物技术的应用（1）、医药1977年出现第一个重组的生长激素抑制因子后，美国成立了第一家遗传工程公司—Genetech，进行小牛和小猪的生长激素的开发研究，与其他公司合作开发了干扰素，从此以后出现许多生物技术公司，1981年第一个诊断用单克隆抗体首先在美国上市。
利用基因治疗人类疾病的技术取得了突破性进展，原来用于治疗单基因缺陷的遗传病的治疗技术，现在已快速扩展到癌症、爱滋病、乙型肝炎、心血管病，此外，诊断试剂、酶试剂、动植物医药产品、核酸类药物也取得了很大进展。
（2）、农业转基因动植物的新品种，大幅度提高产量和质量。
（3）、食品氨基酸（天冬氨酸、半胱氨酸），有机酸（苹果酸、酒石酸），做食品添加剂，香料，葡萄糖，果糖，淀粉酶。
（4）、工业农药、香料、饲料、工业酶、有机酶、皮革工业脱毛软化、丝绸脱胶、加酶洗衣粉。
（5）、环境净化利用微生物或酶处理废物和废水。
《动物细胞工程》 讲义
《动物细胞工程》讲义一、动物细胞工程的概念动物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，在细胞水平上进行的操作，以获得人们所需要的生物产品或细胞本身。
它是现代生物技术的重要组成部分，涵盖了细胞培养、细胞融合、细胞核移植、胚胎移植等多个方面。
二、动物细胞培养（一）基本原理细胞培养的基本原理是细胞的增殖。
细胞在适宜的环境中，能够吸收营养物质，进行新陈代谢，并通过分裂增加数量。
（二）培养条件1、无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还会添加一定量的抗生素，以防止培养过程中的污染。
2、营养物质：包括糖、氨基酸、无机盐、维生素等，这些物质要按照细胞所需的种类和量进行精确配置。
3、适宜的温度和 pH：哺乳动物细胞的培养温度一般在 365℃左右，pH 则在 72 74 之间。
4、气体环境：细胞培养所需的气体主要有氧气和二氧化碳，氧气用于细胞呼吸，二氧化碳则用于维持培养液的 pH。
（三）培养过程1、取材：通常从动物的组织或器官中获取细胞，如从胚胎或幼龄动物的器官组织中获取细胞，其分裂能力更强。
2、原代培养：将取得的组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，使其分散成单个细胞，然后制成细胞悬液，放入培养瓶中培养。
3、传代培养：当细胞贴满瓶壁时，需要用胰蛋白酶处理，使细胞从瓶壁上脱落下来，然后分瓶继续培养。
三、动物细胞融合（一）概念动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。
（二）诱导融合的方法1、物理法：如电激融合法。
2、化学法：常用的诱导剂是聚乙二醇（PEG）。
3、生物法：如灭活的病毒。
（三）应用1、制备单克隆抗体：这是动物细胞融合技术最突出的应用。
2、用于基因定位和染色体转移等研究。
四、单克隆抗体（一）概念单克隆抗体是由单个 B 淋巴细胞经过无性繁殖形成的细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。
（二）制备过程1、给小鼠注射特定的抗原，使其发生免疫反应，产生能分泌特定抗体的 B 淋巴细胞。
生物技术制药概论
生物技术制药概论教学大纲（药学专业）四川大学华西药学院生物技术药物学系2015年9月一、课程基本信息课程名称：生物技术制药Biotechnological Pharmaceutics课程号（代码）：505013020L课程类别：限选学时：32 学分：2二、教学目的及要求现代生物技术是一门以现代生命科学为基础，由多学科综合而形成的崭新学科，而生物技术制药则是以现代生物技术为主要手段来研究制造药物。
通过本课程的教学，可以使学生掌握现代生物制药的基本知识、基本理论和基本技能，了解21实际生物制药工业的发展及药物生物技术的新进展，为学生应用现代生物技术研究新药和从事生物药物的研究开发及生产奠定基础。
三、教学内容第一章绪论（3学时）1.生物技术的定义和组成2.生物技术制药的概念和研究范围3.生物技术制药在药学中的重要性。
4.生物药物的概念与生物医药产业第二章基因工程制药（4学时）1.基因工程的概念与原理2.基因工程药物的概念及基本过程3.基因工程制药的关键技术第三章蛋白质工程制药（2学时）1.蛋白质工程的定义与研究内容2.蛋白质工程基本特征3.蛋白质工程实施的主要条件4.蛋白质工程药物第四章动物细胞工程制药（4学时）1.动细胞的培养和融合的基本原理及方法2.干细胞技术3.动物细胞的大规模培养第五章植物细胞工程制药（4学时）1.植物细胞工程的产生和发展2.植物细胞工程原理3.植物细胞大规模培养技术4.转基因动植物技术与植物细胞工程制药第六章发酵工程技术（4学时）1发酵工程的基本原理2发酵工程的基本过程与工艺控制的关键因素2发酵工程技术的应用第七章酶工程技术（4学时）1.酶工程概述与发展2.固定化酶、固定化细胞生物反应器的制备3.生物反应工程的设计及生物反应器4.酶工程技术在制药工业的应用第八章抗体工程与抗体药物（3学时）1. 