双光子荧光显微镜的研究

浙江大学』Ⅲ！｛ｊ学位论文第二章双光ｆ成像理论吒。

ｍ＝叫２吨。

篙ｅｘｐｆ（２Ｂ．４）山§２２的分析可以知道，这里口；为一比例系数，与单光子探测系统有关；口，现对单光子荧光强度和双光子荧光强度在径向作一比较，令公式（２．３．３）和（２．３．４）中的ｚ＝Ｏ，可以得到荧光光强的径向分布方程分别为：Ｌ。

，叫ｏｅｘ。

吲旺，ｓ，Ｌ。

胁，叫。

２唧陶㈦，．ｓ，（ａ）（ｂ）图２—３荧光强度径向归一化分布（ａ）甲光子荧光光强径向归～化分布（ｂ）双光予荧光光强径向归～化分布蔫浙江大学顺士学位论文第三章双光于实验系统简介第三章双光子实验系统简介在了解了双光予成像理论的基础上，介绍实验中双光子成像系统的流程以及备个组成部分。

通过前期的实验，分析和总结得到的实验数据，经理论计算后，对取光子系统的性能做了一个测试，为双光子荧光成像实验，以及双光子、ＯＣＴ相结合实现结构功能成像等后期科研的展开打下基础。

本章首先介绍了双光子荧光成像系统的流程，然后对其主要部分：光学成像设计、光电转换、机械扫描做了一个简要的介绍，研制了新型的扫描探头。

§３．１双光子荧光成像实验系统流程双光予实验系统的总体构架如图３一ｌ所示图３，ｌ双光子荧光显微镜实验系统图对于一个完整的双光子荧光成像系统，一般应包括：光学成像、光电转换、机械扫描、计算机控制、数据采集、数据处理和显示等几个部分。

其系统流程如第二章职光予实验系统简介在探测器前面放置了荧光滤光片，来选择适当的荧光范围，过滤背景光，提高系统的信噪比。

图３—３中虚线框内表示的是ＮＩＫＯＮ５０Ｉ显微镜丰体，其详细结构如图３－４所示：图３．４ＮＩＫＯＮ５０Ｉ显微镜光路图箭头的方向表示光束入射的方向。

由图可以知道，Ｎ１ＫＯＮ５０１显微镜本身结构中就包含了落射式和透射式两种激发荧光的方式，可以根据需要来选择。

由第章ｌ｝，的介绍，可以知道，对本次实验来说，为最大程度的探测荧光，用落射式采集荧光的效率高，所以只利用显微镜上半部分的光路。

卜面详细介绍了光学系统设计中，各组成元件的型号、参数：１、钛．蓝宝石飞秒激光器２、扩束镜３、光束折转架波长６９０－１０５０ｎｍ输出功率可调实验中功率为１００—５００ｍＷ脉宽：８５—１３０ｒｓ重复频率：８２ＭＨｚ透过率＞９５％中心波长７９０ｖａｎ有效波长范围６５０－１０００ｎｍ高损伤阈值：８ｄ／ｃｍ２在ｌＯｎｓ脉冲，波长１０６４ｎｍ时总反射率８８％３４浙江大学硕士学位论文第三章双光子实验系统简介损耗相关，还与样品的本身有关，不同的样品，荧光激发效率不同，荧光强度也就１ｉ同；还有就是物镜的数值孔径，数值孔径越大，荧光的采集效率越高。

如只考虑系统损耗刺探测的影响：假设进入物镜的荧光能量为１００％，那么最终被探测器接收的能量大概是６４％左右。

§３．３光电转换系统在双光子荧光显微镜中，由于探测的荧光的强度很弱，而且扫描的速度比较快，所以需要灵敏度高、响应快速的探测器。

而光电倍增管（ＰＭＴ）在探测荧光时，具有高量子效率、高稳定性、低暗电流、高电流增益和超快的时间响应，所以～般选用光电倍增管作为双光子荧光显微镜的探测器件。

实验中选用的Ｈ５７８４—０２型光电倍增管作为探测器件，其外观如图３．６所示：图３－６Ｈ５７８４—０２型光电倍增管外观图Ｈ５７８４—０２型光电倍增管不但外观简洁、容易安装，而且集成了高压包、电流放大的功能。

