第七章重组子的筛选与鉴定
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14 第十四讲(2) 重组子的筛选和鉴定
2 营养缺陷型检测法
如果目的基因产物能降解某些药物使菌 株呈现抗性标记，或者基因产物与某些药物 作用是显颜色反应，则可根据抗性或颜色直 接筛选含目的基因的克隆子。
亮氨酸(leu)为leu菌所必须 。 在不含leu的基本培养基中，只有重组子 表达的leu才能被leu缺陷菌所利用而能生 长，形成菌落。 因此，能生长的菌落是阳性的重组子克 隆，没有重组子的leu缺陷菌在不含leu的 培养基中不能生长，不能形成菌落。
催化4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸， 产生萦光物质4-甲基伞形花酮，以此筛选 含gus基因的转化子。 尤其是gus基因的3’端与其他结构基因连接 产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融 合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在 转化生物体中的定位分析。
Hale Waihona Puke 萤火虫萦光素酶基因（luc）
luc表达产物萤火虫萦光素酶（LUC）在 Mg2+的作用下，可以与萦光素和ATP底物发 生反应，形成与酶结合的腺苷酸萦光素酰 化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合 物转变成为处于激活状态的氧化萦光素， 可以用萦光测定仪快速灵敏地检测出产生 的萦光，是目前研究动植物转基因很好用 的一种报告基因。
3 依赖于重组子结构特征分析的筛选法
⑴ 快速裂解菌落鉴定分子大小 主要是根据有外源DNA片段插入载体后的 重组DNA与载体DNA之间的大小差异来鉴 定重组子。 分别提取不同转化子的DNA，经琼脂糖凝 胶电泳，在琼脂糖凝胶板上出现的DNA带 中，落后的带是重组DNA的带。 此方法只用于重组子的初步鉴定。
7 插入失活法
基本原理： 是将特定的DNA随机插入到重组DNA分子 中，获得一系列插入重组子，根据其突变 的类型鉴定失活的基因，进一步利用此插 入DNA作为标记物，对失活基因进行定位。
重组子介绍
(1)
重组子的概念
重组子的概念
<3>
Leon
LacZ 基因
抗性基因
酶切位点 可供插入 外源基因
复制子
重组子
<4>
Leon
合成的DNA序列
载体质粒
限制性内切酶酶切 合成为重组质粒 筛选出正向插入的质粒 对细菌株进行诱导 导入重组质粒 筛选培育出重组子
重组子的构建
<5>
Leon
（2）
重组子的筛选、鉴定
并以此与目的基因的 已知图谱对比，因此 利用这种方法不仅能 区分重组子，与非重 组子，而且还能鉴定 目的重组子。
限制性核酸内切酶图谱鉴定法
<11>
Leon
但这种方法在用于数千规模的转化子筛 选时，工作量极大，实验成本也高。 最常用的方法：挑取单菌落，用液体培 养基扩大培养后提取质粒，小规模制备质粒 DNA进行酶切分析，用重组时所用相同限制 性核酸内切酶酶切，并与空载体进行琼脂糖 凝胶电泳比较分析，如出现跟目的基因长度 一样的DNA片段的电泳带即证明重组体中带 有目的基因。
限制性核酸内切酶图谱鉴定法 <11> Leon
PCR扩增鉴定法
通过聚合酶链式反应，扩增出大量的质 粒DNA序列。并与对照组的DNA序列同时进 行电泳，比对电泳结果。若出现明亮的新条 带，则说明为重组质粒。
PCR扩增鉴定法
<18>
Leon
提取质粒
PCR扩增
构建引物 琼脂糖电泳
PCR扩增
原重组质粒
PCR扩增法
白色
蓝白斑筛选法图解
转化了重组质粒的菌，即 目的重组菌，长成白色菌落。
<13> Leon
重组体筛选和鉴定PPT课件
通过在培养基中添加抗生素或 其他抗性标记物，筛选出含有 目的基因的重组细胞或菌落。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定姓名:郑小煜学号:201100140069班级:11级生技班同组者:赵莉、高瑞【实验目的】1、学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2、通过对DNA的酶切，学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
3、学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
4、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法。
5、学习并掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6、在使用红白菌落法筛选获得重组子的基础上，本实验学习通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提鉴定，以进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，验证重组子是期望的重组子的方法。
7、通过学习掌握重组DNA分子鉴定的基本方法。
8、掌握α互补筛选法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
9、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法。
10、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。
【实验原理】外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1、限制性核酸内切酶及酶切反应体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。
其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
转化子的筛选和重组子的鉴定
双脱氧末端终止测序法旳基本操作：
ssDNA ssDNA ssDNA ssDNA
Prime Prime Prime Prime rKlenow rKlenow rKlenow rKlenow dNTPs dNTPs dNTPs dNTPs ddATP ddCTP ddGTP ddTTP
聚丙烯酰胺凝胶电 泳A C G T
pUC18 2.7 kb
ori
后经过其长度来鉴定其是否为重组子 Apr
区别重组子与非重组子
假如外源DNA片段插pUC18 旳SphI位点处，原则上也可 用SphI酶解鉴定，但这么做 很不经济，因为SphI非常昂 贵（每100单位50美元）。用 HindIII和EcoRI联合酶解一样 能够到达目旳，但这两种酶 旳价格只及SphI旳1 / 50
