RNAi的发现过程
RNAi技术和基因沉默的机制和应用
RNAi技术和基因沉默的机制和应用RNA干扰技术（RNAi）是一种广泛适用于生物科学研究的技术。
它是通过引导小分子RNA介导的基因沉默来抑制基因表达。
RNAi技术最初在植物和昆虫中被发现，但现在已广泛用于哺乳动物和人类细胞和组织中的基因表达调控研究。
在本文中，我们将讨论RNAi技术和基因沉默的原理、机制和应用。
RNAi的基本原理RNAi技术利用RNA分子的寡核苷酸（siRNA）或小干扰RNA （shRNA）来干扰基因的表达。
siRNA是由RNA分子降解酶Dicer切割长双链RNA产生的。
shRNA则是由人工合成的RNA分子。
在细胞内，siRNA或shRNA与蛋白质复合物RISC结合并介导基因沉默。
RNAi可以通过两种方式干扰基因表达。
第一种方式是RNA干扰（post-transcriptional gene silencing，PTGS），其作用在转录后RNA分子级别，导致RNA分子的降解或翻译受阻。
第二种方式是基因组学RNAi（simultaneous silencing of multiple genes，SSMG），其作用在基因组水平，导致染色体的某一区域沉默，从而抑制基因的表达。
RNAi的分子机理RNAi的分子机理是一系列复杂的分子事件。
RNAi起始于RNA分子的降解过程。
在细胞内，RNA分子通过RNA聚合酶复制DNA成为mRNA，而mRNA分子则被转录成蛋白质。
RNAi的分子机理是通过RNA分子的降解来干扰基因的表达。
RNA分子的降解分为两个步骤：第一个是dsRNA（双链RNA）的特异酶Dicer的作用分解成siRNA。
第二步骤是siRNA与RISC（RNA诱导的沉默复合物）结合，选择性攻击与siRNA相同序列的mRNA分子，导致mRNA分子的降解或翻译受阻。
这个过程在细胞中形成一个自停反馈回路，使得RNAi可以快速响应和调节基因表达。
RNAi的应用RNAi技术已广泛应用于生物医学研究中的基因调控和治疗。
分子生物学RNA干扰(RNAi)
Craig Mello A professor of Molecular Medicine University of Massachusetts Medical School
In 1998: Fire & Mello in Nature 证实在RNAi 中，真正起作用的是dsRNA
表达与C. elegant worm unc-22基因同源的dsRNA的 细菌喂食线虫，则线虫表现出类似unc-22缺失的表型
•Dicer protein :
Kenneth Kemphues Professor of Genetics
Su Guo Cornell graduate student
Two-cell
Four-cell for distribution of Two-cell to visualize germline-specific mitotic spindles granules.
( The discovery of RNA-mediated interference )
In 1990: Dr. Jorgensen 共抑制现象(cosuppression)
Richard Jorgensen, PhD. Univ. of Arizona RNAi Innovator Awardee
Negative control
Endogenous mex-3 RNA
Injected with mex-3 antisense RNA
Injected with dsRNA corresponding to mex-3
Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA
RNAi发现
RNAi的发现作者：赵晨光来源：生物谷2008-8-4 15:03:2520多年前，Rich Jorgensen和同事在对矮牵牛(petunias)进行的研究的时候发现：将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮脚牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果没看到期待中的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。
Jorgensen将这种现象命名为协同抑制(cosuppression)，因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。
刚开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象，后来发现在其他许多植物中，甚至在真菌中也有类似的现象。
2001年，Tuschl通过siRNA（small interfering RNA ）在哺乳动物细胞中成功地诱导了RNAi ，没有引起翻译抑制和细胞凋亡。
他们通过转染连续表达RNAi 的载体进入哺乳动物细胞，这些载体被设计成能够表达小发夹RNAi（short hairpin RNAs,shRNA）的载体。
通过表达，shRNA形成3'端带有UU的发夹状结构。
随后shRNA的末端被加工使shRNA形成类似于21nt大小的siRNA分子。
这个类似于siRNA的分子在转染的哺乳动物细胞内就能够引起RNAi 。
他们通过PCR技术合成发夹结构的siRNA,(1)构建与目的基因互补的单链RNA，然后并在同一条链上构建与单链RNA互补的碱基序列，中间用一些尿嘧啶核苷酸（U）将他们隔开。
(2)将这个构建好的单链RNA进行退火，互补区域会相互吸引形成发夹结构的siRNA。
1995年康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues尝试用反义RNA去阻断par1基因的表达以探讨该基因的功能，结果反义RNA的确能够阻断par1基因的表达，但是，注入作为对照的正义链RNA，也同样阻断了基因的表达。
3年后，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello将双链dsRNG—正义链和反义链的混合物注入线虫，结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。
RNA干扰技术
RNAi的分子作用机制
1、siRNA引起的基因沉默
miRNA诱导的基因沉默