抗体工程与抗体药物2. 单克隆抗体技术第九章合成生物学（2学时）1.合成生物学的概念与发展2合成生物学技术与在医药领域应用第十章生物技术药物的质量控制与安全性评价（2学时）1. 生物技术药物的质量控制2. 生物技术药物的安全性评价复习、考试（3学时）四、教材姚文兵主编.生物技术制药概论. 第3版中国医药科技出版社，2015五、主要参考资料1.夏焕章熊宗贵主编《生物技术制药》（第2版）高等教育出版社20062..王凤山主编《生物技术药物》人民卫生出版社20103..Nature Reviews: Drug discovery4.4Nature biotechnology六、成绩评定理论考核70% 平时考察30%。
生物制药工程：第四章-动物细胞工程制药
③ 保证有适量的氧气供应； ④ 需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物； ⑤ 有良好的适于生存的外界环境； ⑥ 及时分种，保持合适的细胞密度；
一、动物细胞的培养条件
1. 器材的清洗和消毒
Sterilization, disinfection: • Spraying Alcohol • UV light • Autoclave • Irradiation • Dry heating • Bleaching?
该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用 BME （Eagle’s basal medium）加小牛血清，pH控 制 在7.2。细胞的倍增时间为24h，有限寿命为50 代， 上世纪60年代被广泛用于制备疫苗。
（2）BHK-21：
1961年从5只生长1天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。 现在广泛采用的是1963年用单细胞分离的方法经 13次的克隆的细胞。
2.基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
DNA导入动物细胞的常用方法
融合法
化学法
物理法
病毒法
细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法
脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法 显微注射法
原生质融合法 染色体介导法
基因枪法
微细胞介导法
鬼影红细胞介导法
细胞融合法: cell fusion 脂质体介导法: liposome mediated gene transfer 原生质融合法: protoplast fusion 微细胞介导法: microcell mediated method 鬼影红细胞介导法: ghost mediated method
成纤维细胞,通常用的培养基 为DMEM培养基，添加7%胎 牛血清。过去多用于增殖病毒， 包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和 狂犬病疫苗，现在已被用于构 建工程细胞。
项目四 章动物细胞制药
传代培养：将培养细胞从培养器中取出，把 一部分移至新的培养器中再进行培养。 原代培养形成的单层细胞汇合以后，需 要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不 足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将 影响细胞的生长 。 1、有限细胞系 2、连续细胞系
四、动物细胞培养的营养条件 特点： 1、细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养 时需要抗生素； 2、动物细胞较微生物大得多，无细胞壁， 机械强度低，适应环境能力差； 3、培养过程需氧量少，且不耐受强力通风 与搅拌；
第一节 ห้องสมุดไป่ตู้胞培养技术
细胞培养条件： 1、营养 2、生长环境
（一）动物细胞培养技术
动物细胞体外培养具有明显的表达产物 方面的优点，为传统的微生物发酵技术所 无法替代。其中以它们转录后修饰和产物 胞外分泌表达最为人们所感兴趣。
二、动物细胞培养特征
贴壁依赖性细胞 非贴壁依赖性细胞 兼性贴壁依赖性细胞
4、在机体中，细胞相互粘连以集群形式存 在，培养过程具有群体效应、锚地依赖性、 接触抑制性及功能全能性； 5、培养过程产物分布于细胞内外，反应过 程成本较高，但产品价格昂贵 6、大规模培养时，不可套用微生物反应的 经验： 7、原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。
培养基组成 1、天然培养基 血清 水解乳蛋白 胚胎浸液等 2、合成培养基 氨基酸 维生素 糖 无机盐等 加10%-20%血清 血清的优点？ 缺点？ 无血清培养基
