RNAi的发现过程
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
究时发现，在孵育的裂解液中，501bp的Rr-dsRNA和505bp的Pp-dsRNA 的放射性大约有15％出现在21-23nt的RNA片段中，并且没有检测到其他稳 定产物。从右图的条带2、3和9、10可以看出，有无mRNA并不会影响到 21-23ntRNA的产生。
为了进一步了解RNAi的机制，Zamore绘制了三个 dsRNA的几个mRNA切割位点的位置，从左图可以发现 ，分裂的间隔大部分在21-23nt之间，9nt的产生是因为 dsRNA的解离能力不够。它们将孵育产生的21-23nt替 代dsRNA添加到新的RNAi反应中,也能在体外产生序列 特异性干扰。
dsRNA的反应时，出现了一个特异性问题：有
些生物体存在一种对dsRNA依赖的蛋白激酶，
它能激活干扰反应机制。因此他们猜想反义协
同作用可能反映了一种非特异性的反义作用潜
能 。 他 们 联 合 注 射 与 unc-22 无 关 的 dsRNA 片
段，并没有增强单个unc-22-RNA链介导抑制
的能力，之后使用另外三个表型特征良好的基 因 评 估 dsRNA 效 应 的 靶 向 特 异 性 ， unc-54 编 码全肌收缩所需的肌球蛋白的体壁肌重链亚型；
Ken Kemphues为何没能分享诺贝尔奖的荣誉？
• 医学奖委员会主席---Karolinska学院教授Bertil Daneholt写的“Advanced Information”中提到， Ken Kemphues（其铺垫性工作是复旦留美学生郭苏做的）未能分享诺贝尔奖荣誉的原因主要在于 “remarkably sense RNA（24）could also silence genes, but the results were inconsistent and the effects usually modest”.
Dicer的作用发现
2001年，Ketting等人通过测试
胚胎提取物Dicer的活性，并利用免疫 沉淀、缺失突变体分离、基因转移、 Seam细胞分析、RNAi检验等方法解 释了Dicer在秀丽隐杆线虫RNA干扰 和小RNA合成中的作用。
Dicer可能参与两个不同的过程，这两个过程都需 要将dsRNA加工成小RNA，其中一条途径(ds-RNA 诱导)通过RISC复合物和RNAi导致RNA降解。第二 种途径(依赖于let-7)通过内源性的、短暂的小RNA 及其mRNA靶点之间的相互作用导致翻译的抑制。
pSUPER载体是否可以介导基因表达 的稳定抑制？
MCF-7 细 胞 与 含 有 puromycin 抗 性 的 载 体 pSUPER 或 pSUPER-p53 共 转 染 ， 结 果 表 明 ， pSUPER 介 导 的 基 因 敲 除 持 续 时 间 较 长 ， 它 的 转录产物对细胞没有毒性。
“后人改良”：当他们将T4和T7 RNA聚合酶体外转录
制备的单链RNA电泳纯化后再注射于线虫，结果发现只有微弱 的基因抑制作用。而将纯化后的dsRNA 一正义链和反义链的 混合物注入线虫，发现dsRNA能够高效特 异的阻断相应基因 的表达，而且抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量 级。该小组将这一现象称为“RNA interference-RNA干扰” 。首次揭开了Guo和Kemphues的谜底。
fem-1编码两性生殖所需的含锚蛋白重复序列的蛋白质；hlh-1编码正确体形和运动所需的
肌球蛋白。分别注射与这些基因相关的dsRNA到线虫体内，在子代中没有出现完全变异的表
型。
不同相关基因的dsRNA注射 到线虫后的显著表型表明，干扰 效应在高比例的细胞中发生。为 了在细胞水平上检测dsRNA的干 扰效应，他们用大肠杆菌 PD4251菌株评估一个在肌肉中 表达两种不同绿色荧光蛋白（ GFP）的转基因系gfp和lacZ活 性的干扰，PD4251菌株是一个 稳定的转基因菌株，这种菌株在 全身肌肉中产生GFP。将gfp和 lacZ的dsRNA分别注射到大肠杆 菌的幼虫期和成虫期，观察荧光
Βιβλιοθήκη Baidu
RNA干扰
诺贝尔奖
2006年10月2日，瑞典卡罗林斯卡医学院宣布 将2006年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美 国科学家安德鲁 · 法尔（Andrew Fire）和克 雷格 · 梅洛（Craig Mello），以表彰他们发 现了“RNA干扰”机制。
诺贝尔奖评审委员会发布的公报说：法尔和梅 洛获奖是因为他们“发现了控制遗传信息流动 的基本机制”。
RNAi相较于CRISPR技术的优势
• RNAi的执行更为迅速，节省了的时间和金钱。RNAi不需要在实际的基因 敲除实验之前将额外的基因引入细胞，因为大多数细胞都带有完整的 RNAi沉默机制。
• RNAi对TSSs没有特异性。因此，RNAi可以用于转录组但没有基因组测 序数据的物种。
