第四章动物细胞工程制药(1)_生物技术制药

主要作用
提供基本营养物质 提供激素和各种生长因子 提供结合蛋白 对培养中的细胞起到某些保护作用
二、天然培养基
血清的质量标准
血清质量高低取决于两方面因素：一是取材对象，二是取材过程。
理化性质
渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。 蛋白含量包括血清总蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（应 小于20g/L)、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指 标，血清中球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低血清质量越高。血红 蛋白也是越低越好。
2. 促生长因子及激素
各种激素、生长因子的功能
维持细胞的功能 保持细胞的状态（分化或未分化） 有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利 用葡萄糖和氨基酸。 有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松可促进表皮细 胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。
一、培养基的基本要求
3. 渗透压
细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性 人血浆渗透压 290 mOsm/kg，可视为培养人体细胞的理想渗透压 鼠细胞渗透压在 320 mOsm/kg 左右。 大多数哺乳动物细胞，渗透压在 260～320 mOsm/kg 的范围都适宜
一、培养基的基本要求
4. pH
大多数细胞适宜 pH为7.2～7.4 培养基应具一定的缓冲能力 造成 pH 波动主要是代谢产生的 CO2，在封闭式培养过程中 CO2 与 水结合产生碳酸，培养基 pH 很快下降。 为解决这一问题，合成培养基中使用了NaHCO3-CO2 缓冲系统，通 过稳定调节温箱中 CO2 浓度（5％），使之与培养基中的 NaHCO3 处于平衡状态
一、培养基的基本要求
1. 营养成分
维生素：
主要是辅酶、辅基，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、 吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12 都是培养基常有的成分。
无机离子与微量元素
细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮、磷等基本元素，还需要微 量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。
一、培养基的基本要求
动物细胞工程制药
主要内容
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
细胞概述……了解 了解 细胞概述 动物细胞的形态和生理特性 ……熟悉 熟悉 生产用动物细胞的要求和获得 ……掌握 掌握 动物细胞的培养条件和培养基 ……掌握 掌握 动物细胞培养的基本方法 动物细胞大量培养的方法和操作方式 动物细胞生物反应器 动物细胞产品的纯化方法和质量要求 动物细胞产品的制造实例 动物细胞制药的前景与展望
动物细胞来源的生物药物比重越来越大！ 动物细胞来源的生物药物比重越来越大！
第三节 生产用动物细胞的要求和获得
一、生产用动物细胞的要求： 正常组织的原代细胞：鸡胚、兔肾细胞等 多次传代的二倍体细胞：WI-38, 2BS，Namalwa细胞： 干扰素 Vero细胞：狂犬病疫苗、脊髓灰质炎症疫苗 杂交瘤细胞：OKT-3 mAb 逐步取消了非二倍体细胞的限制 DNA残留量的检测！
动物细胞对培养基的要求高
原核细胞：碳源：葡萄糖，麦芽糖，淀粉， 氮源：蛋白胨，玉米浆，酵母粉；无机盐： PO4,, Na, K+, Fe++, 动物细胞：营养要求高！12种必需氨基酸， 8种以上维生素，多种无机盐，微量元素， 碳源：葡萄糖，多种细胞因子，贴壁因子， 血清。
动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌 不同
3. 转化细胞系 转化细胞系：
正常细胞的自发转化，人为转化（SV40，甲基 胆蒽） SV40，即猿猴空泡病毒40（Simian vacuolating virus 40），是一种多瘤病毒，也 是一种DNA病毒，有造成肿瘤发生的潜在能力。 代表细胞株：Namalwa, CHO, BHK-21, Vero
二、天然培养基
血清的种类
小牛血清 新牛血清 胎牛血清 取自出生 10～30 天的小牛 取自出生 24 小时之内的新生牛 取自剖腹产的胎牛，血清中所含的抗体、 补体等对细胞有害的成分最少
二、天然培养基
血清的主要成分和作用
主要成分
血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的，血清中含有各种血浆蛋白、 多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等
二、天然培养基
血清的质量标准
微生物检测
包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测 支原体是一种很小的微生物，可通过孔径 22µm 的滤膜。支原体、 µ 病毒污染在光学显微镜下难于察觉，细胞也能生长繁殖，但会影响 实验结果。 检测支原体的方法很多，如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观 察法等。
使用前处理
灭活处理，即56℃ 30分钟。灭活的目的使去除血清中的补体成分。
储存条件
血清一般储存在 -20℃，同时应避免反复冻融。购买大包装的血清后 首先要灭活处理，然后分装成小包装，储存于-20℃ ，使用前融化。 融化时最好现置于 4℃ 。融化后的血清在 4℃不宜长时间存放，应尽 快使用。
4. 融合细胞系： 融合细胞系：
两个或两个以上细胞融合而成。——受精。 动物－动物细胞，动物－植物细胞； 诱导物： （1）仙台病毒： 副流感病毒I型。方法：4ºC 聚集， 37 ºC反应，细胞穿通，细胞融合。以经很少使 用。 （2）聚乙二醇PEG: 分子量1000， 浓度50％， Ph8.0~8.2,融合率近100％。单抗生产中使用。 （3）电融合：电场0.5～1.5V，脉冲1～50µs。
既在游离核糖体（细胞质基质蛋白）上合成， 更多的在粗面内质网（分泌蛋白，整合蛋白， N-linked glycoprotein）上进行。多数为糖蛋 白。,高尔基体（O-linked glycoprotein）。 蛋白质的糖基化与细胞功能密切相关：细胞 识别，胞内消化，外排分泌物。 因此，有些生物药品不能用原核细胞表达： EPO
1. 营养成分
氨基酸
氨基酸是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必须氨基酸： 缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱。 此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是 核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所 需要的基本物质。
单糖
培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六 碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收 能力最高，半乳糖最低。
1.三大营养素水解为单体 2.中间产物的生成 3.三羧酸循环
产能代谢：三羧酸循环
葡萄糖产能对比
供氧不足：糖酵解途径 2 ATP; 供氧充分：三羧酸循环 36～38 ATP； 动物细胞大规模培养：供氧成为生物反应器设 计的最重要的因素之一！
动物细胞的生理特点
1. 2. 3. 4. 5. 6.