非重组子：Apr、Tcr
重组子：Aps、Tcs
EcoR I Cla I
Pst I Hind III
Pvu I
BamH I
Pst I Ap r
Tcr
Sal I
pBR322
4363 bp
ROI
ori
ROP
Bal I
Hind II
基本操作： 将转化液涂布含Ap旳平板
再将Ap平板上旳转化子影印 至具有Ap和Tc旳平板上
缺刻前移标识法
5＇ 5＇ 5＇ 5＇
5＇
5＇
DNase I
5＇
DNA聚合酶I
5＇
dNTP、[α-32P]dATP
5＇
变性
5＇
限制性酶切图谱法
所谓旳限制性酶切图谱法就是对载体上插入旳外源 DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目旳基因旳已 知图谱对比，所以利用这种措施不但能区别重组子与非 重组子，而且还能鉴定目旳重组子。但这种措施在用于 数千规模旳转化子筛选时，工作量极大，试验成本也高 。
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操 作中形成的喷雾、 试剂及任何与扩增产物接触的东 西。
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
重组子筛选与鉴定
即重组子只能在Ap板上形成菌落，而不能在Tc板上形成 菌落，而非重组子在这两种平板上都能形成菌落，比较两 种平板上对应的转化子的生长状况，即可Ap板上挑出重 组子。
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第二节 核酸分子杂交检测法
利用碱基配对原理进行的分子杂交是鉴定基因重 组体的常用方法。杂交的双方是待测的受体细胞基因 片段与由插入片段基因制备的DNA或RNA探针。
常用的筛选重组体的杂交方法有 1、菌落和噬菌斑原位杂交 2、斑点印迹杂交 3、R-环检测 4、Southern印迹杂交 5、Northern印迹杂交
1、原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以 直接找出阳性菌落。
2、斑点印迹杂交
3、R-环检测法
（1）原理： DNA-RNA杂交。
（2）选择过程 用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的 时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链 更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。
二抗上连着一种酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸 酶、过氧化物酶、脲酶等）。
（4）显色反应
加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应 转变成有色物质（或发光）。
（5）比色
在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结 果。
3、ELISA的局限性 有效，但敏感性、特异性稍差（主要取决于 一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
退火温度由 58℃ 提高到62℃ 是由于原来引物 中的酶切位点和保护碱基与待扩增的基因是不配对 的，现在配对的数量增多，退火温度越高,特异性越 强。
循环次数减少是因为25～30个循环的扩增量 足够进行检测，如果量太大跑出的电泳条带呈现︼ 型，不易确定分子量。
菌落PCR出现假阳性 样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染
酶
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
重组子的筛选与鉴定.ppt
• 指编码的产物能够使转化或转染的细胞在有选择 剂或营养缺乏的情况下很好生长或表现出其他可 视特征的基因。
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。
第七章 重组体克隆的筛选和鉴定
第七章 重组体克隆的筛选和鉴定
第一节 利用遗传标记的表型特征筛选
利用载体上的携带的选择性标记基因筛选转化子或重组子
一、抗药性筛选法 1. 原理： 原理： 载体上携带有受体细胞敏感的抗生素抗性 基因。
质粒上有两个抗菌素性基因: 如：pBR322质粒上有两个抗菌素性基因 质粒上有两个抗菌素性基因 Tetr和Ampr。
选择过程： 3. 选择过程： （1）四环素抗性插入失活 ） 如果在Tet 上插入外源DNA，导致四 如果在 r上插入外源 ， 环素抗性基因失活，可用四环素加环 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 平板培养基选择重组克隆 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 失活的菌生长被四环素抑制， 丝氨酸杀死，保留下来； 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。 反而被环丝氨酸杀死。
最好用单克隆抗体（ 最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）。 ）。
blotting） 四、免疫印迹（western blotting）法 免疫印迹（ 在蛋白质凝胶电泳以后， 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。 法检测胶上的蛋白质泳带。 1.原理： 1.原理： 原理 （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 ） 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）： ）： ① SDS: 是蛋白质的变性剂， 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的 蛋白质维持线性状态， 蛋白质维持线性状态，并与蛋白质 结合，使蛋白质带上负电荷。 结合，使蛋白质带上负电荷。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
第一节 利用遗传标记的表型特征筛选
利用载体上的携带的选择性标记基因筛选转化子或重组子
一、抗药性筛选法 1. 原理： 原理： 载体上携带有受体细胞敏感的抗生素抗性 基因。
质粒上有两个抗菌素性基因: 如：pBR322质粒上有两个抗菌素性基因 质粒上有两个抗菌素性基因 Tetr和Ampr。
