凝胶过滤层析测定蛋白质相对分子质量

凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子质量

小组：1 班级：生工1005 学号：020******* 姓名：朱同辉

一、实验目的

1.了解凝胶过滤层析分离生物分子及测定蛋白质相对分子质量的基本原理

2.掌握凝胶过滤层析的基本操作技能

二、实验原理

凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术，同时也是常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。本实验采用的交联葡聚糖凝胶SephadexG—75的分级范围是3000~80000，相对分子质量在此范围内的蛋白质和其他大分子能够用这种凝胶分离开。当蛋白质溶液加到层析柱上端并用洗脱剂进行洗脱是，相对分子质量大的蛋白质进入凝胶网孔程度小，所受阻力校，先从层析柱中被洗脱下来：相对分子质量小的蛋白质进入凝胶网孔的程度大，后被洗脱。从样品上柱开始到某种分子被洗脱下来为止的洗脱液体积称为该分子的洗脱体积（Ve）,在层析条件完全相同的情况下，Ve与相对分子质量的对数（logM）之间存在线性关系。在测定目标蛋白质相对分子质量之前，先测定几种已知相对分子质量的标准蛋白的洗脱体积Ve，以logM对Ve作图将得到标准曲线。在同样的条件下测定样品蛋白的Ve，从标准曲线上即可求得相对分子质量。

三、实验步骤

1.凝胶溶胀

根据层析柱体积确定凝胶的用量，称取SephadexG—75干粉，加过量蒸馏水室温充分膨胀一天，或沸水浴中溶胀3h。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。

2.装柱与平衡

将层析柱垂直固定，连接好底部流出导管，加入缓冲液排除底部空气，关闭出口。将凝胶上面过多的溶液倾出，调节凝胶稠度在70%左右，沿玻棒往层析柱中加入凝胶基质，让其自然沉淀形成柱床，沉降后的凝胶床面应距离层析柱的顶端5cm左右，连接洗脱缓冲液、恒流泵与层析柱上端。用2~3倍柱体积的洗脱液通过层析柱使柱床平衡，流速控制在0.5mL/min左右。凝胶上端保持一段液体以防床面被冲坏。

3.上样与洗脱

将标准蛋白质和待测样品浓度控制在2~10mg/mL。先打了柱的出口，待柱中液面流至与床面平齐时关闭出口，用移液器将0.5mL样品慢慢加入柱床表面，应避免将床面冲起，当样品正好完全流入床中时立刻关闭出口。按加样操作加入洗脱剂，加满后拧紧上口螺丝帽，连通恒流泵，调好流速，以0.6mL/min左右的流速进行洗脱。

4.收集与测定

用自动部分收集器收集洗出液，并用电脑软件记录层析曲线，曲线中吸收峰最高点对应的横坐标为洗脱体积Ve。分别测定四种已知相对分子质量标准蛋白质的洗脱体积Ve，以相对分子质量对数logM对Ve 作图，得到标准曲线，并求出回归方程。将待测蛋白质的洗脱体积Ve代入回归方程计算其相对分子质量。

5.凝胶柱的再生处理

四、实验结果

未知蛋白样品洗脱时间洗脱体积logM M

未知样1 46.45427.8724 4.842 69502

未知样2 57.46934.4814 4.608 40550

未知样3 59.593 35.7558 4.565 36728

未知样4 57.300 34.3800 4.610 40738

五、思考题

1.凝胶过滤层析试验中常用的凝胶有哪些种类？各有何特点？

答：交联葡聚糖凝胶：能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。

琼脂糖凝胶：结构稳定，可以在许多情况下使用，分离范围很广，不可高压消毒，可用化学灭菌。

聚丙烯酰胺凝胶：结构稳定的高聚化合物，不受微生物侵蚀，可高温灭菌。

2.影响凝胶过滤层析分辨率的主要因素有哪些？

答：层析柱的长度、层析柱的填充情况、加样量、凝胶的种类、洗脱液、洗脱速度。

六、讨论

通过实验总结了利用凝胶过滤层析测定蛋白质分子质量应注意的问题，主要是填充层析柱时要连续、均匀、无气泡、无纹路，加样时要防止将柱面冲坏，同时要控制洗脱速度。