从光电倍增管的原理上来说，要使光电倍增管正常‘Ｉ：作，需要在阴极和阳极之间加上近千伏的高压，所以通常需要在外部加一个高压包，将输入的直流低压转换成近干伏的高压，作为光电倍增管的工作电压。

现在将高压包集成到内部以后，大大降低了电路的复杂性和操作的危险性。

而且由于自带了放大电路，所以省去了外设放大电路的麻烦，通过Ｈ５７８４．０２型光电倍增出来的自接是模拟电压信号，可以用数据采集卡进行采集。

Ｈ５７８４、０２型光电倍增基本的原理如图３．７所示：浙江人学坝１学位论文笫三章双光了实验系绕简介§３．４．１轴向扫描系统由§２‘３的分析可以知道，双光子荧光的空间分布在轴向具有很高的分辨率，荧光的强度，与轴向距离的４次方成反比。

所以轴向的扫描要求精度更高，以更好的体现双光子荧光显微镜高空间分辨率的特点。

轴向的扫描，可以通过压电陶瓷来实现。

利用压电陶瓷的特性，控制输入电压，驱动压电陶瓷发生精确位移，来达到轴向扫描的目的。

虽然压电陶瓷具有很高的精度，但利用压电陶瓷的伸缩效应来实现位移，操作麻烦，而且压电陶瓷本身的限制，使得总位移量不够。

本实验系统采用了ＰＳｌ０１轴向扫描系统，不但精度高，扫描速度也快，而且本身无扫描范围限制。

如图３—１１所示：（ｃ）（ｂ）图３．１１ｚ辅扫描系统（ａ）ｚ轴驱动马达（ｂ）ｚ轴控制手柄【ｃ）步进电机控制器Ｐｓｌ叭轴向扫描的精度为０．００２，ｕｍ／ｓｔｅｐ最大速度为２０ｒｅｖｓ／ｓ，可以通过控制于柄手动来调节ｚ轴的位移，也可以通过编程，用电脑对控制器发出指令，从而控制驱动马达的转动。

由于实际操作中，轴向扫描的实现是由Ｐｓｌ０１轴向扫拙系统，驱动显微镜的升降手柄，使载物台达到升降的目的，从而完成对样品的轴向扫描。

所以，ｚ轴的扫描精度还和５０Ｉ显微镜主体的轴向精度有关。

§３．４．２平面扫描系统舣光子荧光扫描显微镜系统实现平面扫描的方式常用的有两种：振镜扫描和电动平移台扫描。

本实验系统选用的是型号为ＹＡ０５Ａ．Ｒ】的＝维扫描电动平移台。

将样品置于平移台上的载物台上，通过平移台的移动，实现对样品径向的二维扫描。

其装置浙江大学倾士学位论文第三章积光了实验系统简介和基本参数如图３．１２所示ＴａｂｌｅＳｉｚｅ５０ｍｍ＊５０ｍｍＧｕｉｄａｎｃｅＭｅｃｈａｎｉｓｍＰｒｅｃｉｓｉｏｎＣｒｏｓｓｅｄＲｏｉｌｅｒＭｏｔｉｏｎＲａｎｇｅ±７．５ｒａｍ（２ａｘｅｓ）【ＬｅａｄｍｅｃｈａｎｉｓｍＧｒｏｕｎｄＳｃｒｅｗ，Ｐｉｔｃｈ０．５ｒａｍｌｄｅａｌＲｅｓ０１ｕｔｉｏｎ０５ｕｒｎ／ｓｔｅｐ（Ｆｕｌｌｓｔｅｐ）ＭａｘｉｍｕｍＳｐｅｅｄ５ｒａｍ／ｓｅｃ．（Ｆｕｌｌｓｔｅｐ）ＡｃｃｕｍｕｌａｔｅｄＬｅａｄＥｒｒｏｒ１０ｕｍ／１５ｒａｍ『Ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ±０．５Ｈｉｌｌ【ＢａｃｋｌａｓｈｌｕｍＬｏｓｔＭｏｒｉｏｎｌｕｍ『Ｓｔｒａｉｇｈｔｎｅｓｓ２ｕｒｎ／１５ｒａｍＭｏｍｅｎｔｕｍＬｏａｄＳｔｉｆｍｅｓｓ６ａｒｃｓｅｃ／ｋｇ－ｃｍＬｏａｄＣａｐａｃｉｔｙ（Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｌｙ）４ｋｇＭａｔｅｒｉａｌＡｌｕｍｉｎｕｍＦｉｎｉｓｈＮａｔｕｒａｌＣｏｌｏｈＡｎｏｄｉｚｅｄＭａｔＷｅｉｇｈｔ１．３ｋｇＰｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒｉｔｙ５ｕｒｎ，１５ｍｍ图３．１２ＹＡ０５Ａ．Ｒ１二维电动平移台外观图和参数（ａ）一维电动平移台外观图（ｂ）平移台基本参数图本电动平移台，由两个相同的一维电动平移台叠加而成，而且分别有各自的驱动器来拎制。

