微生物碳氮的测定方法

二、土壤微生物量碳、氮的测定方法—熏蒸提取法

1．主题内容与适用范围

本方法采用氯仿熏蒸—提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥土壤。

2．方法提要

土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K

2SO

4

溶液浸提，提取液一部分用K

2

CrO

7

氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H

2SO

4

消煮、碱化蒸馏法测定微生物量氮。

3．提取液的制备

3.1仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析天平（感量：

0.01g）、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、大三角瓶（150ml）、40C的冰

箱、定量滤纸（15cm）、漏斗、保鲜膜

3.2试剂的制备：0.5 M K

2SO

4

溶液（化学纯）、

无醇氯仿（提纯方法：用1N H

2SO

4

溶液与氯仿按体积比2:1于分液漏斗中振

荡混匀，净置分离，共做3次；再用水代替硫酸与氯仿2:1混匀，振荡分离，

共5次，将提纯的氯仿放入到棕色试剂瓶中，加一勺无水硫酸钠，保存）3.3分析步骤：

3.3.1 称取12.50g鲜土(取土要准确、均匀，不要夹入有机残体)于大铝盒中。在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸24小时。到时间后，取出小烧杯后反复抽真空2~3次（每次5分钟），排除氯仿。

另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。

3.3.2 将步骤(3.1.1)中的两批土样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。用注射器注入每

瓶50ml 0.5M K

2SO

4

溶液，盖紧瓶塞，振荡30分钟，离心5分钟后取出，用15ml定量滤纸

过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。如不立即测定，用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在40C的冰箱中。

4．生物量碳的测定—K

2CrO

7

氧化法

4.1仪器、设备：DOC测定仪(冷凝装置4套、配套沸瓶装16个)、玻璃沸珠、1500W电炉两

个、变压器两个、滴定管（25ml）

4.2试剂的制备：蒸馏水、混合酸(浓硫酸:浓磷酸=2:1,分析纯) 、0.1000N K

2CrO

7

标准溶液

邻菲罗啉指示剂、66.7mM（0.4 N）K

2CrO

7

溶液（19.6125g/L，分析纯）

0.02M (NH

4)

2

Fe(SO

4

)

2

溶液：取15.69g/L溶于蒸馏水，用20ml浓硫酸（98%，

分析纯）酸化，而后定容至1L、4.3分析步骤：

4.3.1吸取2ml 0.4 N K

2CrO

7

溶液放入沸瓶，再吸15ml 混酸放入沸瓶，混合，加入等量的

玻璃球（约一小药匙，10个）。吸取步骤（3.2.2）中的过滤液8~10ml（根据含碳量多少而定），放入到电炉上，安装好冷凝系统，调压至130伏开始加热。从玻璃球沸腾时开始记时，保持沸腾30分钟，其间应摇匀两次。在30分钟到前2分钟关上电炉，利用余热保持沸腾至30分钟，随后从冷凝管上口加入20ml蒸馏水，清洗冷凝管壁，降低沸瓶温度。

4.3.2 取下沸瓶，待冷却至室温，加入2~3滴指示剂，用准确标定过的(NH

4)

2

Fe(SO

4

)

2

溶液

滴定。颜色从黄色→深绿色→天蓝色→浅灰色（很短暂）→红棕色到终点。同时用0.5M K

2SO

4

代替过滤液作空白，注意两个电炉间的差异。

注：(NH

4)

2

Fe(SO

4

)

2

溶液的标定：在三角瓶内放入0.1000 N K

2

CrO

7

标准溶液10ml，加入混合

酸15ml，摇匀冷却，用(NH

4)

2

Fe(SO

4

)

2

溶液滴定，颜色反应同上。一般在测定开始和结束时

各标定一次，取平均值，保留4位小数。

4.4分析结果的表述：

计算公式：（1）C（ug/ml）=[(V

空白—V

样品

)*N

(NH4)2Fe(SO4)2

*3*1000]/吸取样品的体积数(ml)

（2）C（ug/g）=[C(ug/ml)*提取液的总体积数(ml)]/W

干土

(g)

（3）EC（ug/g）=C

熏蒸（ug/g）—C

未熏蒸

（ug/g）

（4）微生物量碳BC（ug/g）=EC/0.38（ug/g）

4.5允许差

4.5.1取平行测定结果的算术平均值作为测定结果（一般做两次重复）。

4.5.2平行测定的绝对差值≤10ug/g。（要求样品滴定时的绝对差值≤0.1ml）

5．微生物量氮的测定—消煮、碱化蒸馏法

5.1仪器、设备：定氮仪、烘箱、开氏瓶（50ml）、移液管（50ml、2ml、5ml）、小漏斗、小

三角瓶（150ml）

5.2试剂的制备：去离子水、浓硫酸（化学纯）、硼酸指示剂、10M NaOH溶液（化学纯）、CuSO4

溶液

5.3分析步骤：

5.3.1 吸取步骤3.2.2中的过滤液25-30ml放入到开氏瓶（三角瓶）中，加入2ml浓硫酸（固定滤液中的氨）。放入到烘箱中在60~700C烘2~3天，直至瓶内还剩下3ml左右溶液，取出。加入3ml浓硫酸和1ml0.19MCuSO4溶液，放上小漏斗在电炉上消煮。消至瓶内颜色呈

天蓝色为止，取下冷却。同时用0.5N K

2SO

4

溶液50ml代替滤液作空白。

5.3.2 用去离子水洗清小漏斗内外壁，少量多次冲洗开氏瓶，将开氏瓶中的液体全部转移到定氮仪中，加入20ml 10N NaOH溶液进行碱化蒸馏，冷凝管下口放装有5ml硼酸指示剂的小三角瓶，接收蒸馏液，待蒸馏液达到60ml时停止蒸馏。蒸馏前应检查蒸馏装置是否漏气，并进行空蒸馏清洗管道。

5.3.3 用0.02N硫酸标准溶液滴定馏出液，加入指示剂，颜色由蓝色刚变成紫红色为终点，记录消耗硫酸标液的体积。

5.4分析结果的表述：

计算公式：N （ug/g）=[(V—V

0)*N

H2SO4

*14.0*稀释倍数*1000*2.22]/W

烘干土

微生物量氮BN（ug/g）=N

熏蒸—N

未熏蒸

其中： V ：滴定样品所消耗的硫酸数，ml；

V

：滴定空白所消耗的硫酸数，ml；

稀释倍数：总过滤液是所吸取的过滤液的倍数，；

2.22：无机氮转化为有机氮的转化系数。

5.5允许差

5.5.1取平行测定结果的算术平均值作为测定结果（一般做两次重复）。

5.5.2平行测定的绝对差值≤5ug/g。（要求样品滴定时的绝对差值≤0.05ml ）