蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白质复性
在吸附型色谱复性中，蛋白质通过与介质发
生较强的吸附作用来抑制凝集。
反胶团中的蛋白质复性
利用反胶团溶解变性蛋白质，可将变性 蛋白质彼此分隔开，阻止分子间相互作用，
提高复性收率。
• 包含体的概念；包含体的形成原因及体 内抑制方法。 • 包含体分离纯化；包含体溶解方法。 • 蛋白质复性方法。
二、包含体的分离纯化和溶解
1 包含体的分离纯化
分离：包含体通常位于细胞质中，通过采用机械破碎 细胞的方法或者化学破碎（加变性剂）或者溶菌酶与机械 法结合的方法破碎细胞后，采用离心分离或者膜分离，即 可得到粗包含体沉淀物。
纯化：粗包含体中有质粒DNA、脂多糖和其他蛋白质存 在，会加速聚集体的生成，复性率降低。相反，纯化了的包 含体复性收率可大幅度提高。经常采用的包含体分离纯化过 程包括差速离心和反复洗涤。
③高表达的蛋白肽链来不及形成正常的折叠构像而
导致错误的二硫键连接，或者是高表达时细胞内氧化还
原条件不同而生成不同的二硫键连接；
④蛋白溶解需要与其他成分结合或经其他成分诱导。 但产生的蛋白量过多，所需其他成分相对不足，如折叠 酶和一些后修饰酶及分子伴侣等，蛋白质就不能溶解。
2、包含体的性质
具有很多优势： •以大肠杆菌为宿主，过表达形成的高密度蛋白质聚集 体，利于大规模生产目标蛋白； •目的产物含量高，利于分离纯化； •对蛋白酶不敏感，不易水解； •可避免具有毒害或杀伤作用的目的产物对宿主的伤害。
色谱复性
以凝胶过滤色谱为代表的非吸附性色谱复性；吸附性 色谱（金属鳌和色谱、亲合色谱、离子交换色谱、疏水相 互作用色谱）复性；固定化辅助因子复性（将某些对蛋白 质复性有辅助作用的分子固定在凝胶介质表面，用该固定
化凝胶介质辅助蛋白质复性的方法）
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白质复性方法及其注意事项蛋白前期准备（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。
（3）透析Buffer的选择可参考文献。
蛋白复性包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。
包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。
这里主要考虑第二种方案。
包涵体的洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。
超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。
包涵体的溶解1、对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
蛋白质的复性
流加稀释复性 复性液中蛋白质初始浓度=0.边流加、边 复性。故变性蛋白质浓度始终保持在较低 水平，有利于提高复性收率，且终浓度较 高。
蛋白质复性的影响因素
浓度
增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行
温度
蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（＞40℃） 蛋白质的聚集将十分严重
pH值
通常复性在弱碱性条件下（pH8）进行，但要注意避免 与蛋白的pI值相近
疏水键的相互 作用强度
蛋白质复性
包涵体形成的机制： U←→I←→N U：指完全去折叠的状态， I：指折叠中间体（也称融球态 molten globule state） N：指天然的成熟的状态
蛋白质复性
Mitraki和King提出了以下包涵体的形成模型：
IPf为可溶的、部分折叠的早期中间体 IPm未可形成单体的中间体 IPf*为形成包涵体的形式
第五章 蛋白质的复性
蛋白质的复性
为什么要进行蛋白质的复性？
外源基因导入E.coli等宿主细胞并表达蛋白质产 物（ r-干扰素，白细胞介素-2，人生长激素等） 时，相当多的产物形成了包涵体，而没有蛋白质 的活性。所以要进行蛋白质的复性。 1.什么是包涵体？ 2.为什么选择原核表达系统（特别是 E.coli ）？
蛋白质复性
包含体复性的方法 影响复性蛋白产率的因素： (1) 复性蛋白的浓度,为防止蛋白质分子间发生聚 集,复性蛋白的浓度要尽量稀,一般控制在25-75 ug/mL为好. (2) 复性缓冲液要保持适当的氧化还原条件.一般 GSSG（氧化型谷胱甘肽）和GSH之比为1为好. (3) 复性缓冲液的pH要通过实验来确定最适值. (4) 复性溶液中要加入适当的labilizing 试剂,如L 精氨酸,可提高复性产率.