miRNA是一种广泛存在于真核生物中内源性的、高度保守 的、非编码小的RNA。 miRNA主要是通过抑制翻译来实现基因的沉默，成熟的双 链miRNA会很快被整合到miRNA介导的沉默复合体（miRISC） 中。 成熟miRNA结合到与其序列互补的mRNA位点，通过2种依 赖于序列互补机制负性调控靶基因的表达。如果miRNA与靶 位点序列完全互补，miRNA的结合会引起mRNA的降解；如 果miRNA与mRNA不完全互补，则能抑制mRNA的翻译过程。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第三步（倍增阶段）在 RISC 复合物中，以 siRNA 的单链 为引物，以 mRNA 为模板，在 RNA 指导的 RNA 聚合酶作 用下，合成 mRNA 的互补链，即形成 dsRNA 。 dsRNA 再 被Dicer酶裂解成新的siRNA（次级siRNA）。 因此，细胞内的siRNA数量大大增加，显著增强了对基因 表达的抑制作用。 siRNA 也可转运出细胞，使 RNAi 扩散 到整个机体。
获得siRNA产物方法
目前主要有5种方法用于siRNA的制备
(1)化学合成法;(2)体外转录法;
(3)长链dsRNA的RNaseIll体外消化法;
(4)siRNA表达载体法；(5)siRNA表达框架法。
前3种是在体外制备然后导入到细胞中；后两种则
是基于具有合适启动子的载体或转录元件在哺乳动
物或细胞中转录生成siRNA。
RNA干扰技术
张风娇
简介
RNA干扰（RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双
链RNA（dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解，
RNA干扰综述
RNAi研究及其进展公光业M110107259前言RNAi是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA 启动的序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。
1998年，Andrew Fire等首次在线虫中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中。
由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力。
RNAi被《Science》杂志评为2010年十大科学成就之一，2002年又名列《Science》杂志十大科学成就之首，成为分子生物学研究的热点。
本文综述了该研究的最新进展。
正文RNAi的发现：上世纪90年代，科学家们在进行生物遗传改良的研究中，发现靶生物体内产生了一种非期望的表型。
最早报道的是在1990年美国科学家Jorgensen等,他们在增强矮牵牛花紫色的转基因研究中，得到的结果是转基因植株部分或完全开白花，表明色素合成途径被关闭而不是被加强。
他们将这一现象称为共抑制(cosuppresion)，后来的研究者称之为转录后基因沉默。
此后不久，科学家们开展了真菌中的RNAi 的研究。
1994年，意大利的Cogoni在野生型粗糙链抱霉(Neurospora crassa)的转基因研究中，把抑自身和相应内源基因表达的基因沉默现象称为消除作用(quelling或基因压制)。
1995年，Guo等利用反义RNA技术阻断线虫的par-1基因表达，发现无论是给线虫注射正义RN A还是反义RN A，都可以抑制特异基因（par-1）的表达，结果与反义RNA技术的传统机制正好相反。
这种出乎意料的发现引起了各国科学家的注意，从此展开了RNAi在动物体内的研究。
1998年，Frei在研究秀丽隐杆线虫基因沉默时，首次揭开了Guo遇到的悬疑：Guo遇到的正义RNA抑制基因表达现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起的，并且还发现双链RNA能够比反义RN A或正义RNA更有效地关闭基因的表达，抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级，他们称这种现象为RNAi。
rnai 原理
rnai 原理RNAi，全称RNA干扰（RNA interference），是一种特殊的基因调控机制。
它可以通过RNA分子的有选择降解和基因表达抑制来控制基因的表达。
其发现者安德鲁·泽尔和克雷格·门特奖于2006年因该发现获得诺贝尔生理学或医学奖。
RNA干扰的过程可以分为以下几个步骤：第一步，发生在细胞核内。
基因的信息以DNA分子的形式保存在核内。
生物体想要制造蛋白质，需要先将所需信息转录成RNA分子，才能进行翻译成蛋白质。
RNA干扰的起点就是在这个转录环节。
特定的RNA片段会被刚转录出来的RNA识别并结合，形成双链RNA结构。
第二步，双链RNA结构在细胞细胞质中被分解成21-23个核苷酸长度的siRNA，即小干扰RNA。
这个过程由另一种RNA分子——核酸酶III（dicer）负责。
dicer把长长的双链RNA分开后，选择其中一个链作为siRNA，并将另一条链进行降解。
siRNA会带着他的伙伴RNAi识别同样的靶标。
第三步，siRNA结合到一种称作RISC（RNA诱导的沉默复合物）的大分子复合物中。
RISC可以定位并结合到mRNA上。
mRNA可被认为是DNA的镜像，它们存在于细胞质内，包括了某一个基因的所有表达信息。
RISC准确定位到目标mRNA，siRNA导致RISC裁剪mRNA上的一个区域，不允许mRNA继续转录成蛋白质，这样该基因的表达就被抑制了。
RNA干扰机制已经被广泛应用于基因功能研究和治疗疾病。
在实验上，科学家可以靶向性抑制某一基因并观察细胞或生物体的表现变化，从而了解这个基因在细胞生理中的作用。
而在治疗方面，RNA干扰可以用于抑制病毒或针对某些遗传疾病的基因，从而达到治疗的作用。
总的来说，RNA干扰的原理是通过特定的RNA分子进行基因表达的控制。
其基本机制包括：形成双链RNA结构、siRNA生成、siRNA结合到RISC、RISC裁剪mRNA。
这一机制已被广泛应用于基因功能研究和治疗疾病。
RNAs 小RNA的全面介绍
