第七章重组子的筛选与鉴定
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▪ 四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr) 等
pBR322
特点： ▪ 多种抗药标记 ▪ 分子量低：4363bp ▪ 高拷贝 ▪ 多单酶切位点 ▪ 不影响复制
pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因：
产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉 酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
(2) β-半乳糖苷酶显色反应选择法
▪ 将pUC质粒转化的细胞培养在补加有X-gal和乳糖诱导物 IPTG的培养基中时，由于基因内互补作用形成的有功能的 半乳糖苷酶，会把培养基中无色的X-gal切割成半乳糖和深 蓝色的底物5-溴-4-氯-靛蓝(5-bromo-4-chloro-indigo)，使菌 落呈现出蓝色。
（3）环丝氨酸：
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基 因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择 重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸 杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被 环丝氨酸杀死。
常见的营养缺陷型筛选标记： ▪ 用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨
酸生物合成基因trp+ ▪ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常
使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体 细胞则选择tk-缺陷型
增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
Βιβλιοθήκη Baidu例：
小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
▪ 外源DNA插入到它的lac Z基因上所造成的β-半乳糖苷酶失 活效应，大肠杆菌转化子菌落在X-gal-IPTG培养基中的颜 色为白色。
β-半乳糖苷酶法
Am
lacZ
N2H
片段
片段
COOH
-半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
▪ (1) 抗生素抗性基因插入失活选择法 ▪ (2) β-半乳糖苷酶显色反应选择法
(1)抗生素抗性基因插入失活选择
▪ 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插人失 活效应(insertional inactivation)。
▪ 适用于带有抗生素抗性基因的克隆载体，将外源 DNA插入到抗生素抗性基因序列内，该基因就失活。 设计一套含抗生素平板，可筛选出重组子。
▪ 例如，编码大肠杆菌生物合成基因的克隆所具有的 外源DNA片段，对于大肠杆菌寄主菌株的不可逆 的营养缺陷突变具有互补的功能。根据这种特性， 便可以分离到获得了这种基因的重组体克隆。
弥补缺陷
▪ 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化 子。其原理是：载体分子上携带某种营养组 份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这 一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养 组份的培养基上，长出的便是转化子
2. 转化率
▪ 转化菌中有一部分是重组子，还有非重组子。 ▪ 重组子中存在非目的重组子。
转化子
重组子
目的重组子
▪ 由于重组率和转化率不可能达到理想极限， 因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转 化子与非转化子、重组子与非重组子、目 的重组子与非目的重组子。
《基因工程原理》
重组子的筛选与鉴定
山东理工大学生命科学学院 张建勇
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗 性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
(2) β-半乳糖苷酶显色反应选择法
▪ 更小的分子量和 更高的拷贝数
▪ β-半乳糖苷酶显 色反应检测重组 体
▪ 具有多克隆位点
2686bp
▪ 区分转化子与非 转化子
《基因工程原理》
基因工程原理
Principles of Genetic Engineering
山东理工大学生命科学学院
分
总
目的基因 基因载体
体
切
技
术
路
线
接
重组子
转 筛
表
1.重组率
▪ 重组子（目的重组子） ▪ 自我连接载体（非重组
子） ▪ 两个相互连接的载体以
及两个基因片段插入的 载体（非目的重组子）
“选择”（selection）和“筛选” （screening）的基本含义
▪ 选择，是指通过某种外来附加压力（或因素） 的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克 隆类型的一种方法。包括根据克隆载体提供的 表型特征的简单选择，和根据突变的互补作用 对克隆基因的直接选择。
▪ 筛选则是指通过某种特定的方法，从被分析的 细胞群体或基因文库中，鉴定出真正具有所需 重组DNA分子的特定克隆的过程。
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。 可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互 补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止 密码（不破坏肽）。
第七章 重组子的筛选与鉴定
▪ 一、 遗传检测法 ▪ 二、 物理检测法 ▪ 三、 杂交检测法 ▪ 四、 免疫化学检测法 确定外源DNA片段是否插入并与载体连接。
一、 遗传检测法
▪ 1．根据载体表型特征选择重组体分子 ▪ 2．根据插入序列表型特征选择重组体分子
1．根据载体表型特征选择重组体分子
▪ 载体分子，都带有一个可选择的遗传标记或表型特 征。根据载体分子的遗传特征进行选择，是获得重 组体DNA分子细胞群体的必不可少的条件之一。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
白色菌落 （重组子）
蓝色菌落 （非重组子）
蓝色菌落 （非重组子）
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
（3）溶菌选择法
▪ λDNA感染E.coli发 生溶菌生长，形成 很亮的噬菌斑，溶 源生长多少也有溶 菌，挑选噬菌斑即 可分析鉴定转化子。
2．根据插入序列的表型特征选择重组体分子
▪ 基本原理：转化的外源DNA编码的基因，能够对 大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互 补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因 编码的表型特征。