蛋白质复性ppt课件
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
复性有关理论
“动力学假说”与“热力学假说”并不互相否
定，而是互相补充与修正，对不同蛋白质而言，二 者在蛋白质多肽链折叠过程中所起的作用大小不同， 各有特点。总体上，蛋白质的折叠遵循“热力学假 说”，从高能态向低能态转变的过程又受动力学控 制。一些小分子单结构域蛋白质的折叠过程相对简 单些；热力学控制下能容易地进行可逆的变性、复 性；结构比较复杂的蛋白质，特别是涉及S-S键重排， 脯氨酰顺反异构限速步骤的折叠反应，总体上受热 力学控制，但折叠途径即动力学控制比较重要。
蛋白质的再折叠是依据最小能量原则进行的，假 设蛋白质的天然构象是能量最小的构象，变性态蛋白 质分子会自发的向这个最小能量状态转变。这就是 “热力学假说”。
该理论认为：蛋白质天然构象形成具有协同性， 其能量差别足以区别天然构象和其它构象。大部分蛋 白质的天然构象应是能量最小构象。
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复性有关理论
两个理论都认同：蛋白质的折叠是蛋白质自身分
子内作用的结果，是由于暴露在溶液中的疏水侧链的 疏水作用而互相靠近，形成了具有特定三维空间结构 的蛋白质分子。
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蛋白复性
包涵体的变性及复性1、用1×Binding Buffer作裂解液，超声波破碎后，获得的包涵体；2、包涵体用含0.3%SKL（十二烷基肌氨酸钠）的1×Binding Buffer溶解，室温静置至完全溶解；3、充分溶解后，，加入用1×Binding Buffer配制的0.2%PEG2000和0.1mM GSSG：1mM GSH，0.1mM Arg，5-10% Glycerol），最后用1×Binding Buffer稀释蛋白至原菌液体积，调整pH（具体值视蛋白情况定，避开pI），装入透析袋中；4、用20倍体积的1×Binding Buffer进行4℃透析复性，每2h换一次，6次换液后，离心收集蛋白液；5、按可溶性蛋白纯化，注意保持低温环境，防止蛋白降解。
注意：透析液中的添加剂的浓度要在实验中摸索，每种蛋白的要求可能不同。
复性过程的添加剂：1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。
一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。
3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。
有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。
不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%-30%。
蛋白的变性和复性
蛋白的变性和复性蛋白的变性和复性变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。
蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。
变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。
引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。
化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。
不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。
蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。
生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。
（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。
（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。
第3章(2) 蛋白质变性与复性
包涵体
在E.coli细胞质内高水平表达的外源蛋白质， 尤其是来自真核生物的蛋白质聚集，会形成不溶 性、无生物活性的聚合物---包涵体。
E.coli包涵体
大肠杆菌中的胰乳酶原包含体电镜照片
包涵体
包涵体形成原因：
• 使用高计量基因和强启动子；
• 大肠杆菌细胞质环境条件，如pH、离子强度、高还原 电位，不同于外源蛋白质正确折叠为最终构象条件；
• 破碎细胞，可耐受较高温度和破碎条件；
• 离心沉淀包涵体，离心力较低，除去碎片；
• 洗涤包涵体，包涵体的目的蛋白质含量为80% 左右， 含有酯类，蛋白，可用含低浓度的变性剂，如尿素、 盐酸胍、Triton X-100反复洗涤，黏度高时可用溶菌 酶、稀NaOH溶液洗涤，获得较纯的包涵体。
• 目标产物的复原
变性蛋白质在脱离变性剂的环境发生聚集，产生沉淀。
• 在蛋白质复性的同时可使目的蛋白质与杂蛋白质分离，
层析（色谱）复性的一般操作
洗涤液 洗脱液
色谱法复性过程的示意图
凝胶过滤复性
凝胶过滤色谱是以溶液中分子的流体力学 体积大小进行混合物分离的技术。物料在色谱 柱中的保留体积不会超出色谱柱中的溶剂的总 体积，保留时间短，溶质峰相对较窄，容易检 出，灵敏度高。能够把握间隔进料的时间，进 行色谱柱的连续使用，提高使用效率。 蛋白质分子大，先从柱子上洗脱，变性剂分子 小，最后流出色谱柱。达到复性目的。
谷胱甘肽等使S- S键断裂。
包涵体的溶解
温度一般25℃~30℃，以促进溶解。
在细胞质内形成的包涵体，可采用原位溶 解法。即在发酵结束时向培养基中加入变性剂 和还原剂，在碱性条件下进行包涵体原位溶解 （增加细胞膜的通透性，使包涵体溶解出来）， 再采用双水相萃取除去细胞碎片，获得包涵体 溶解液。
色谱法使蛋白质复性的流程