第二步（效应阶段）是siRNA 第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP 参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其 参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其 中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体 中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体 (RNA(RNA-induced silencing complex， complex， RISC) RISC)。 RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸 RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸 内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。活化 的RISC在单链siRNA引导下识别互补的 RISC在单链siRNA引导下识别互补的 mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从 mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从 siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶 siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶 mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降 mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降 解，从而干扰基因表达。
Fire等发现将ds RNA注入秀丽线虫可显 Fire等发现将ds RNA注入秀丽线虫可显 著抑制特定基因的表达，并证明了Guo和 著抑制特定基因的表达，并证明了Guo和 kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用 kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用 其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。 其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。 将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA 将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA 无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也 无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也 很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫，却能 很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫，却能 高效、特异地阻断相应基因的表达。实验证明 双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后的反 双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后的反 义RNA至少高几个数量 ，他们称此现象为ds RNA至少高几个数量 ，他们称此现象为ds RNA介导的RNA干扰（RNAi）。图示 RNA介导的RNA干扰（RNAi）。图示
RNA干扰技术的原理及应用
RNA干扰技术的原理与应用RNA干扰( RNAinterference , RNAi )是通过小干扰RNA ( small interference RNA, siRNA ) 造成目的mRNA特异性降解, 从而使基因转录后沉默的一种现象。
这一现象广泛存在于自然界, 是生物体进化过程中抵御外来基因侵害的一种机制, 为稳定基因组发挥了重要作用。
由于RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因剔除的遗传工具,正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命, 并将加快这个领域的研究步伐。
1 RNAi现象的发现及发展1995年, Guo等用反义RNA阻断秀丽新小杆线虫的part 1基因的实验中发现, 正义和反义RNA都阻断了该基因的表达,这与传统上对反义RNA技术的解释相反。
1998年2月卡耐基研究院的F i re 等将双链RNA ( double stranded RNA, ds RNA)转入细胞内,发现靶基因的mRNA发生了降解,证实高度纯化的ds RNA 可以高效特异的阻断相应的基因表达,而且效率比单链RNA至少高2个数量级,首次揭示了Guo等遇到的现象,即为RNAi。
随后研究发现, RNAi现象广泛存在于各种生物中,是一种古老的重要保护机制, RNAi技术作为一种重要的研究手段大大加速了基因组学的研究进程,现已成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。
在短短几年中,对RNAi的研究取得了突飞猛进的发展, 许多令人振奋的报道相继出现, 2001年首次报道了在哺乳动物细胞培养中成功应用RNAi技术抑制基因表达, 开创了RNAi技术应用于高等生物基因功能研究的先河; 2002年, K ay研究小组首次报道了应用RNAi 技术在哺乳动物整体水平进行基因表达沉默的实验研究;2004年哺乳动物全基因组范围RNAi研究也取得了重要进展,先后报道了用酶法构建全基因组siRNA文库新技术和应用基因组siRNA文库,从全基因组水平对高等动物基因功能进行高通量RNAi研究。
RNAi
RNAi的研究进展RNA干扰(RNA interference ,RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。
将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA ,dsRNA) 导入细胞后,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制( posttranscriptional gene siliencing , PTGS) 范畴。