选择过程： 3. 选择过程： （1）四环素抗性插入失活 ） 如果在Tet 上插入外源DNA，导致四 如果在 r上插入外源 ， 环素抗性基因失活，可用四环素加环 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 平板培养基选择重组克隆 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 失活的菌生长被四环素抑制， 丝氨酸杀死，保留下来； 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。 反而被环丝氨酸杀死。
最好用单克隆抗体（ 最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）。 ）。
blotting） 四、免疫印迹（western blotting）法 免疫印迹（ 在蛋白质凝胶电泳以后， 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。 法检测胶上的蛋白质泳带。 1.原理： 1.原理： 原理 （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 ） 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）： ）： ① SDS: 是蛋白质的变性剂， 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的 蛋白质维持线性状态， 蛋白质维持线性状态，并与蛋白质 结合，使蛋白质带上负电荷。 结合，使蛋白质带上负电荷。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
重组子的筛选与鉴定
丝氨酸杀死。
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基
因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子；
（不破坏 肽）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。 1.原理 （1）弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型
缺陷。
受体菌： his
-
外源基因： his
+
阳性克隆才能在不 含组氨酸的培养基 中生长
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例：小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二
优点：简便、快速，结果较可靠。
缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所 具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表 现出外源基因编码的表型特征。
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基
因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子；
（不破坏 肽）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。 1.原理 （1）弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型
缺陷。
受体菌： his
-
外源基因： his
+
阳性克隆才能在不 含组氨酸的培养基 中生长
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例：小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二
优点：简便、快速，结果较可靠。
缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所 具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表 现出外源基因编码的表型特征。
重组子筛选与鉴定
（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子
④链霉素：Sm，Str，含Str抗性基因的菌体转译一种能修 饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体的结合，抗Sm菌落的终浓 度为25µg/ml，贮存液为20mg/ml水溶液。
⑤四环素：Tc，Tet，含Tc抗性基因的菌体转译能改变细 胞膜的蛋白，防止Tc进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成， 抗Tc菌落的终浓度为12.5~15.0µg/ml，含Tc培养基中不可 加Mg盐，因Mg 盐拮抗Tc，贮存液为12.5mg/ml乙醇-水溶 液，含Tc溶液与培养液均应在暗处存放。
据转化的方法不同，转基因动物细胞的筛选方式 分为HAT选择法和共转化选择法两种。
① 胸腺激酶（TK）基因
HAT选择法的原理：
利用培养基中的叶酸类似物氨基喋呤（APT）阻 断细胞核苷酸的合成途径，启动以次黄嘌呤为底 物的补救合成途径。该途径不受APT的抑制，能 继续合成出所需核苷酸。
由于在HAT培养基中不加外源胸苷，通过TK酶 的作用，tk+细胞能以其为底物合成出TTP，故tk+ 细胞可以存活，而tk-细胞不能合成而死亡。
（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子
②氯霉素：Cm，Cmp，含Cat基因的菌体能转译 氯霉素乙酰转酰基酶，使Cm乙酰化而失效。抗 Cm菌落的终浓度为30µg/ml，贮存液为34mg/ml 乙醇溶液。
③卡那霉素：Km，kan，含kan抗性基因的菌体 转译能修饰km的酶，阻碍Km对核糖体的干扰， 抗Km菌落的终浓度为5µg/ml，贮存液为25mg/ml 水溶液。
2. 营养缺陷型检测法
根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质，筛 选含目的基因的克隆子。
如果目的基因产物能够降解某些药物使菌株呈现 出抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是显 色反应，则可根据抗性或颜色变化直接筛选含目 的基因的克隆子。
第七章重组子的筛选与鉴定
2.斑点杂交
▪ 斑点杂交（Dot blot）：是将被检标本点到膜上，烘烤 固定。这种方法耗时短，一张膜上可同时检测多个样品。
