悬浮细胞培养
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14
⑤ 意义：
它是进行细胞生长和细胞分裂的生理
生化研究常用的培养方法。
பைடு நூலகம்
但要进行下一批培养，则生长一定时间
后，需要继代转移。
15
2、连续培养 （Continuous culture）
16
加入培养基
二者体积相等
排出培养基及其培养物
分：开放式连续培养（Open C.C）
17
封闭式连续培养（Closed C.C）
1、分批培养/成批培养 （Batch culture）
① 特点 • • 培养基体积固定 培养过程中，细胞生长，其数目不断发 生变化，呈S增长。
8
继代
9
② 继代的方法
• 用注射器或移管吸取一定量的含单细
胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到
含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进
行培养。
10
③最佳继代时期：
③ FDA法
24
①相差显微术法
观察细胞质环流和细胞核存在与否，环流正常、 核存在表明有活力
②伊凡蓝法
活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则不 能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞
③FDA法（荧光素双醋酸酯法）
25
FDA法的原理
FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以 自由出入细胞膜。 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极 性的荧光素。 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 荧光素在死细胞中不能积累。 在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧 光。
植物细胞代谢调节的研究（某种生长限 速浓度－细胞生长的影响）； 次生物质的大量生产。
19
3、悬浮培养中细胞生长量的计算
① 细胞计数
② 细胞密实体积
③ 细胞鲜重
④ 细胞干重
20
①细胞计数
5％铬酸或0.25％果胶酶使悬浮细胞团分散 用血球计数板计数。
②细胞密实体积（PCV）
将体积已知、均匀分散的悬浮液放入一个 15ml 的离心管中，2000转下离心收集细胞， 用每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。
3
步骤：
悬浮培养
继代
悬浮
摇床用于振荡
优点：细胞团成小 细胞团或单细胞； 在培养基中均匀分 布；有空气交流。 4
一、起始悬浮细胞的制备
转速30-150rpm
防细胞破裂
愈伤组织
液体培养基
摇床振荡 悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
5
6
二、悬浮培养的基本形式
1. 分批培养：将愈伤组织培养在一定容积的密闭 容器中，最后一次收获的培养方式。 2. 连续培养：将愈伤组织培养在一个恒定容积的 流动系统中，以使培养系统中的细胞数量和营 养状态保持稳定。 --流动系统：一方面以一定速率不断地加入新的 培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物 (菌体和代谢产物) 7
26
了解细胞数目增长变化S形曲线后，
选择对数生长期和直线 生长期！
11
培 养 细 胞 数 目
S形曲线
5
4
3 1
2
培养时间
12
培 养 细 胞 数 目 3
5 4
1
2 培养时间
1 滞后期
2 3 4 5
对数生长期
直线生长期 缓慢期 静止期
13
④操作注意事项：
对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔 径要小，只能通过单细胞或小细胞团 （2- 4细胞），使用吸管或注射器。 继代前，培养容器静置短时间，大细 胞团沉降，再吸上层悬浮液。 依此，多次，可建立良好的细胞悬浮 培养物。
第五章 悬浮细胞培养
1
主要内容
一．起始悬浮细胞的制备 二．悬浮细胞培养的基本形式 三．悬浮细胞培养中细胞生长量的计算 四．悬浮培养细胞活力的测定
2
悬浮细胞培养
Suspension cell culture
意义
1. 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞 群体，适于大规模培养； 2. 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究 细胞的生长、分化创造方法和条件。 必须指出 悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
①开放式和封闭式区
别 封闭式中：排出液中的细胞用机械方法（离
心）收集后，又放入原培养基，所以其培养细 胞数目不断增加
开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培养 细胞随同培养液一起流出，培养细胞数目保持 恒定
通过调节流入和流出的速度，使培养物的 生长速度永远保持接近最高值的恒定水平上
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②连续培养意义：
21
血球计数板
计数室
每毫升样品中细胞数 每小格细胞平均数 × 4000 × 1000 × 稀释倍数
22
③细胞鲜重：细胞培养物过滤，洗去培 养基，真空抽虑，称重。 ④细胞干重： 60℃干燥12小时后，以 每毫升培养物或106个细胞的重量表 示。
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4、培养细胞活力的测定
① 相差显微术法
② 伊凡蓝法
⑤ 意义：
它是进行细胞生长和细胞分裂的生理
生化研究常用的培养方法。
பைடு நூலகம்
但要进行下一批培养，则生长一定时间
后，需要继代转移。
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2、连续培养 （Continuous culture）
16
加入培养基
二者体积相等
排出培养基及其培养物
分：开放式连续培养（Open C.C）
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封闭式连续培养（Closed C.C）