RNAi 广泛存在于生物界,从低等原核生物,到植物,真菌,无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象,只是机制也更为复杂。
一．RNAi的发现早在1990 年进行转基因植物有关研究时偶然发现,将全长或部分基因导入植物细胞后某些内源性基因不能表达,但这些基因的转录并无任何影响,并将这种现象称为基因转录后沉默(posttranscriptional gene silencing ,PTGS) . 1996 年在脉孢菌属(Neurospora) 中发现了相似现象,只不过将这种现象命名为基因表达的阻抑作用(quelling) . 首次发现dsRNA 能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditis elegans的研究。
1995年康乃尔大学的研究人员Guo 和Kemphues 尝试用反义RNA 去阻断par－1 基因的表达以探讨该基因的功能,结果反义RNA 的确能够阻断par21基因的表达,但是奇怪的是,注入正义链RNA 作为对照,也同样阻断了基因的表达。
这个奇怪的现象直到3年后才被解开——华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire 和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello 首次将双链dsRNA ——正义链和反义链的混合物注入线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。
实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA 已经足够完全阻断同源基因的表达。
RNAi技术的原理及应用
RNAi技术的原理及应用原理RNAi（RNA interference）技术是一种通过靶向RNA的降解来抑制基因表达的方法。
这种技术基于细胞内的一个自然免疫系统，该系统可以识别和降解异质RNA分子。
RNAi技术可以用于研究基因功能，发现新的药物靶标，并为基因治疗提供了一种有力工具。
RNAi技术的原理可以概括为以下几个步骤：1.siRNA合成：RNAi技术使用小干扰RNA（siRNA）来诱导RNA降解，siRNA在细胞内的一种酶切后生成双链RNA。
2.RISC复合物的形成：双链RNA结合到RNA诱导沉默复合物（RISC）蛋白上，形成siRNA-RISC复合物。
3.靶向RNA的降解：siRNA-RISC复合物通过辨识靶向RNA的互补序列，导致靶向RNA的降解。
应用RNAi技术在许多领域都有广泛的应用。
下面列举了一些主要的应用领域：功能基因组学研究RNAi技术为功能基因组学研究提供了一种有效的方法。
通过利用RNAi技术沉默特定基因的表达，研究人员可以了解该基因对细胞功能和生物过程的影响。
这种方法可以帮助我们理解基因调控网络以及各个基因在细胞和生物体中的作用。
药物研发RNAi技术为药物研发提供了新的途径。
通过使用siRNA来沉默特定基因的表达，研究人员可以发现新的药物靶标，并研发相应的药物。
这种方法具有高度的特异性和选择性，可以减少非特异性的药物作用，提高疗效。
基因治疗RNAi技术在基因治疗中也有潜在的应用。
通过利用siRNA来抑制异常基因的表达，可以治疗某些遗传疾病。
例如，通过沉默表达异常的突变基因，可以减少与遗传性疾病相关的症状，并提高患者的生活质量。
农业改良RNAi技术在农业领域也有重要应用。
通过利用RNAi技术来靶向沉默特定害虫的基因，可以开发出新型的农药和抗虫作物。
这种方法可以减少农药的使用，降低对环境的污染，提高农作物的产量和质量。
病毒治疗RNAi技术还可以被应用于病毒治疗。
通过利用siRNA来沉默病毒基因的表达，可以抑制病毒的复制和传播。
RNAi
RNA 干扰 （RNA interference，RNAi）
RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA (dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现 象。 它是真核生物中存在的一种抗病毒入 侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控 机制，具有重大生物学意义。
RNAi的发现简史
90年代初，Rich Jorgensen 设想，将 更多的色素基因注入植物体，能使花朵的 色彩更艳丽，而结果出其预料，转基因的 植株不仅没有新基因表达，反而使原有的 色素基因也受到了抑制，当时称共抑制 （cosuppression)。 94年Cogoni等证明真菌中亦有类似现 象，此称为基因压制 (quelling)。
质粒载体表达合成siRNA的方法
第一种是设计可自然形成发夹的RNA （~22nt）: 两种RNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）启动子（U6 或H1）控制一段反向重复序列（中间被可变间隔 序列分开）转录，结果可在胞内合成具有发夹结 构的双链RNA（含19~29nt的茎和3~9nt的环）， 其中19~29nt的茎与靶基因序列互补。另外，此 发夹RNA的3’末端含有4个或4个以下的尿嘧啶。 实验证实， 3’末端为UU的RNA较AA、CC或GG 为末端的RNA更能有效地诱导基因沉默。
RNAi降解mRNA的过程
外源dsRNA dsRNA
核酸酶
21-23nt dsRNA-核酸酶 RISC
mRNA
链互换 正义RNA
反义RNA-mRNA-核酸酶 mRNA降解 RNAi 或 PTGS
RNAi 的特点
转录后水平的基因沉默 较高特异性：能够非常特异地降解与之序 列相应的单个内源基因的mRNA。 高效性：相对少量的dsRNA就可以使相应 的基因表达受抑制。 可遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的 效应可以突破细胞的界限，可传递给子一 代。
RNA干扰原理与技术
!!! ds mixture causes potent and specific interference !!!! !!! ds RNA substancially more effective than antisence !!! !!! effect were evident in both the injected animals and their progeny !!!