• RNAi针对的是细胞质中的RNA转录本，而不是细胞核中的基因组DNA， 不受染色质状态的影响。
RNA干扰的发现过程
指导教师：牛雪梅老师 第三小组成员：刘亚君、吕锐利、任苗、史瑞、宋心玥、宋志强、孙文豪
2019-11-25
野生型
试验
预期
1990年，美国和荷兰的两个转基因植物实验组Rich Jorgensen
和同事为了让花朵颜色更鲜艳，给矮牵牛花（petunias）注入了一种能
形成红色素的基因，但结果却使矮牵牛花完全褪色！也就是说转基因的 植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因受到抑制。因此他将 这种现象命名为“Cosuppression-协同抑制”。
• 委员会认为此项发现真正的“第一步”是Mello实验室1997年文章中的“大胆假设”加上Fire和 Mello两个小组合作并于1998年完成的“小心求证”
• 如果Kemphues能在其1995年论文的讨论部分大胆猜测一下郭苏的实验对照组用的sense RNA也能 导致gene silencing的原因，提出双链RNA也有可能抑制基因表达，那么Kemphues就有可能分享荣 誉。
RNAi：A Phasing-Out Technology?
• 显著的脱靶效应和不可预测的 抑制效率
• 其他技术的的出现
RNAi, TALEN, 和CRISPR三者之间的比较
参考文献：Boettcher M , Mcmanus M . Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):575-585.
选择正确的工具: RNAi, TALEN, or CRISPR
参考文献：Boettcher M , Mcmanus M . Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):575-585.
线虫的par-1基因时，本想利用反义RNA技术特异性阻断该基因的表达，同时
在对照实验中给线虫注射正义RNA以观察到基因表达的增强，但得到的结果
却是二者都同样被切断了par-1基因的表达途径，这与传统上对反义RNA技术
的解释正好相反。该研究小组一直未能对这一意外现象给出合理解释。
1998年，法尔等人在考虑已知细胞对
细胞的比例。直接注射gfp的dsRNA可显著降低荧光细胞 的比例。他们还发现在低剂量的dsRNA作用下，当动物 孵化时，胚胎来源的肌肉细胞经常受到干扰。这些分化细 胞的干扰效应在幼虫生长过程中始终存在：随着受影响动 物的生长，这些细胞很少或没有产生额外的GFP。
siRNA的发现
2000年，Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研
图2 为了进一步测试载体系统，他们又设计了合成 siRNA和pSUPER与CDC20转录体中19nt序列相 同的载体。对于CDH1，无论是人工合成的siRNA 还是人工合成的RNA都能有效抑制内源性CDC20 表达（如图2）。
pSUPER载体对基因表达的抑制是 否足够影响细胞生理机能？
他们设计了一个结构来抑制p53（一种电离 辐射后稳定的转录因子），结果表明其设计 的载体可以抑制内源性p53的表达，使其完全 丧失其在DNA损伤反应中的功能（图1D)。
• Kemphues没能对郭苏意外发现的重要性有足够的认识，因为这不属于他的实验室研究的主攻方向--线虫的胚胎发育。
“前人栽树” ：1998年，华盛顿卡耐基研究院的Fire
和麻省大学医学院的Mello首次在秀丽新小杆线虫中证明Su Guo所发现的现象属于转录后水平的基因沉默。他们发现Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象以及过去的反义 RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污 染了微量双链RNA而引起的。
1994年，Carlo Cogoni等人把合成合成类胡萝卜素的基因
albino一1或albino一3 转入 野生型粗脉胞酶(Neurosporaerassa)发现 大约30％转染细胞内源性albino一1或albino一3基因的表达水平反而大
为减弱，当时称这种现象为“quelling-压制”。
1995年，康奈尔大学的Su Guo和Ken Kemphues在试图阻断秀丽隐杆
Figure 1 Genes used to study RNA-mediated genetic interference in C. elegans. Intron–exon structure for genes used to test RNA-mediated inhibition are shown (grey and filled boxes, exons; open boxes, introns; patterned and striped boxes, 59and39untranslatedregions.unc-22.ref.9,unc-54,ref.12,fem-1,ref.14,andhlh-1.