色谱法使蛋白质复性的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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蛋白质复性技术
一、基本原理
• （4）色谱复性：在色谱的过程中实现复性， 称为色谱复性法。优点在于，色谱固定相 对变性蛋白质吸附性能低，甚至完全消除， 变性蛋白质在脱离变性剂的环境发生聚集， 产生沉淀。提高复性质量和活性收率。在 蛋白质复性 的同时可使目的蛋白质与杂质 蛋白质分离，达到复性和纯化的双重效果。
一、基本原理
蛋白质复性
一、基本原理
1、包含体 • 是指以大肠杆菌为宿主细胞的基因表达产物由 于不能分泌到细胞外，而在细胞内聚集形成的 没有生物活性的固体颗粒。 • 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体 元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、 ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以 及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很 高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶 性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
一、基本原理
• （2）洗涤：为了除去包含体上粘附的杂质， 如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包含体， 通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或 盐酸胍会使包含体溶解，如2M尿素洗涤。 此外可以用温和去垢剂洗涤去除膜碎片和 膜蛋白。
一、基本原理
• （3）溶解：一般用强的变性剂如尿素、盐 酸胍通过离子间的相互作用，打断包含体 蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使 多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素， 因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使 尿素不能溶解的包含体溶解，而且尿素分 解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲 酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。
一、基本原理
3、蛋白质复性
• 由于包含体中的重组蛋白缺乏生物学活性， 加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构 破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。 通去除还原剂使二硫键正常形成。
一、基本原理
10蛋白质复性
200
180
160
Spe,不被任何膜 所包围。细胞破碎后,包含体呈颗粒状,致密,低 速离心就可获得。欲获得天然活性态的目标产 物,必需分离包含体后,溶解包含体并使其中的目 标蛋白恢复应有的天然活性。
包含体的形成和性质
1 包含体的形成 2 包含体的性质 3 包含体的优点
包含体形成的原因
主要是高水平表达的结果。 在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过蛋白
包含体的纯化和溶解
溶解
变性剂： 5～8mol/L盐酸胍、8mol/L尿素 硫氰酸盐、表面活性剂（十二烷基磺酸钠，十六 烷基三甲基氯化胺等）
还原剂： 1～100 mmol/L的二硫苏糖醇； 1～200 mmol/L的β-巯基乙醇或半胱氨酸
蛋白质复性
热力学驱动； 分子内折叠和分子间聚集的动力学竞争过程。
体外复性研究的核心问题：
1、模仿体内蛋白质折叠过程： 构建适于蛋白质正确折叠的环境，设计能够促进蛋 白质正确折叠、抑制折叠中间体聚集的折叠助剂 （Folding aids，folding modulators）
2、发挥体外折叠的独特优势： 构建体内不可能存在的独特环境，实现高效复性和 分离纯化：
色谱、反胶团、膜、双水相系统、沉淀……
盐酸胍 < 2 mol/L 脲 < 4 mol/L
－GSH/GSSG 4/0.4 mmol/L ~ 5/5 mmol/L ✓ 直接稀释、透析、流加
直接稀释（Direct dilution）：
将少量变性蛋白质溶液直接加入到较大体积的 复性缓冲液中，变性剂浓度降低，蛋白质开始 复性；
蛋白质浓度一定的条件下，稀释倍数和混合效 率是影响复性收率的重要因素。
活性剂） （4）离心沉降回收包含体 （5）根据需要，重复上述步骤（3）和（4），直至达
蛋白质的复性
加变性剂溶解
除变性剂复性。
（2）机械破碎 膜分离可溶性蛋白
变性溶解包含体 除变性剂复性。
（3） 化学破碎（加变性剂） 出除变性剂复性。
离心除细胞碎片
蛋白质复性
路线1的特点：
方法（1）：利用了包含体与细胞破碎片的密度 差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性性蛋 白质分开，获得包含体，再对包含体溶解后，复 性，摆脱大量的杂蛋白，核酸，热原，内毒素等 杂质。 优点：分离步骤简单； 缺点：经几次离心后，才能除去大部分细胞碎片， 加工时间长。
蛋白质复性
预防包含体形成的方法
2. 通过改变、优化培养条件增加表达产物的可溶性. 为了使外源蛋白在E.coli细胞中可溶性，人们在培养条件的 优化方面进行了多方面的探索。
（II）利用丰富培养基,可使T4噬菌体的脱氧胞苷酸 脱氨酶的基因进行可溶性表达，表达量占细胞可 溶性蛋白总量的20%，而在最低培养基中，此酶 以包含体形式表达。
蛋白质复性
蛋白质复性的主要步骤：
破碎细胞
分离出包含体
溶解包含体
目标构建的构型复原 纯度的蛋白。
对复性蛋白进行纯化获得高
包含体颗粒内并不一定多是表达产物，也可能含有其
他杂物，核酸，脂类，杂蛋白等.