扩增dsRNA或siRNA
在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于 PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增。但是目前认为 这个现象并不存在于哺乳动物细胞中。
RNAi的发生机制
2 Nucleotides 3’ overhang
21-25 nt
DICER
- RNAse III, ds spec. endonuclease - Dimer, 2 catal. domains, helicase and PAZ motif - produce 2-3nt 3´overhangs - ATP-dependent ribonuclease
•这个方法的不足是实 验的规模受到限制。
•体外转录得到的 siRNAs只要较低的浓 度就可以达到化学合 成siRNAs较高浓度的 效果（如右图：0.5-20 nM vs. 50-100 nM per transfection）
HeLa cells
RNase III降解
dsRNA Digestion of long dsRNA by an RNase III family enzyme
RNA干扰与基因沉默的分子机制
RNA干扰与基因沉默的分子机制RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由具有特定序列的双链RNA分子介导的基因沉默机制。
它在生物体内起着重要的调控基因表达的作用。
本文将探讨RNA干扰的分子机制，以及它与基因沉默之间的关系。
一、RNA干扰的发现和原理RNA干扰最早是由安德鲁·法耶和克雷格·米洛在1990年代中期发现的。
他们发现在尼蔺的体内注射双链RNA后，对于相应基因的表达发生了沉默。
这一发现揭示了RNA干扰的存在，并引起了全球科学界的广泛兴趣与研究。
RNA干扰的基本原理是通过特定的酶将双链RNA分子剪切成短小的小分子RNA（small RNA，sRNA），然后将其与RNA识别蛋白复合体形成RNA诱导沉默复合体（RISC）。
RISC能够识别并与相应的mRNA结合，进而导致靶基因的沉默。
二、RNA干扰的类型根据RNA干扰发生的位置和机制的不同，可以将其分为两种主要类型：小干扰RNA介导的RNA干扰（small interfering RNA-mediated RNA interference，siRNA-mediated RNAi）和微小RNA介导的RNA干扰（microRNA-mediated RNA interference，miRNA-mediated RNAi）。
1. siRNA介导的RNA干扰siRNA是由外源双链RNA（如病毒RNA）或内源非编码RNA（如LTR、剪接RNA等）在细胞内经过特定酶的作用而生成的。
siRNA的一条链被剪切成21-23个核苷酸的小片段，形成活性RNA双链（active RNA duplex）。
这个双链RNA具有与靶基因mRNA互补的序列，能够与之杂交并引起基因表达的沉默。
2. miRNA介导的RNA干扰miRNA是一类内源的、长度约为21-24个核苷酸的非编码RNA，它们通过与RISC复合体结合，调节细胞内多种基因的表达。
RNAi的发现之旅及定义
RNAi技术1. RNAi定义RNA干扰（RNA interference，RNAi）[1]是由双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程。
dsRNA可以抑制不同类型细胞的靶向基因表达，用特异性的抗体几乎检测不到靶向基因所表达的蛋白质。
因此，RNAi 技术又被形象地称为基因敲除（knock out）或基因沉默（gene silencing）。
RNAi是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing，PTGS）。
RNAi现象广泛存在于生物界中。
它在真菌中被称为quelling，在拟南芥、烟草等植物中被称为PTGS或共抑制（cosuppression），在无脊椎动物如果蝇、水螅、线虫以及脊椎动物斑马鱼、小鼠等动物界中被称为RNAi。
PTGS可能是生物界，包括植物和动物等普遍存在的一种古老、保守而又极其重要的遗传行为。
RNA 干涉是生物基因组抵抗转座子或病毒之类的外来遗传元件入侵的一种保护性机制，具有以下4 个重要特征：①RNAi 属于转录后水平的基因沉默(PTGS) 机制，迄今为止的研究认为RNAi 对染色体DNA 序列的复制和转录过程不产生任何影响；②具有高度的序列特异性，最近将人工合成的siRNAs （短小RNA，是RNi 过程中直接起作用的分子）转入宿主细胞的实验表明，即使siRNAs 中只有一个碱基与靶序列错配，也会使干涉效应大大减弱；③具有抑制基因表达的高效性, 可以引起该基因缺失突变的表型；而且远远少于内源mRNA 数量的dsRNA 就可以实现完全的抑制效应, 即其发生过程中存在着正反馈的信号放大效应；④RNAi 的效应可以在不同细胞间长距离传递和维持，而且在某些生物中(比如线虫) 具有遗传性。
2. RNAi的发现与探索1995年康乃尔大学的Guo[2]博士在实验中想通过反义RNA阻断美丽线虫(C.elegans)的par-1基因表达，同时她还用正义RNA做了一个对照，试图观察到对照试验组基因表达增强的现象，但结果却发现了反义和正义RNA都阻断了该基因的表达。
RNA干扰技术的原理与发展历程
RNA干扰技术的原理与发展历程RNA干扰技术是一种现代的生物技术方法，可以用于破坏基因表达，从而实现抑制疾病基因的功能。
在临床治疗和基础研究中有广泛的应用，其原理和发展历程备受关注。