▪ （1）DNA斑点杂交： ①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。 可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互 补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止 密码（不破坏肽）。
▪ 四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr) 等
pBR322
特点： ▪ 多种抗药标记 ▪ 分子量低：4363bp ▪ 高拷贝 ▪ 多单酶切位点 ▪ 不影响复制
pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因：
产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉 酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
▪ R-环结构十分稳定，可以在电子显微镜下观察到。可以 鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源的区域。
三 核酸杂交法
▪ 带有互补序列的DNA或RNA，其相应的同源区 段就会退火形成双链结构；如果退火的核酸来 自不同的有机体，形成的双链分子就被称为 “杂种核酸分子”
▪ DNA/DNA杂交揭示亲缘关系的远近。 ▪ DNA/RNA杂交也可用来揭示核酸片段中特定基
自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置。 ▪ X光底片曝光，得到放射自显影图片
重组子的筛选与鉴定
在转化反应中，并非所有的细胞都转入重组DNA分子， 即使所有的受体细胞都变为转化体，所获得的转化子仍 是多种类型的DNA分子，因为在连接产物中既有裁体和 一个或数个串联目的基因的连接，也有载体的自连，还 有目的DNA分子的自连，更多的是未发生连接反应的载 体和目的DNA片段。
因此在成千上万个转化子中，真正含有期望的重组DNA分子的比例很少，为了将含有 外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA宿主细胞分开，以及将含有正确重组子的宿主细 胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开。这就需要设计出容易于筛选重组子克隆的方 案并加以验证，这就是我们这一章要讨论的内容。
②在80℃下烘烤1-2h, 使DNA片段稳定地固定在硝酸纤维素滤膜上。
由于干燥滤纸或吸 水纸的虹吸作用，凝 胶中的单链 DNA便随 着电泳缓冲液一起转 移，一旦同硝酸纤维 素滤膜接触，就会牢 固地结合在它的上面， 这样在凝胶中的DNA片 段就会按原谱带模式 吸印到滤膜上。
③ 然后将此滤膜移放在加有放射性同位素标记探针的溶液中进行核酸杂交。这些探针
1.2 -半乳糖苷酶显色反应选择法
1.2.1. 原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的 片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体 菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。 可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补 形成完整有功能的-半乳糖苷酶。-半乳糖苷酶能把无 色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴 -4-氯靛蓝。
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗 性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培 养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝 氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反 而被环丝氨酸杀死。
因此在成千上万个转化子中，真正含有期望的重组DNA分子的比例很少，为了将含有 外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA宿主细胞分开，以及将含有正确重组子的宿主细 胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开。这就需要设计出容易于筛选重组子克隆的方 案并加以验证，这就是我们这一章要讨论的内容。
②在80℃下烘烤1-2h, 使DNA片段稳定地固定在硝酸纤维素滤膜上。
由于干燥滤纸或吸 水纸的虹吸作用，凝 胶中的单链 DNA便随 着电泳缓冲液一起转 移，一旦同硝酸纤维 素滤膜接触，就会牢 固地结合在它的上面， 这样在凝胶中的DNA片 段就会按原谱带模式 吸印到滤膜上。
③ 然后将此滤膜移放在加有放射性同位素标记探针的溶液中进行核酸杂交。这些探针
1.2 -半乳糖苷酶显色反应选择法
1.2.1. 原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的 片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体 菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。 可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补 形成完整有功能的-半乳糖苷酶。-半乳糖苷酶能把无 色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴 -4-氯靛蓝。
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗 性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培 养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝 氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反 而被环丝氨酸杀死。
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2. 转化率
▪ 转化菌中有一部分是重组子，还有非重组子。 ▪ 重组子中存在非目的重组子。
转化子
重组子
目的重组子
▪ 由于重组率和转化率不可能达到理想极限， 因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转 化子与非转化子、重组子与非重组子、目 的重组子与非目的重组子。