结构紧凑，定位精度高，可与显微镜的载物台相结合，安装方便，符合安装的要求。

选用二维的电动平移台实现平面扫描的优点是：可以根据需要，通过ｘ、Ｙ方向的二维的控制，精确的扫描到所需要的某一点。

缺点是，由于双光子成像是对某一点强度的成像，要实现一副二维图片的成像，需要逐点、逐行的进行扫描，相对来说速度较慢。

为此，对于本实验中的双光子荧光显微镜的平面扫描系统进行了研究，研制了新型二维光纤扫描探头。

第二幸双光子实验系统简介§３．５新型扫描探头的研制在§３．４．２中曾提到了平面扫描的方法。

相对『面言，步进电机的扫描范围大，但扫描速度慢；而压电陶瓷的扫描精度高，但范围不大；振镜扫描方式具有速度快、扫描范围大、震动影响小等优点，但不论哪种平面扫描方式，都存在一个问题，就是整个扫描系统太大，对一些活体研究可操作性不强，样品组织一般都要做成切片的形式进行探测。

以下我们提出了一种利用双压电晶片的～维振动实现光纤探头二维扫描的方法，可以大大缩小整个扫描部分的体积，为自由活体研究提供了一种新的途径。

§３．５．１扫描探头的结构手１描头具体结构如图３－１３（ａ）所示（ａ）（ｂ）图３．１３光纤扫描探头（ａ）为光纤探头的结构（ｂ）为振动中的光纤探头（侧视图）取一双压电晶片（４０ｍｍ＋８ｍｍｔＯ．５５ｒａｍ），将光纤去皮后粘在晶片的ｌ表面，留１５。

３０ｍｍ在外面，用于振动，并在离晶片前端４ｍｍ左右的光纤处拉一根刚性的支撑杆，支撑杆的另一端斜拉于晶片的下表面。

并将整个双压电晶片固定Ｆ底Ｊ坐上面。

浙江人学坝１’学位论义第一三章双光于实验系统简彳ｒ于ｊ描曲线。

如图３一ｌ５，当两难弦信号频率比不变，而相位差发生变化的时候，扫描轨迹也随之变化。

这个相位差，指的是信号发生器产生的两信号之间的相位羞，而非实际振动中光纤探头在ｘ、Ｙ方向上的相位差，实际的相位差可以出＿维的位置敏感探测器（ＰｏｓｉｔｉｏｎＳｅｎｓｉＯｖｅＤｅｔｅｃｔｏｒ，ＰＳＤ）探测所得。

在同一扫描范围内，扫插曲线的疏密代表了分辨率的高低。

可以根据需要，调节相位差而获得不同的分辨率。

（ａ）（ｃ）（ｄ）陶３－１５频率比为２５９：１８５Ｈｚ时候的不同相位的扫描曲线图（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）分别表不相位差为３０６０。

８０。

８６。

时的曲线圈刚３－１６表示了不同正弦信号频率比的扫描轨迹，适当的选择合适的频率比可以提高扫描探头的分辨率。

不同频率比的选择要基于光纤共振频率的基础上使得光纤在ｘ，Ｙ方向的振幅较大，且扫描轨迹稳定。