发酵过程控制 容氧pH

五、发酵过程中，影响耗氧的因素
培养基成分和补料
菌龄影响耗氧
发酵过程中，排出有毒代谢产物如二氧化碳、挥发性的
有机酸和过量的氨，也有利于提高菌体的摄氧量。
（一）供氧方面
气膜
空气中的氧→液体中的溶氧
过程中需经过各种阻力：气膜阻力
液膜
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气 相 气液界面阻力 主 流
ci pi c
液膜阻力（控制因素）
2）生产阶段
在生产阶段，pH趋于稳定，维持在最适 产物合成的范围。
3）自溶阶段 菌丝自溶阶段，随着基质的耗尽，菌体蛋白酶的活 跃，培养液中氨基氮增加，致使pH上升，此时菌 丝趋于自溶而代谢活动终止。
2、引起发酵液中pH变化的因素 发酵过程中pH的变化取决于微生物的种类、培养基的组 成和发酵条件。 在菌体代谢过程中，菌体本身有建成其生长最适pH的能 力，但外界条件发生较大变化时，pH将会不断波动。
（2）引起pH上升的因素：
（凡是导致碱性物质生成或释放及酸性物质消耗 的发酵，其pH都会下降） ①培养基中碳氮比例不当，氮源过多，氨基氮释放，使 pH上升。 ②生理碱性物质存在 ③中间补料中氨水或尿素等碱性物质的加入过多使pH上升。
三、最适pH的选择
1、微生物生长和产物合成的最适pH
微生物的生长pH值范围极广，从pH<2~>8都有微生物能生长。 但是绝大多数种类都生活在pH5.0~9.0之间。 微生物生长的pH值三基点： 各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低 于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或 导致死亡。 不同的微生物最适生长的pH值不同，根据微生物生长 的最适pH值，将微生物分为：
微生物的“耗氧” 可用耗氧速率或呼吸强度来表示：

耗氧速率（oxygen uptake rate)：指单位体积的培养液在单位时
间的耗氧量。单位为 mmolO2/(L· h)，用r表示

呼吸强度（respiratory strength)：单位质量的细胞干重在单位时 间的耗氧量。单位为 mmol O2/(g · 干细胞 · h) ，用Ｑo2表示
采用H2O2 供氧存在的问题：
H2O2 对细胞有害， H2O2本身在一定浓度对细胞有损害作用，更
多的是由于H2O2在过氧化氢酶的催化作用下，可以分解形成一些自
由基、超氧阴离子，羟基自由基、原子氧等，它们会阻碍DNA、 RNA和蛋白质的生物合成。
解决方法：可通过优化H2O2的流加浓度、选择流加方式等手段
2、空气的流速
KLa 随空气速度的增加而增大，但空气速度过大，则可使叶轮 发生过载， 即叶轮不能分散空气，气体不经分散而沿搅拌器缓慢运动的中心迅速上升而 逸出。
（二）影响KL a的因素
3、培养液的物理性质
发酵液的表面张力、粘度、离子浓度等都会影响气体的溶解度，还影响液体
的湍动以及界面和液膜的阻力，因而影响传递效率。 发酵液中菌丝浓度增大，表观粘度增大，通气效率下降。
●
二、发酵过程中pH的变化及影响pH变化的因素 1、发酵过程中pH的变化
1）生长阶段 pH有上升或下降趋势（相对于接种后起始pH而言） 如：利福霉素B发酵起始pH为中性，但生长初期由于菌 体产生的蛋白酶水解蛋白胨而生成铵离子，使pH上升至 碱性；接着，随着铵离子的利用及葡萄糖利用过程中产 生的有机酸使pH下降到酸性范围。
嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌 耐碱微生物：许多链霉菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 嗜酸微生物：硫杆菌属 耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌
一些微生物生长的pH值范围
微生物种类 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 黑曲霉 一般放线菌 一般酵母菌 最低pH 4.3 4.5 4.2 1.5 5.0 3.0 最适pH 6.0—8.0 6.0—7.5 7.0—7.5 5.0—6.0 7.0—8.0 5.0—6.0 最高pH 9.5 8.5 9.3 9.0 10 8.0
发酵过程中添加糖、花生饼粉等营养物质、前体或无菌水、消泡剂等均可改
变培养液的理化性质。
4、 空气分布器和发酵液高度对通气效率的影响