RNA干扰技术的基本原理RNA干扰技术的基本原理是利用 RNA 导致对相应的靶标基因的抑制。
在细胞内，RNA份为 mRNA和小 RNA，其中 miRNA、siRNA和 piRNA等小 RNA 的作用是调节基因表达和基因转录。
RNA干扰技术的目标是通过寻找相互作用的小 RNA和靶标mRNA来破坏这些 mRNA，从而实现对靶标基因的抑制。
RNA 干扰技术的发展历程RNA干扰技术的发展历程可以分为以下四个主要阶段：1. 第一阶段: 发现RNA干扰技术2006年，两位美国科学家安德鲁 Fire 和克雷格 Mello 发现了RNA 干扰技术，他们因该发现获得了2006年诺贝尔医学奖。
在数年的研究中，科学家们通过分离不同的分子和病毒来阐明 RNA干扰的机制和效应，同时也阐明它如何对人类和其他生物产生重要的影响。
2. 第二阶段: 研制 siRNA在RNA干扰技术的第二阶段中，科学家们研发出了一种新型的 RNA 分子——siRNA。
siRNA是一种短且特定的 RNA 分子，只有浓缩在一个特定区域的多核苷酸才能与特定的 mRNAs 相互配对，从而使它们被破缺并失效。
siRNA被普遍地用于基础研究和药物治疗，如肝癌等疾病的治疗。
3. 第三阶段: 应用 RNAi 技术治疗疾病RNA 干扰技术在 2004 年被应用于人类的第一次试验，试图以RNA 干扰技术治疗痴呆症状。
此后，RNA 干扰技术逐渐应用于许多领域，包括遗传病、感染病和癌症等的治疗。
目前， RNA 干扰技术的已经得到了广泛的应用，有许多企业、研究机构投入到RNA 干扰技术的研究和开发中，以期达到更好的治疗效果。
4. 第四阶段: 结合其他技术的RNA干扰技术的开发虽然 RNA 干扰技术本身已经可以实现高效的基因治疗，但是结合其他现代技术可以更好地发挥 RNA 干扰的疗效。
RNAi技术在药物靶点发现中的应用
RNAi技术在药物靶点发现中的应用RNAi技术是近年来发展起来的一种重要的基因沉默技术，它可以对基因进行靶向沉默，从而达到控制细胞生理过程的目的。
这种技术已经广泛应用于药物研发中，尤其在药物靶点发现方面具有重要的作用。
本文主要介绍RNAi技术在药物靶点发现中的应用。
一、RNAi技术的基本原理RNAi技术是一种利用RNA干扰分子将靶向RNA特异性地沉默的方法。
RNAi 的过程分为三个步骤：siRNA的合成、siRNA复合物的形成、siRNA复合物介导的mRNA的降解。
siRNA是20-25个核苷酸的双链小RNA，能够与靶向mRNA中的特定序列相互作用，从而引起mRNA的降解。
这个过程能够阻断特定基因的表达，从而控制细胞功能。
二、1.发现新靶点RNAi技术能够有效地从成千上万的基因中筛选出与特定疾病有关的靶点，并在其中挑选出最具有潜力的靶点。
RNAi技术可以通过选择与疾病相关的信号通路来发现新靶点。
2.靶点确认RNAi技术可以用于确认已知靶点的作用。
将特定的siRNA引入细胞内，可以靶向性地沉默该基因，在观察细胞的反应后，可以确认该基因的作用。
3.靶点评估RNAi技术也可以用来评估靶点的价值和有用性。
通过沉默靶点基因并观察其影响，可以确定该靶点是否值得进一步研究，并为后续研究提供重要的信息。
4.药物筛选RNAi技术可以胜任药物筛选研究。
将siRNA与药物共同引入细胞内，可以直接观察作用的变化。
这种方法可以很大程度上减少因化合物文献研究所导致的时间和人力浪费。
三、RNAi技术在药物研发中的优势RNAi技术在药物研发中的优势主要体现在以下方面：1.高效性：RNAi技术可以准确地靶向基因，从而最大程度地降低了可能产生的副作用，使得药物研究更加精确和高效。
2.低成本：RNAi技术具有成本低廉的优势，可以更加高效地完成药物研发过程。
3.广泛的可适用范围：RNAi技术适用于很多不同类型的细胞和生物体系中，能够提供全方位的药物研发服务。
rnai原理
rnai原理RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种生物学现象和分子生物学技术，它通过抑制目标基因的表达来调节细胞内的基因功能。
RNAi的原理基于细胞内产生的小分子RNA分子，称为干扰RNA（interfering RNA，简称siRNA）。
这些siRNA与靶标基因的mRNA特异性结合，并引起靶标mRNA的降解或抑制翻译，从而抑制目标基因的表达。
这是一种高度特异和高效的基因调控机制。
RNAi机制的发现源于对真核生物线虫（Caenorhabditis elegans）基因表达进行研究时的意外发现。
在此之后，研究者们发现RNAi存在于各种生物中，包括植物、动物和微生物。
人们通过合成和导入siRNA分子来利用RNAi技术在研究中进行基因沉默。
这种技术已经被广泛应用于病原体基因的功能研究、基因治疗和农业生物技术等领域。
RNAi的操作步骤包括合成或克隆siRNA分子、导入siRNA到目标细胞中、选择合适的细胞系或动物模型进行实验，以及检测目标基因的表达水平。
合成siRNA时需要设计合适的引物，以确保siRNA能够特异性地靶向目标基因。
RNAi技术的应用非常广泛。
在基础生物学研究中，它被用于研究基因功能、基因调控网络以及疾病的发生机制。
在药物研发中，RNAi可以通过抑制特定基因来治疗一些遗传性疾病和癌症。
此外，RNAi技术还被应用于农业生物技术中，用于改良作物品种、抗病虫害以及提高产量。
总的来说，RNA干扰是一种通过干扰目标基因的表达来调控生物体内基因功能的重要机制。
它的发现和应用为我们深入了解基因调控和开发新的疗法提供了强有力的工具。
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RNAi：A Phasing-Out Technology?