细胞的分裂周期长： ～ 细胞的分裂周期长：12～18h 分裂周期长 细胞生长需贴附于基质 并有接触抑制现象； 贴附于基质， 接触抑制现象 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象； 正常二倍体细胞的生长寿命有限 寿命有限； 正常二倍体细胞的生长寿命有限； 动物细胞对周围环境敏感 环境敏感； 动物细胞对周围环境敏感； 动物细胞对培养基的要求高； 培养基的要求高 动物细胞对培养基的要求高； 动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰 蛋白质的合成途径和修饰功能与 动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与 细菌不同。 细菌不同。
细胞质 细胞壁 代表生物
第二节 动物细胞的形态与生理特性
1. 贴壁细胞的生长特征
成纤维细胞
人胃腺癌细胞
2. 悬浮细胞的生长特征
白细胞细胞：K562
腹水瘤细胞：Ehrlich腹水瘤细胞EAC
3. 兼性贴壁细胞
CHO-K1
CHO－K1
动物细胞的化学组成与代谢
大分子： 蛋白质 核酸 糖 脂质
大分子代谢的三个阶段
血清、塑料瓶/玻璃瓶，生长密度80％左右为佳。 及时传代！
正常二倍体细胞的寿命有限
原代培养：离体培养开始的时间称“原代培 养”；经若干代之后细胞趋于死亡。成纤维 细胞～50代，加入表皮生长因子～150代。 转化成异常体后～无限细胞系，成为“永生 化”细胞。
动物细胞对周围环境十分敏感
细胞膜对理化因素：渗透压，pH, 离子浓度， 剪切力，微量元素等敏感。一切导致脂质和 蛋白质变性的因素都影响动物细胞的存活
血清的外观
好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较 粘稠。 如血清浑浊、不透明、含许多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋白质 变性。 若血清呈棕红色，说明血清中的血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象 摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐水太多。
二、天然培养基
血清的使用与储存
一、培养基的基本要求
5. 无毒、无污染
体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有任何抵抗能力， 因此培养基应达到 无化学物质污染 无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等） 无对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体） 对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当 严格选材，严格操作。 对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿 应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。
二、天然培养基
天然培养基 血清的种类 血清的主要成分和作用 血清的质量标准 血清的外观 血清的使用与储存 使用血清的优缺点
二、天然培养基
天然培养基
天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如 血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。 但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培 养基所替代。 目前广泛使用的培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁 的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。
原始细胞库：master cell bank, MCB 生产细胞库: manufacturer’s working bank, MFWB; Working cell bank (WCB)
第四节 动物细胞的培养条件和培养基
一、培养基的基本要求
营养成分 促生长因子 激素 渗透压 pH 无毒、无污染
一、培养基的基本要求
二、生产用动物细胞的获得
1. 2. 3. 4. 5.
原代细胞 二倍体细胞 转化细胞系 融合细胞系 重组工程细胞系
原代细胞
最无争议的细胞，但费时，费力，成本高，如： 鸡胚细胞，原代兔肾或鼠肾细胞，淋巴细胞等；
2. 二倍体细胞 二倍体细胞：
原代细胞的驯化产物，仍具正常细胞的特点： 2n核型，贴壁依赖，接触抑制，有限增殖（50 代以内），无致瘤性。代表性细胞株：WI－ 38， MRC-ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，2BS；
一、细胞概述
历史与现状 细胞在生物制药中的意义
大肠杆菌细胞
硅藻
百合花花瓣
植物细胞模式图
动物细胞扫描电镜图 动 物 细 胞 模 式 图
原核细胞与真核细胞区别
原核细胞 细胞大小 细胞核 较小 真核细胞 较大
无成形的细胞核，核物质集中在 有成形的真正的细胞核。 核区。无核膜，无核仁。DNA 有核膜，有核仁。DNA 不与蛋白质结合。 与蛋白质形成染色体。 除核糖体外，无其它的细胞器。 有各种细胞器。 有。主要是肽聚糖。 放线菌、细菌、蓝藻、衣原体 植物细胞、真菌有，动 物细胞无。 真菌、植物、动物
各类细胞周期时间表
细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象： 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象： 在玻璃、塑料等基质上生长，与电荷、 在玻璃、塑料等基质上生长，与电荷、钙镁 离子、贴附因子（ 离子、贴附因子（collagen， Fibronectin） ， ） 有关。 有关。 无血清培养基： 无血清培养基：少！
二、天然培养基
血清的质量标准
促生长效果
克隆形成率 贴瓶率测定 续传代培养
这是血清重要的特性之一，应以培养的细胞来检测
悬浮生长的细胞，有限稀释法，统计克隆生长百分比 贴壁细胞，集落数占接种细胞数的百分比 细胞培养七天收集细胞，计数，取平均值。连续测试 三个周期以上，观察细胞生长状况。
二、天然培养基
5. 基因工程技术构建重组工程细胞
（1）真核细胞基因表达载体的构建
I、病毒载体：牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒、杆状病 毒 II、非病毒载体：质粒
（2) 基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
融合法：脂质体 化学法：磷酸钙沉淀 物理法：电转、基因枪 病毒法：DNA病毒、RNA病毒、多瘤病毒
五、细胞库的建立