《基因工程原理》
重组子的筛选与鉴定
山东理工大学生命科学学院 张建勇
常见的营养缺陷型筛选标记： ▪ 用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨
酸生物合成基因trp+ ▪ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常
使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
例：
小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
《基因工程原理》
基因工程原理
Principles of Genetic Engineering
山东理工大学生命科学学院
分
总
目的基因 基因载体
体
切
技
术
路
线
接
重组子
转 筛
表
1.重组率
▪ 重组子（目的重组子） ▪ 自我连接载体（非重组
子） ▪ 两个相互连接的载体以
及两个基因片段插入的 载体（非目的重组子）
▪ 例如，编码大肠杆菌生物合成基因的克隆所具有的 外源DNA片段，对于大肠杆菌寄主菌株的不可逆 的营养缺陷突变具有互补的功能。根据这种特性， 便可以分离到获得了这种基因的重组体克隆。
弥补缺陷
▪ 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化 子。其原理是：载体分子上携带某种营养组 份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这 一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养 组份的培养基上，长出的便是转化子
▪ (1) 抗生素抗性基因插入失活选择法 ▪ (2) β-半乳糖苷酶显色反应选择法
(1)抗生素抗性基因插入失活选择
▪ 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插人失 活效应(insertional inactivation)。
▪ 适用于带有抗生素抗性基因的克隆载体，将外源 DNA插入到抗生素抗性基因序列内，该基因就失活。 设计一套含抗生素平板，可筛选出重组子。
（3）环丝氨酸：
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基 因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择 重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸 杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被 环丝氨酸杀死。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗 性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
(2) β-半乳糖苷酶显色反应选择法
▪ 更小的分子量和 更高的拷贝数
▪ β-半乳糖苷酶显 色反应检测重组 体
▪ 具有多克隆位点
2686bp
▪ 区分转化子与非 转化子
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。 可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互 补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止 密码（不破坏肽）。
▪ 四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr) 等
pBR322
特点： ▪ 多种抗药标记 ▪ 分子量低：4363bp ▪ 高拷贝 ▪ 多单酶切位点 ▪ 不影响复制
pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因：
产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉 酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
▪ 外源DNA插入到它的lac Z基因上所造成的β-半乳糖苷酶失 活效应，大肠杆菌转化子菌落在X-gal-IPTG培养基中的颜 色为白色。
β-半乳糖苷酶法
Am
lacZ
N2H
片段
片段
COOH
-半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
白色菌落 （重组子）
蓝色菌落 （非重组子）
蓝色菌落 （非重组子）
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
（3）溶菌选择法
▪ λDNA感染E.coli发 生溶菌生长，形成 很亮的噬菌斑，溶 源生长多少也有溶 菌，挑选噬菌斑即 可分析鉴定转化子。
2．根据插入序列的表型特征选择重组体分子
▪ 基本原理：转化的外源DNA编码的基因，能够对 大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互 补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因 编码的表型特征。
第七章 重组子的筛选与鉴定
▪ 一、 遗传检测法 ▪ 二、 物理检测法 ▪ 三、 杂交检测法 ▪ 四、 免疫化学检测法 确定外源DNA片段是否插入并与载体连接。
一、 遗传检测法
▪ 1．根据载体表型特征选择重组体分子 ▪ 2．根据插入序列表型特征选择重组体分子
1．根据载体表型特征选择重组体分子
▪ 载体分子，都带有一个可选择的遗传标记或表型特 征。根据载体分子的遗传特征进行选择，是获得重 组体DNA分子细胞群体的必不可少的条件之一。
(2) β-半乳糖苷酶显色反应选择法
▪ 将pUC质粒转化的细胞培养在补加有X-gal和乳糖诱导物 IPTG的培养基中时，由于基因内互补作用形成的有功能的 半乳糖苷酶，会把培养基中无色的X-gal切割成半乳糖和深 蓝色的底物5-溴-4-氯-靛蓝(5-bromo-4-chloro-indigo)，使菌 落呈现出蓝色。
“选择”（selection）和“筛选” （screening）的基本含义
▪ 选择，是指通过某种外来附加压力（或因素） 的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克 隆类型的一种方法。包括根据克隆载体提供的 表型特征的简单选择，和根据突变的互补作用 对克隆基因的直接选择。
▪ 筛选则是指通过某特定克隆的过程。