• 显著的脱靶效应和不可预测的 抑制效率
• 其他技术的的出现
RNAi, TALEN, 和CRISPR三者之间的比较
参考文献：Boettcher M , Mcmanus M . Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):575-585.
Dicer的作用发现
2001年，Ketting等人通过测试
胚胎提取物Dicer的活性，并利用免疫 沉淀、缺失突变体分离、基因转移、 Seam细胞分析、RNAi检验等方法解 释了Dicer在秀丽隐杆线虫RNA干扰 和小RNA合成中的作用。
Dicer可能参与两个不同的过程，这两个过程都需 要将dsRNA加工成小RNA，其中一条途径(ds-RNA 诱导)通过RISC复合物和RNAi导致RNA降解。第二 种途径(依赖于let-7)通过内源性的、短暂的小RNA 及其mRNA靶点之间的相互作用导致翻译的抑制。
“后人改良”：当他们将T4和T7 RNA聚合酶体外转录
制备的单链RNA电泳纯化后再注射于线虫，结果发现只有微弱 的基因抑制作用。而将纯化后的dsRNA 一正义链和反义链的 混合物注入线虫，发现dsRNA能够高效特 异的阻断相应基因 的表达，而且抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量 级。该小组将这一现象称为“RNA interference-RNA干扰” 。首次揭开了Guo和Kemphues的谜底。
pSUPER载体是否可以介导基因表达 的稳定抑制？
MCF-7 细 胞 与 含 有 puromycin 抗 性 的 载 体 pSUPER 或 pSUPER-p53 共 转 染 ， 结 果 表 明 ， pSUPER 介 导 的 基 因 敲 除 持 续 时 间 较 长 ， 它 的 转录产物对细胞没有毒性。
细胞的比例。直接注射gfp的dsRNA可显著降低荧光细胞 的比例。他们还发现在低剂量的dsRNA作用下，当动物 孵化时，胚胎来源的肌肉细胞经常受到干扰。这些分化细 胞的干扰效应在幼虫生长过程中始终存在：随着受影响动 物的生长，这些细胞很少或没有产生额外的GFP。
siRNA的发现
2000年，Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研
线虫的par-1基因时，本想利用反义RNA技术特异性阻断该基因的表达，同时
在对照实验中给线虫注射正义RNA以观察到基因表达的增强，但得到的结果
却是二者都同样被切断了par-1基因的表达途径，这与传统上对反义RNA技术
的解释正好相反。该研究小组一直未能对这一意外现象给出合理解释。
1998年，法尔等人在考虑已知细胞对
究时发现，在孵育的裂解液中，501bp的Rr-dsRNA和505bp的Pp-dsRNA 的放射性大约有15％出现在21-23nt的RNA片段中，并且没有检测到其他稳 定产物。从右图的条带2、3和9、10可以看出，有无mRNA并不会影响到 21-23ntRNA的产生。
为了进一步了解RNAi的机制，Zamore绘制了三个 dsRNA的几个mRNA切割位点的位置，从左图可以发现 ，分裂的间隔大部分在21-23nt之间，9nt的产生是因为 dsRNA的解离能力不够。它们将孵育产生的21-23nt替 代dsRNA添加到新的RNAi反应中,也能在体外产生序列 特异性干扰。
RNAi相较于CRISPR技术的优势
• RNAi的执行更为迅速，节省了的时间和金钱。RNAi不需要在实际的基因 敲除实验之前将额外的基因引入细胞，因为大多数细胞都带有完整的 RNAi沉默机制。
• RNAi对TSSs没有特异性。因此，RNAi可以用于转录组但没有基因组测 序数据的物种。
• RNAi针对的是细胞质中的RNA转录本，而不是细胞核中的基因组DNA， 不受染色质状态的影响。
选择正确的工具: RNAi, TALEN, or CRISPR
参考文献：Boettcher M , Mcmanus M . Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):575-585.