2002年，Brummelkamp
等人首次使用小鼠H1启动子构 建了小发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表达载 体pSUPER，并证实转染该载体 可以有效地、特异性地消除哺乳 动物细胞内目的基因的表达，为 利用RNAi技术进行基因治疗研 究奠定了基础。
图1 用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表达载体pSUPER（如图1A)，最终的转 录体预计会折叠成一个19bp的茎环结构。用pSUPER载体 来抑制内源性CDH1基因，检验了pSUPER载体是否产生 siRNA，然后检验了pSUPER系统的特异性。
图3
RNAi作用机制
起始：核酸酶Dicer首先识别dsRNA或发卡 RNA（hairpin-RNA）将其切割成 21~23 nt 的siRNA。 组装：随后siRNA与无活性的RNA诱导沉默复 合物（RNA induced silencing complex， RISC）结合，在解螺旋酶的作用下siRNA双链 解开为单链。 效应：由于siRNA与mRNA具有高度同源性， 其反义链通过与靶基因mRNA进行特异性结合 使 RISC活化，最后RISC中的酶将靶基因 mRNA剪断，从而实现基因表达沉默。
为了进一步了解RNAi的机制，Zamore绘制了三个 dsRNA的几个mRNA切割位点的位置，从左图可以发现 ，分裂的间隔大部分在21-23nt之间，9nt的产生是因为 dsRNA的解离能力不够。它们将孵育产生的21-23nt替 代dsRNA添加到新的RNAi反应中,也能在体外产生序列 特异性干扰。
dsRNA的反应时，出现了一个特异性问题：有
些生物体存在一种对dsRNA依赖的蛋白激酶，
它能激活干扰反应机制。因此他们猜想反义协
同作用可能反映了一种非特异性的反义作用潜
能 。 他 们 联 合 注 射 与 unc-22 无 关 的 dsRNA 片
段，并没有增强单个unc-22-RNA链介导抑制
的能力，之后使用另外三个表型特征良好的基 因 评 估 dsRNA 效 应 的 靶 向 特 异 性 ， unc-54 编 码全肌收缩所需的肌球蛋白的体壁肌重链亚型；
Ken Kemphues为何没能分享诺贝尔奖的荣誉？
• 医学奖委员会主席---Karolinska学院教授Bertil Daneholt写的“Advanced Information”中提到， Ken Kemphues（其铺垫性工作是复旦留美学生郭苏做的）未能分享诺贝尔奖荣誉的原因主要在于 “remarkably sense RNA（24）could also silence genes, but the results were inconsistent and the effects usually modest”.