1、分批培养/成批培养 （Batch culture）
① 特点 • • 培养基体积固定 培养过程中，细胞生长，其数目不断发 生变化，呈S增长。
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继代
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② 继代的方法
• 用注射器或移管吸取一定量的含单细
胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到
含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进
行培养。
10
③最佳继代时期：
③ FDA法
24
①相差显微术法
观察细胞质环流和细胞核存在与否，环流正常、 核存在表明有活力
②伊凡蓝法
活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则不 能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞
③FDA法（荧光素双醋酸酯法）
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FDA法的原理
FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以 自由出入细胞膜。 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极 性的荧光素。 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 荧光素在死细胞中不能积累。 在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧 光。
植物细胞代谢调节的研究（某种生长限 速浓度－细胞生长的影响）； 次生物质的大量生产。
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3、悬浮培养中细胞生长量的计算
① 细胞计数
② 细胞密实体积
③ 细胞鲜重
④ 细胞干重
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①细胞计数
5％铬酸或0.25％果胶酶使悬浮细胞团分散 用血球计数板计数。
②细胞密实体积（PCV）
将体积已知、均匀分散的悬浮液放入一个 15ml 的离心管中，2000转下离心收集细胞， 用每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。
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步骤：
悬浮培养
继代
悬浮
摇床用于振荡
优点：细胞团成小 细胞团或单细胞； 在培养基中均匀分 布；有空气交流。 4
一、起始悬浮细胞的制备
转速30-150rpm
防细胞破裂
愈伤组织
液体培养基
摇床振荡 悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
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二、悬浮培养的基本形式
1. 分批培养：将愈伤组织培养在一定容积的密闭 容器中，最后一次收获的培养方式。 2. 连续培养：将愈伤组织培养在一个恒定容积的 流动系统中，以使培养系统中的细胞数量和营 养状态保持稳定。 --流动系统：一方面以一定速率不断地加入新的 培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物 (菌体和代谢产物) 7
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了解细胞数目增长变化S形曲线后，
选择对数生长期和直线 生长期！
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培 养 细 胞 数 目
S形曲线
5
4
3 1
2
培养时间
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培 养 细 胞 数 目 3
5 4
1
2 培养时间
1 滞后期
2 3 4 5
对数生长期
直线生长期 缓慢期 静止期
13
④操作注意事项：
对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔 径要小，只能通过单细胞或小细胞团 （2- 4细胞），使用吸管或注射器。 继代前，培养容器静置短时间，大细 胞团沉降，再吸上层悬浮液。 依此，多次，可建立良好的细胞悬浮 培养物。
第五章 悬浮细胞培养
1
主要内容
一．起始悬浮细胞的制备 二．悬浮细胞培养的基本形式 三．悬浮细胞培养中细胞生长量的计算 四．悬浮培养细胞活力的测定
2
悬浮细胞培养
Suspension cell culture
意义
1. 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞 群体，适于大规模培养； 2. 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究 细胞的生长、分化创造方法和条件。 必须指出 悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
①开放式和封闭式区
别 封闭式中：排出液中的细胞用机械方法（离
心）收集后，又放入原培养基，所以其培养细 胞数目不断增加
开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培养 细胞随同培养液一起流出，培养细胞数目保持 恒定
通过调节流入和流出的速度，使培养物的 生长速度永远保持接近最高值的恒定水平上
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②连续培养意义：
21
血球计数板
计数室
每毫升样品中细胞数 每小格细胞平均数 × 4000 × 1000 × 稀释倍数
22
③细胞鲜重：细胞培养物过滤，洗去培 养基，真空抽虑，称重。 ④细胞干重： 60℃干燥12小时后，以 每毫升培养物或106个细胞的重量表 示。
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4、培养细胞活力的测定
① 相差显微术法
② 伊凡蓝法