RNA干扰的发现过程
指导教师：牛雪梅老师 第三小组成员：刘亚君、吕锐利、任苗、史瑞、宋心玥、宋志强、孙文豪
2019-11-25
野生型
试验
预期
1990年，美国和荷兰的两个转基因植物实验组Rich Jorgensen
和同事为了让花朵颜色更鲜艳，给矮牵牛花（petunias）注入了一种能
形成红色素的基因，但结果却使矮牵牛花完全褪色！也就是说转基因的 植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因受到抑制。因此他将 这种现象命名为“Cosuppression-协同抑制”。
fem-1编码两性生殖所需的含锚蛋白重复序列的蛋白质；hlh-1编码正确体形和运动所需的
肌球蛋白。分别注射与这些基因相关的dsRNA到线虫体内，在子代中关基因的dsRNA注射 到线虫后的显著表型表明，干扰 效应在高比例的细胞中发生。为 了在细胞水平上检测dsRNA的干 扰效应，他们用大肠杆菌 PD4251菌株评估一个在肌肉中 表达两种不同绿色荧光蛋白（ GFP）的转基因系gfp和lacZ活 性的干扰，PD4251菌株是一个 稳定的转基因菌株，这种菌株在 全身肌肉中产生GFP。将gfp和 lacZ的dsRNA分别注射到大肠杆 菌的幼虫期和成虫期，观察荧光
图3
RNAi作用机制
起始：核酸酶Dicer首先识别dsRNA或发卡 RNA（hairpin-RNA）将其切割成 21~23 nt 的siRNA。 组装：随后siRNA与无活性的RNA诱导沉默复 合物（RNA induced silencing complex， RISC）结合，在解螺旋酶的作用下siRNA双链 解开为单链。 效应：由于siRNA与mRNA具有高度同源性， 其反义链通过与靶基因mRNA进行特异性结合 使 RISC活化，最后RISC中的酶将靶基因 mRNA剪断，从而实现基因表达沉默。
图2 为了进一步测试载体系统，他们又设计了合成 siRNA和pSUPER与CDC20转录体中19nt序列相 同的载体。对于CDH1，无论是人工合成的siRNA 还是人工合成的RNA都能有效抑制内源性CDC20 表达（如图2）。
pSUPER载体对基因表达的抑制是 否足够影响细胞生理机能？
他们设计了一个结构来抑制p53（一种电离 辐射后稳定的转录因子），结果表明其设计 的载体可以抑制内源性p53的表达，使其完全 丧失其在DNA损伤反应中的功能（图1D)。
dsRNA的反应时，出现了一个特异性问题：有
些生物体存在一种对dsRNA依赖的蛋白激酶，
它能激活干扰反应机制。因此他们猜想反义协
同作用可能反映了一种非特异性的反义作用潜
能 。 他 们 联 合 注 射 与 unc-22 无 关 的 dsRNA 片
段，并没有增强单个unc-22-RNA链介导抑制
的能力，之后使用另外三个表型特征良好的基 因 评 估 dsRNA 效 应 的 靶 向 特 异 性 ， unc-54 编 码全肌收缩所需的肌球蛋白的体壁肌重链亚型；
• Kemphues没能对郭苏意外发现的重要性有足够的认识，因为这不属于他的实验室研究的主攻方向--线虫的胚胎发育。
“前人栽树” ：1998年，华盛顿卡耐基研究院的Fire
和麻省大学医学院的Mello首次在秀丽新小杆线虫中证明Su Guo所发现的现象属于转录后水平的基因沉默。他们发现Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象以及过去的反义 RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污 染了微量双链RNA而引起的。
Figure 1 Genes used to study RNA-mediated genetic interference in C. elegans. Intron–exon structure for genes used to test RNA-mediated inhibition are shown (grey and filled boxes, exons; open boxes, introns; patterned and striped boxes, 59and39untranslatedregions.unc-22.ref.9,unc-54,ref.12,fem-1,ref.14,andhlh-1.
1994年，Carlo Cogoni等人把合成合成类胡萝卜素的基因
albino一1或albino一3 转入 野生型粗脉胞酶(Neurosporaerassa)发现 大约30％转染细胞内源性albino一1或albino一3基因的表达水平反而大
为减弱，当时称这种现象为“quelling-压制”。
1995年，康奈尔大学的Su Guo和Ken Kemphues在试图阻断秀丽隐杆
2002年，Brummelkamp
等人首次使用小鼠H1启动子构 建了小发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表达载 体pSUPER，并证实转染该载体 可以有效地、特异性地消除哺乳 动物细胞内目的基因的表达，为 利用RNAi技术进行基因治疗研 究奠定了基础。
图1 用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表达载体pSUPER（如图1A)，最终的转 录体预计会折叠成一个19bp的茎环结构。用pSUPER载体 来抑制内源性CDH1基因，检验了pSUPER载体是否产生 siRNA，然后检验了pSUPER系统的特异性。
Ken Kemphues为何没能分享诺贝尔奖的荣誉？
• 医学奖委员会主席---Karolinska学院教授Bertil Daneholt写的“Advanced Information”中提到， Ken Kemphues（其铺垫性工作是复旦留美学生郭苏做的）未能分享诺贝尔奖荣誉的原因主要在于 “remarkably sense RNA（24）could also silence genes, but the results were inconsistent and the effects usually modest”.