Dicer的作用发现
2001年，Ketting等人通过测试
胚胎提取物Dicer的活性，并利用免疫 沉淀、缺失突变体分离、基因转移、 Seam细胞分析、RNAi检验等方法解 释了Dicer在秀丽隐杆线虫RNA干扰 和小RNA合成中的作用。
Dicer可能参与两个不同的过程，这两个过程都需 要将dsRNA加工成小RNA，其中一条途径(ds-RNA 诱导)通过RISC复合物和RNAi导致RNA降解。第二 种途径(依赖于let-7)通过内源性的、短暂的小RNA 及其mRNA靶点之间的相互作用导致翻译的抑制。
pSUPER载体是否可以介导基因表达 的稳定抑制？
MCF-7 细 胞 与 含 有 puromycin 抗 性 的 载 体 pSUPER 或 pSUPER-p53 共 转 染 ， 结 果 表 明 ， pSUPER 介 导 的 基 因 敲 除 持 续 时 间 较 长 ， 它 的 转录产物对细胞没有毒性。
“后人改良”：当他们将T4和T7 RNA聚合酶体外转录
制备的单链RNA电泳纯化后再注射于线虫，结果发现只有微弱 的基因抑制作用。而将纯化后的dsRNA 一正义链和反义链的 混合物注入线虫，发现dsRNA能够高效特 异的阻断相应基因 的表达，而且抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量 级。该小组将这一现象称为“RNA interference-RNA干扰” 。首次揭开了Guo和Kemphues的谜底。
fem-1编码两性生殖所需的含锚蛋白重复序列的蛋白质；hlh-1编码正确体形和运动所需的
肌球蛋白。分别注射与这些基因相关的dsRNA到线虫体内，在子代中没有出现完全变异的表
型。
不同相关基因的dsRNA注射 到线虫后的显著表型表明，干扰 效应在高比例的细胞中发生。为 了在细胞水平上检测dsRNA的干 扰效应，他们用大肠杆菌 PD4251菌株评估一个在肌肉中 表达两种不同绿色荧光蛋白（ GFP）的转基因系gfp和lacZ活 性的干扰，PD4251菌株是一个 稳定的转基因菌株，这种菌株在 全身肌肉中产生GFP。将gfp和 lacZ的dsRNA分别注射到大肠杆 菌的幼虫期和成虫期，观察荧光
Βιβλιοθήκη Baidu
RNA干扰
诺贝尔奖
2006年10月2日，瑞典卡罗林斯卡医学院宣布 将2006年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美 国科学家安德鲁 · 法尔（Andrew Fire）和克 雷格 · 梅洛（Craig Mello），以表彰他们发 现了“RNA干扰”机制。
诺贝尔奖评审委员会发布的公报说：法尔和梅 洛获奖是因为他们“发现了控制遗传信息流动 的基本机制”。
RNAi相较于CRISPR技术的优势
• RNAi的执行更为迅速，节省了的时间和金钱。RNAi不需要在实际的基因 敲除实验之前将额外的基因引入细胞，因为大多数细胞都带有完整的 RNAi沉默机制。
• RNAi对TSSs没有特异性。因此，RNAi可以用于转录组但没有基因组测 序数据的物种。
• RNAi针对的是细胞质中的RNA转录本，而不是细胞核中的基因组DNA， 不受染色质状态的影响。
RNA干扰的发现过程
指导教师：牛雪梅老师 第三小组成员：刘亚君、吕锐利、任苗、史瑞、宋心玥、宋志强、孙文豪
2019-11-25
野生型
试验
预期
1990年，美国和荷兰的两个转基因植物实验组Rich Jorgensen
和同事为了让花朵颜色更鲜艳，给矮牵牛花（petunias）注入了一种能
形成红色素的基因，但结果却使矮牵牛花完全褪色！也就是说转基因的 植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因受到抑制。因此他将 这种现象命名为“Cosuppression-协同抑制”。
• 委员会认为此项发现真正的“第一步”是Mello实验室1997年文章中的“大胆假设”加上Fire和 Mello两个小组合作并于1998年完成的“小心求证”
• 如果Kemphues能在其1995年论文的讨论部分大胆猜测一下郭苏的实验对照组用的sense RNA也能 导致gene silencing的原因，提出双链RNA也有可能抑制基因表达，那么Kemphues就有可能分享荣 誉。
RNAi：A Phasing-Out Technology?