发酵罐中装有多孔分布器和单孔分布器，在气流速度很低时，多孔分布器有 较高的通气效率。但两者的区别随着气流速度的增加而逐渐减少。 可能是低气流时多孔分布器可形成更大的传递面积，而当通气量增大时，单 孔分布器能更大的增加发酵液的湍动程度。
液体中的微生物只能利用溶解氧，气液界面处的微生物还能利用气相中的氧。
强化气液界面也将有利于供氧。
通风发酵中，微生物利用空气中的氧可分为两 个过程：
空气中的氧溶解在液体中—— “供氧” 微生物利用液体中的溶解氧进行呼吸代谢活 动—— “耗氧” “供氧”与 “耗氧”整个过程要达到平衡。
二 、 微生物的“耗氧”
4）pH不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产 物的质量和比例发生改变。
●如：酵母菌在pH4.5-5产乙醇，在
pH6.5以上产甘油、酸。
如： Aspergillus niger黑曲霉在pH2-3时，发酵产生柠檬酸， 在pH接近中性时，则产生草酸，只产少量柠檬酸。
又如：丙酮丁醇发酵中，丙酮丁醇梭菌在pH5.5~7.0范围 时，以菌体生长为主，发酵后期pH为4.3-5.3时积累丙酮丁 醇，pH升高则丙酮丁醇产量减少，而丁酸、乙酸含量增加。
（三）耗氧方面：
液体中的溶氧→微生物体内的氧
过程中需经过各种阻力：细胞周围的液膜阻力 菌团或菌丝间扩散阻力
细胞膜阻力
细胞内生化反应的阻力
六、 流加 H2O2对提高供氧及微生物代谢的影响
传统的方法是给发酵罐通入无菌空气，达到供氧的目的，近年来，加入氧载
体、流加H2O2 与藻类共培养以及通过基因克隆转入带氧的基因等方法。
KL --- 以浓度差表示推动力的传质系数（氧传质系 数），m/h
a--- 比表面积（即单位体积的液体中所含的气-液 接触面积），m2/m3
（二）影响KL a的因素
1、搅拌
增加气液接触面积（打碎气泡），增加氧传递面积。 使液体形成涡流，从而延长气泡在液体中的停留时间。 增加液体的湍流程度，降低气泡周围的液膜阻力、液体主流中液体阻力、从 而增加KLa值。 减少菌丝结团，降低细胞壁表面的液膜阻力。改善细胞对氧和营养物质的吸 收，同时降低细胞周围的“废物”和“废气“的浓度，有利于微生物代谢。
例：培养基初始pH值对漆酶分泌的影响
pH在4～7范围内产酶最高
2、pH对菌体生长和产物合成的影响
1）pH影响酶的活性、酶促反应的速率 2）pH影响微生物细胞膜所带电荷的状态 从而改变细胞膜的渗透性，影响微生物对营养物质的 吸收及代谢产物的排泄，因此影响代谢的正常进行。 3）影响培养基某些组分和中间产物的离解，从而影响微生 物对这些物质的利用。
采用H2O2供氧的优点：
H2O2与通气供氧结合，控制流加浓度和流加方式可提高发酵体系的细胞密
度；
H2O2可在过氧化酶的催化下分解放出氧气，在反应不是非常强烈的条件下， 氧气将直接以分子形式传给细胞，不会形成气液传质阻力，提高氧的传质速 率； 对剪切力敏感及非常粘稠的发酵体系提供了一种供氧手段； H2O2 供氧还可以改变菌体的代谢途径，促使菌体利用更有效的代谢途径来 合成产物。
合适溶解氧选择的原则：
如果要使菌体快速生长繁殖（如发酵前期），则应达 到临界氧浓度；如果要促进产物的合成，则应根据生产 的目的不同，使溶解氧控制在最适浓度（不同的满足度） 例如： 黄色短杆菌可生产多种氨基酸 ，但要求的氧浓度可能 不同 对谷氨酸和天门冬氨酸的生产，当溶解氧浓度低于临界 氧浓度时，氨基酸产量下降，也就是说要求氧的满足度 但对于苯丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸的生产，则在低于临 =1 界氧浓度时获得最大生产能力，它们的最佳氧浓度分别为 临界氧浓度的 0.55、0.66、0.85。
（1）引起pH下降的因素：
（凡是导致酸性物质生成或释放及碱性物质消耗的发 酵，其pH都会下降） ①培养基中碳氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量， 或者中间补糖过多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累 而pH下降。 ②消泡油加得过多 生成有机酸、消耗大量的氧。 ③生理酸性物质的存在，氨被利用，pH下降
两者的关系： r =Ｑo2 · X X-----发酵液中菌体的浓度g/L
在发酵工业中，耗氧与发酵产物之间的关系有三种
类型：
（1）产物生成期的耗氧与菌体生长期的耗氧一致。