pBR322
特点： ▪ 多种抗药标记 ▪ 分子量低：4363bp ▪ 高拷贝 ▪ 多单酶切位点 ▪ 不影响复制
pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因：
产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉 酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
(2) β-半乳糖苷酶显色反应选择法
▪ 将pUC质粒转化的细胞培养在补加有X-gal和乳糖诱导物 IPTG的培养基中时，由于基因内互补作用形成的有功能的 半乳糖苷酶，会把培养基中无色的X-gal切割成半乳糖和深 蓝色的底物5-溴-4-氯-靛蓝(5-bromo-4-chloro-indigo)，使菌 落呈现出蓝色。
（3）环丝氨酸：
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基 因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择 重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸 杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被 环丝氨酸杀死。
常见的营养缺陷型筛选标记： ▪ 用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨
酸生物合成基因trp+ ▪ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常
使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体 细胞则选择tk-缺陷型
增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
Βιβλιοθήκη Baidu例：
小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
▪ 外源DNA插入到它的lac Z基因上所造成的β-半乳糖苷酶失 活效应，大肠杆菌转化子菌落在X-gal-IPTG培养基中的颜 色为白色。
β-半乳糖苷酶法
Am
lacZ
N2H
片段
片段
COOH
-半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
▪ (1) 抗生素抗性基因插入失活选择法 ▪ (2) β-半乳糖苷酶显色反应选择法
(1)抗生素抗性基因插入失活选择
▪ 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插人失 活效应(insertional inactivation)。
▪ 适用于带有抗生素抗性基因的克隆载体，将外源 DNA插入到抗生素抗性基因序列内，该基因就失活。 设计一套含抗生素平板，可筛选出重组子。
▪ 例如，编码大肠杆菌生物合成基因的克隆所具有的 外源DNA片段，对于大肠杆菌寄主菌株的不可逆 的营养缺陷突变具有互补的功能。根据这种特性， 便可以分离到获得了这种基因的重组体克隆。
弥补缺陷
▪ 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化 子。其原理是：载体分子上携带某种营养组 份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这 一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养 组份的培养基上，长出的便是转化子
2. 转化率
▪ 转化菌中有一部分是重组子，还有非重组子。 ▪ 重组子中存在非目的重组子。
转化子
重组子
目的重组子
▪ 由于重组率和转化率不可能达到理想极限， 因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转 化子与非转化子、重组子与非重组子、目 的重组子与非目的重组子。
《基因工程原理》
重组子的筛选与鉴定
山东理工大学生命科学学院 张建勇
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗 性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
(2) β-半乳糖苷酶显色反应选择法
▪ 更小的分子量和 更高的拷贝数
▪ β-半乳糖苷酶显 色反应检测重组 体
▪ 具有多克隆位点
2686bp
▪ 区分转化子与非 转化子
《基因工程原理》
基因工程原理
Principles of Genetic Engineering
山东理工大学生命科学学院
分
总
目的基因 基因载体
体
切
技
术
路
线
接
重组子
转 筛
表
1.重组率
▪ 重组子（目的重组子） ▪ 自我连接载体（非重组
子） ▪ 两个相互连接的载体以
及两个基因片段插入的 载体（非目的重组子）
“选择”（selection）和“筛选” （screening）的基本含义
▪ 选择，是指通过某种外来附加压力（或因素） 的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克 隆类型的一种方法。包括根据克隆载体提供的 表型特征的简单选择，和根据突变的互补作用 对克隆基因的直接选择。
▪ 筛选则是指通过某种特定的方法，从被分析的 细胞群体或基因文库中，鉴定出真正具有所需 重组DNA分子的特定克隆的过程。
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。 可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互 补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止 密码（不破坏肽）。
第七章 重组子的筛选与鉴定
▪ 一、 遗传检测法 ▪ 二、 物理检测法 ▪ 三、 杂交检测法 ▪ 四、 免疫化学检测法 确定外源DNA片段是否插入并与载体连接。
一、 遗传检测法
▪ 1．根据载体表型特征选择重组体分子 ▪ 2．根据插入序列表型特征选择重组体分子
1．根据载体表型特征选择重组体分子
▪ 载体分子，都带有一个可选择的遗传标记或表型特 征。根据载体分子的遗传特征进行选择，是获得重 组体DNA分子细胞群体的必不可少的条件之一。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
白色菌落 （重组子）
蓝色菌落 （非重组子）
蓝色菌落 （非重组子）
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
（3）溶菌选择法
▪ λDNA感染E.coli发 生溶菌生长，形成 很亮的噬菌斑，溶 源生长多少也有溶 菌，挑选噬菌斑即 可分析鉴定转化子。
2．根据插入序列的表型特征选择重组体分子
▪ 基本原理：转化的外源DNA编码的基因，能够对 大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互 补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因 编码的表型特征。