• 显著的脱靶效应和不可预测的 抑制效率
• 其他技术的的出现
RNAi, TALEN, 和CRISPR三者之间的比较
参考文献：Boettcher M , Mcmanus M . Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):575-585.
选择正确的工具: RNAi, TALEN, or CRISPR
参考文献：Boettcher M , Mcmanus M . Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):575-585.
线虫的par-1基因时，本想利用反义RNA技术特异性阻断该基因的表达，同时
在对照实验中给线虫注射正义RNA以观察到基因表达的增强，但得到的结果
却是二者都同样被切断了par-1基因的表达途径，这与传统上对反义RNA技术
的解释正好相反。该研究小组一直未能对这一意外现象给出合理解释。
1998年，法尔等人在考虑已知细胞对
细胞的比例。直接注射gfp的dsRNA可显著降低荧光细胞 的比例。他们还发现在低剂量的dsRNA作用下，当动物 孵化时，胚胎来源的肌肉细胞经常受到干扰。这些分化细 胞的干扰效应在幼虫生长过程中始终存在：随着受影响动 物的生长，这些细胞很少或没有产生额外的GFP。
siRNA的发现
2000年，Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研
图2 为了进一步测试载体系统，他们又设计了合成 siRNA和pSUPER与CDC20转录体中19nt序列相 同的载体。对于CDH1，无论是人工合成的siRNA 还是人工合成的RNA都能有效抑制内源性CDC20 表达（如图2）。
pSUPER载体对基因表达的抑制是 否足够影响细胞生理机能？
他们设计了一个结构来抑制p53（一种电离 辐射后稳定的转录因子），结果表明其设计 的载体可以抑制内源性p53的表达，使其完全 丧失其在DNA损伤反应中的功能（图1D)。
• Kemphues没能对郭苏意外发现的重要性有足够的认识，因为这不属于他的实验室研究的主攻方向--线虫的胚胎发育。
“前人栽树” ：1998年，华盛顿卡耐基研究院的Fire
和麻省大学医学院的Mello首次在秀丽新小杆线虫中证明Su Guo所发现的现象属于转录后水平的基因沉默。他们发现Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象以及过去的反义 RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污 染了微量双链RNA而引起的。
1994年，Carlo Cogoni等人把合成合成类胡萝卜素的基因
albino一1或albino一3 转入 野生型粗脉胞酶(Neurosporaerassa)发现 大约30％转染细胞内源性albino一1或albino一3基因的表达水平反而大
为减弱，当时称这种现象为“quelling-压制”。
1995年，康奈尔大学的Su Guo和Ken Kemphues在试图阻断秀丽隐杆
Figure 1 Genes used to study RNA-mediated genetic interference in C. elegans. Intron–exon structure for genes used to test RNA-mediated inhibition are shown (grey and filled boxes, exons; open boxes, introns; patterned and striped boxes, 59and39untranslatedregions.unc-22.ref.9,unc-54,ref.12,fem-1,ref.14,andhlh-1.
2002年，Brummelkamp
等人首次使用小鼠H1启动子构 建了小发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表达载 体pSUPER，并证实转染该载体 可以有效地、特异性地消除哺乳 动物细胞内目的基因的表达，为 利用RNAi技术进行基因治疗研 究奠定了基础。
图1 用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表达载体pSUPER（如图1A)，最终的转 录体预计会折叠成一个19bp的茎环结构。用pSUPER载体 来抑制内源性CDH1基因，检验了pSUPER载体是否产生 siRNA，然后检验了pSUPER系统的特异性。
图3
RNAi作用机制
起始：核酸酶Dicer首先识别dsRNA或发卡 RNA（hairpin-RNA）将其切割成 21~23 nt 的siRNA。 组装：随后siRNA与无活性的RNA诱导沉默复 合物（RNA induced silencing complex， RISC）结合，在解螺旋酶的作用下siRNA双链 解开为单链。 效应：由于siRNA与mRNA具有高度同源性， 其反义链通过与靶基因mRNA进行特异性结合 使 RISC活化，最后RISC中的酶将靶基因 mRNA剪断，从而实现基因表达沉默。