单抗人源化 主要困难 （1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细 胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细 胞不稳定，易丧失抗体分泌能力； （2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说， 高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行 的； （3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交 瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的， 但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。
生物技术制药_03-动物细胞工程制药-9.25
动物细胞工程制药
动物细胞培养技术
动物细胞培养基和添加剂 —— 血清
血清的成分：没有完全明确
蛋白质：白蛋白、球蛋白、转运铁蛋白等
激素：主要是细胞因子类，如生长因子等
代谢物、营养物、无机盐 抑制物
血清营养丰富，极易染菌、染毒 血清批次之间性质有差别，质量不稳定 成本高昂，且对产物分离有一定影响
操作过程（贴壁细胞）： 1.弃使用过的细胞培养基
（二）细胞的传代(subculture)：从原培养容器中分离细胞
2.清洗：使用PBS平衡盐溶液清洗细胞。
3.消化：加入消化液(trypsin)到长着细胞的一面。 孵育 在5-15分钟，仔细监测细胞分离过程，避免细胞受损伤。
4.吹打：当细胞变圆、离开培养皿底部时， 加入培养基， 通过移液管在细胞表面反复吹打分散细胞。计数并再次 培养细胞。
保持一定的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密 度不再增加。 一旦细胞转化为异倍体后，该现象消失，细胞可多层 生长，细胞密度可大大增加。
动物细胞工程制药
接触抑制
动物细胞工程制药
动物细胞培养所需仪器设备
动物细胞培养器具
动物细胞工程制药
动物细胞培养所需仪器设备
实验室要求
（A）和缓冲间相连，缓冲间内备消毒服装和鞋，口罩等， 入内换上。 （B）室内空气不流通，有适当的光线，清洁，干燥。 （C）侧部可设传递窗，用于物品传递。 （D）有消毒用紫外线灯
动物细胞工程制药
细胞系的选择
几个概念
细胞系（cell line）
由原代培养经传代培养纯化，获得的能在体外生存的细胞群体
生物技术制药 教学大纲
生物技术制药教学大纲温州医学院生物技术药物教研室二零一二年九月理论课教学大纲《生物技术制药》教学大纲一、课程基本信息课程名称：生物技术制药Biotechnological Pharmaceutics课程号（代码）：04000006课程类别：必修学时：32 学分：2.0二、前言生物技术制药课程是建立在微生物学、生物化学、遗传学、分子免疫学、分子生物学、生物技术原理等课程基础上的一门专业应用性课程。
通过本课程的教学，将使学生全面系统掌握生物技术药物制备和生产的一般规律、基本方法、制造工艺及其控制原理，使学生掌握现代生物制药的基本知识、基本理论和基本技能，了解21世纪生物制药工业的发展及药物生物技术的新进展，为学生应用现代生物技术研究新药和从事生物药物的研究开发及生产奠定基础。
三、课程的内容和要求第一章绪论[基本内容]生物技术发展简史，生物技术与医药工业的关系，生物技术药物的分类和特性，生物技术在制药工业中的应用。
[基本要求]掌握生物技术药物的分类和特性，熟悉生物技术的涵义和任务，明确生物技术在医药工业中的地位与重要性。
第二章基因工程制药[基本内容]基因工程技术在药品生产中的应用。
基因工程制药的基本过程。
目的基因获得的方法，基因表达体系，不同表达体系的特点及高效表达的措施。
基因工程菌生长代谢的特点。
基因工程菌的稳定性，不稳定的表现及提高稳定性的方法。
基因工程菌培养培养方式和设备，高密度发酵的影响因素及控制方法。
基因工程药物的分离纯化的基本过程，分离纯化技术。
基因工程药物的质量控制及产品质量分析，产品保存方法。
基因工程药物干扰素、集落刺激因子和白介素-2的生产。
[基本要求]掌握基因工程菌构建的过程，基因工程菌发酵影响因素及控制方法，基因工程药物分离纯化方法和质量分析方法。
熟悉不同表达体系的特点和基因工程菌生长代谢的特点。
了解基因工程制药的基本过程。
第三章动物细胞工程制药[基本内容]动物细胞的形态、细胞的结构和功能、细胞的化学组成和代谢、细胞的分裂和周期生产用动物细胞的要求和获得，常用细胞的特性。
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产能代谢：三羧酸循环
葡萄糖产能对比
供氧不足：糖酵解途径 2 ATP; 供氧充分：三羧酸循环 36～38 ATP； 动物细胞大规模培养：供氧成为生物反应器设 计的最重要的因素之一！
动物细胞的生理特点
1. 2. 3. 4. 5. 6.