（2）产物生成期的耗氧超过菌体生长期的耗氧量。
（3）产物生成期的最适耗氧量低于菌体生长期的
耗氧量。
目前，发酵工业中，氧的利用率(oxygen
utilization rate)还很低，只有40～
60％，抗生素发酵工业更低，只有2～8
％。
提高传质，提高溶氧速率非常重要。
三、溶氧测定的意义
2、溶氧作为发酵异常情况的指示；
1、溶氧作为发酵中氧是否足够的度量，了解菌对氧利用的规律；
3、溶氧作为发酵中间控制的手段之一； 溶氧一反往常，在较短的时间内跌到零附近，且跌零 后长时间不回升，这很可能说明污染了好气菌 补糖后，溶氧出现明显下降的趋势 4、溶氧作为考查设备、工艺条件对氧供需与产物形成影响 如发酵过程中溶氧迅速回升，发酵液变稀，则很可能 因此可利用溶氧作为参数来控制加料的次数、流加速 的指标之一。 是污染了噬菌体 度和加入量
四、适当溶解氧的选择
在好氧微生物反应中，一般取 [DO] ＞[DO]cri 以保证反应的正常进行。
◆
临界氧浓度是不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。
◆
氧的满足度
—— 实际溶解氧浓度与临界氧浓度之比。
一般好氧微生物临界溶解氧浓度很低，约为 0.003~0.05m mol/ L，需氧量一般为25.00mmol/(L· h) 。 临界溶解氧浓度大约是饱和浓度的１～２５％。
第四章 发酵工艺过程控制
第三节 溶氧浓度对发酵的影响及控制
一、发酵过程供氧的重要性
好氧微生物的生长和代谢活动都需要消耗氧气，它们
只有在氧分子存在的情况下才能完成生物氧化作用。
在25℃ ，一个 atm下，空气中的氧在水中的溶解度为0.25 mmol/L，在发酵液中的溶解度只有
0.22mmol/L，而发酵液中的大量微生物耗氧迅速（耗氧速率大于25~100mmol/L· h），因此， 供氧对于好氧微生物来说是非常重要的。因此，供氧对于需氧微生物是必不可少的。
来解决。
第四节 pH对发酵的影响及其控制
一、pH对发酵的影响
1、实例
例 pH对林可霉素发酵的影响 林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物， 发酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。若不 及时补糖、 (NH4)2SO4 或酸，发酵液 pH 可迅速升到 8.0 以 上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停 止。对照罐发酵 66 小时 pH 达 7.93，以后维持在 8.0 以上至 115小时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。 发酵15小时左右，pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3， 调节这一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高发酵 单位。
液 相 主 流
界面 传氧方向
单位时间体积中溶氧速率
G/ = KLa · V· (C* - CL)
G ---溶解于液体中的氧量，mmol --- 气-液接触时间，h V --- 培养液的体积，L
CL --- 液相中氧的浓度，mmol/L
C* --- 与气相中氧分压相平衡的液相中的氧饱和浓 度，mmol/L
不同微生物的生长pH值范围
微生物 pH值 最低 最适 Thiobacillus thiooxidans 氧化硫硫杆菌 0.5 2.0~3.5 Lactobacillus acidophilus 嗜酸乳杆菌 4.0~4.6 5.8~6.6 Rhizobium japonicum 大豆根瘤菌 4.2 6.8~7.0 Azotobacter chroococcum 圆褐固氮 4.5 7.4~7.6 Nitrosomonas sp. 硝化单胞菌 7.0 7.8~8.6 Acetobacter aceti 醋化醋杆菌 4.0~4.5 5.4~6.3 Staphylococcus aureus 金黄葡球菌 4.2 7.0~7.5 Chlorobium limicola 泥生绿菌 6.0 6.8 Thurmus aquaticus 水生栖热菌 6.0 7.5~7.8 Aspergillus niger 黑曲霉 1.5 5.0~6.0 一般放线菌 5.0 7.0~8.0 一般酵母菌 3.0 5.0~6.0