细胞的分裂周期长： ～ 细胞的分裂周期长：12～18h 分裂周期长 细胞生长需贴附于基质 并有接触抑制现象； 贴附于基质， 接触抑制现象 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象； 正常二倍体细胞的生长寿命有限 寿命有限； 正常二倍体细胞的生长寿命有限； 动物细胞对周围环境敏感 环境敏感； 动物细胞对周围环境敏感； 动物细胞对培养基的要求高； 培养基的要求高 动物细胞对培养基的要求高； 动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰 蛋白质的合成途径和修饰功能与 动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与 细菌不同。 细菌不同。
4. 融合细胞系： 融合细胞系：
两个或两个以上细胞融合而成。——受精。 动物－动物细胞，动物－植物细胞； 诱导物： （1）仙台病毒： 副流感病毒I型。方法：4ºC 聚集， 37 ºC反应，细胞穿通，细胞融合。以经很少使 用。 （2）聚乙二醇PEG: 分子量1000， 浓度50％， Ph8.0~8.2,融合率近100％。单抗生产中使用。 （3）电融合：电场0.5～1.5V，脉冲1～50µs。
主要作用
提供基本营养物质 提供激素和各种生长因子 提供结合蛋白 对培养中的细胞起到某些保护作用
二、天然培养基
血清的质量标准
血清质量高低取决于两方面因素：一是取材对象，二是取材过程。
理化性质
渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。 蛋白含量包括血清总蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（应 小于20g/L)、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指 标，血清中球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低血清质量越高。血红 蛋白也是越低越好。
动物细胞对培养基的要求高
原核细胞：碳源：葡萄糖，麦芽糖，淀粉， 氮源：蛋白胨，玉米浆，酵母粉；无机盐： PO4,, Na, K+, Fe++, 动物细胞：营养要求高！12种必需氨基酸， 8种以上维生素，多种无机盐，微量元素， 碳源：葡萄糖，多种细胞因子，贴壁因子， 血清。
动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌 不同
一、细胞概述
历史与现状 细胞在生物制药中的意义
大肠杆菌细胞
硅藻
百合花花瓣
植物细胞模式图
动物细胞扫描电镜图 动 物 细 胞 模 式 图
原核细胞与真核细胞区别
原核细胞 细胞大小 细胞核 较小 真核细胞 较大
无成形的细胞核，核物质集中在 有成形的真正的细胞核。 核区。无核膜，无核仁。DNA 有核膜，有核仁。DNA 不与蛋白质结合。 与蛋白质形成染色体。 除核糖体外，无其它的细胞器。 有各种细胞器。 有。主要是肽聚糖。 放线菌、细菌、蓝藻、衣原体 植物细胞、真菌有，动 物细胞无。 真菌、植物、动物
二、天然培养基
天然培养基 血清的种类 血清的主要成分和作用 血清的质量标准 血清的外观 血清的使用与储存 使用血清的优缺点
二、天然培养基
天然培养基
天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如 血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。 但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培 养基所替代。 目前广泛使用的培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁 的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。
二、天然培养基
血清的质量标准
微生物检测
包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测 支原体是一种很小的微生物，可通过孔径 22µm 的滤膜。支原体、 µ 病毒污染在光学显微镜下难于察觉，细胞也能生长繁殖，但会影响 实验结果。 检测支原体的方法很多，如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观 察法等。
血清、塑料瓶/玻璃瓶，生长密度80％左右为佳。 及时传代！
正常二倍体细胞的寿命有限
原代培养：离体培养开始的时间称“原代培 养”；经若干代之后细胞趋于死亡。成纤维 细胞～50代，加入表皮生长因子～150代。 转化成异常体后～无限细胞系，成为“永生 化”细胞。
动物细胞对周围环境十分敏感
细胞膜对理化因素：渗透压，pH, 离子浓度， 剪切力，微量元素等敏感。一切导致脂质和 蛋白质变性的因素都影响动物细胞的存活
二、天然培养基
血清的质量标准
促生长效果
克隆形成率 贴瓶率测定 续传代培养
这是血清重要的特性之一，应以培养的细胞来检测
悬浮生长的细胞，有限稀释法，统计克隆生长百分比 贴壁细胞，集落数占接种细胞数的百分比 细胞培养七天收集细胞，计数，取平均值。连续测试 三个周期以上，观察细胞生长状况。
二、天然培养基
3. 转SV40，甲基 胆蒽） SV40，即猿猴空泡病毒40（Simian vacuolating virus 40），是一种多瘤病毒，也 是一种DNA病毒，有造成肿瘤发生的潜在能力。 代表细胞株：Namalwa, CHO, BHK-21, Vero
二、天然培养基
血清的种类
小牛血清 新牛血清 胎牛血清 取自出生 10～30 天的小牛 取自出生 24 小时之内的新生牛 取自剖腹产的胎牛，血清中所含的抗体、 补体等对细胞有害的成分最少
二、天然培养基
血清的主要成分和作用
主要成分
血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的，血清中含有各种血浆蛋白、 多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等
5. 基因工程技术构建重组工程细胞
（1）真核细胞基因表达载体的构建
I、病毒载体：牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒、杆状病 毒 II、非病毒载体：质粒
（2) 基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
融合法：脂质体 化学法：磷酸钙沉淀 物理法：电转、基因枪 病毒法：DNA病毒、RNA病毒、多瘤病毒
五、细胞库的建立
2. 促生长因子及激素
各种激素、生长因子的功能
维持细胞的功能 保持细胞的状态（分化或未分化） 有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利 用葡萄糖和氨基酸。 有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松可促进表皮细 胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。
一、培养基的基本要求
3. 渗透压
细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性 人血浆渗透压 290 mOsm/kg，可视为培养人体细胞的理想渗透压 鼠细胞渗透压在 320 mOsm/kg 左右。 大多数哺乳动物细胞，渗透压在 260～320 mOsm/kg 的范围都适宜
一、培养基的基本要求
4. pH
大多数细胞适宜 pH为7.2～7.4 培养基应具一定的缓冲能力 造成 pH 波动主要是代谢产生的 CO2，在封闭式培养过程中 CO2 与 水结合产生碳酸，培养基 pH 很快下降。 为解决这一问题，合成培养基中使用了NaHCO3-CO2 缓冲系统，通 过稳定调节温箱中 CO2 浓度（5％），使之与培养基中的 NaHCO3 处于平衡状态
二、生产用动物细胞的获得
1. 2. 3. 4. 5.
原代细胞 二倍体细胞 转化细胞系 融合细胞系 重组工程细胞系
原代细胞
最无争议的细胞，但费时，费力，成本高，如： 鸡胚细胞，原代兔肾或鼠肾细胞，淋巴细胞等；
2. 二倍体细胞 二倍体细胞：
原代细胞的驯化产物，仍具正常细胞的特点： 2n核型，贴壁依赖，接触抑制，有限增殖（50 代以内），无致瘤性。代表性细胞株：WI－ 38， MRC-5，2BS；
原始细胞库：master cell bank, MCB 生产细胞库: manufacturer’s working bank, MFWB; Working cell bank (WCB)
第四节 动物细胞的培养条件和培养基
一、培养基的基本要求
营养成分 促生长因子 激素 渗透压 pH 无毒、无污染
一、培养基的基本要求
使用前处理
灭活处理，即56℃ 30分钟。灭活的目的使去除血清中的补体成分。
储存条件
血清一般储存在 -20℃，同时应避免反复冻融。购买大包装的血清后 首先要灭活处理，然后分装成小包装，储存于-20℃ ，使用前融化。 融化时最好现置于 4℃ 。融化后的血清在 4℃不宜长时间存放，应尽 快使用。
各类细胞周期时间表
细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象： 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象： 在玻璃、塑料等基质上生长，与电荷、 在玻璃、塑料等基质上生长，与电荷、钙镁 离子、贴附因子（ 离子、贴附因子（collagen， Fibronectin） ， ） 有关。 有关。 无血清培养基： 无血清培养基：少！
细胞质 细胞壁 代表生物
第二节 动物细胞的形态与生理特性
1. 贴壁细胞的生长特征
成纤维细胞
人胃腺癌细胞
2. 悬浮细胞的生长特征
白细胞细胞：K562
腹水瘤细胞：Ehrlich腹水瘤细胞EAC
3. 兼性贴壁细胞
CHO-K1
CHO－K1
动物细胞的化学组成与代谢
大分子： 蛋白质 核酸 糖 脂质
大分子代谢的三个阶段
一、培养基的基本要求
1. 营养成分
维生素：
主要是辅酶、辅基，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、 吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12 都是培养基常有的成分。
无机离子与微量元素
细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮、磷等基本元素，还需要微 量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。
一、培养基的基本要求
1. 营养成分
氨基酸
氨基酸是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必须氨基酸： 缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱。 此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是 核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所 需要的基本物质。