蛋白质复性
主要蛋白质复性的基本步骤和联合实验如下：
（1）机械破碎（高压匀浆，高速珠磨法）
离心法提取出包含体
蛋白质复性
基因表达系统一般分为真核表达系统和原核表达系统。由 于真核表达系统如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等产生 的重组蛋白价格高、产量低，而且操作复杂、产品周期长， 而原核表达系统培养成本低、生长快、表达量高、基因操 作方便，因此，目前它们仍是基因工程的主要表达系统， 特别是大肠杆菌。
蛋白质复性(苏志国)
蛋白质的折叠复性苏志国中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室中国科学院过程工程研究所 Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences 原名：中国科学院化工冶金研究所，建立于1958年， 2001年更名3个重点实验室（2个国家重点，1个中科院重点），1个国家工程中心 职工280人，学生360人；主要方向：生化工程，清洁化工，多相反应生化工程国家重点实验室(1992) 国家生化工程技术研究中心（1996）Initial investment 4 millions USD 12 professors，16 associate professors，120 students生化工程（生物化学工程，Biochemical Engineering）生物技术化学工程生物技术产业化：突破瓶颈 化工可持续发展：建立新过程研究领域1980s 1990s 2000s-医药生物技术农业生物技术生化工程 生化反应过程工业生物技术生物医药 生物能源 生物材料 生物化学品 其它产品原料、辅料 ＋ 生物催化剂生化分离过程 生化装备与介质 流程设计与优化过程的基本规律和集成优化美国生物技术产品销售额趋势400 350 334 300 250 200 150 100 50 0 10 59 101 182 147 215 362亿 美 元平均增长率:20%，融资增长率：20% 就业增长率：12.5%，股市平均涨幅:8.76%19 80 19 91 19 96 19 98 20 01 20 03 20 06 20 08美国各类生物技术产品销售额(2000年158.5亿美元)16%人治疗药5% 3% 2%诊断试剂 农 业特殊化合物74%非医学诊断剂资料来源：Consulting Resources Corp100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0核酸药物 细胞因子 基因治疗 抗体 溶栓药物 疫苗 激素已上市 临床中目前生物技术的最大成功 – 蛋白质药物用微生物、动物细胞生产人体药用蛋白质或疫苗载体 DNA人体 某种蛋白质 基因 转化重组体发 酵 罐 或 细 胞 培 养 罐气体克隆微生物、动物细胞某单克隆抗体的生产线—分离纯化流程复杂生物分离工段分离纯化 占总成本 60-90%分离纯化举例：剪切失活 － 泵送造成蛋白质絮凝体450 400 350 300 250 200 150 100 50 00 20 10 30Filtrate volume (ml)1 mg/ml 500ml/minNo pumping 5 min pumping 10 min pumpingMembrane filtration0.2 µFiltration time (min)干 扰 素（Interferon）IFN-α(IFN-β,γ, ω) 白细胞产生 165－166 氨基酸 4个半胱氨酸，两对二硫键 Cys1-Cys99；Cys29-Cys139 市场上销售前10名的生物药Size and shape of soluble proteinsD.S. Goodsell and A.J. Olson, TIBS 18:3 (1993) 65-68蛋白质药物生产的基本流程基因工程细胞生 物 反 应 器 离心机膜分离器（分离细胞和培养基） 胞内产品 细胞破碎机碎片分离蛋白质复性胞外产品成 品膜分离器 (I) 层析法 (I) 层析法 (II) 膜分离器 (II) 冷冻干燥或 分装蛋白质回收率变化范围100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0低值 高值回收率复性盐析膜分离层析scFv57P包涵体蛋白质的重折叠（复性）（大肠杆菌表达产物）显微镜下含scFv57P包涵体的 E. Coli 示意图包涵体伸展肽链活性蛋白质加变性剂 溶解远离变性剂后 自动折叠最常用的折叠方法 – 溶液稀释变性蛋白质稀释复性溶液 例：磷酸盐 缓冲液稀释率1:10-200不同稀释倍数和时间对复性的影响14000Specific activity (U/mg)12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 100 200 300 400200 100 10Time (min)原料：6mg/mL溶菌酶（8mol/L脲） 复性溶液0.1mol/L Tris-HCl at pH8.8, 1mol/L Urea, 3mmol/L GSH and 0.3mmol/L GSSG.不同终点浓度对蛋白质复性的影响200 180Specific activity (U/mg)160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 10040 ug/mL 60 ug/mL 80 ug/mL 100 ug/mLRefolding time (h)原料：4 mg/L SOD,50mmol/L PBS缓冲液，10mol/L脲 复性溶液：50 mmol/L PBS at pH7.4, 2 mol/L Urea and 0.1 mol/L NaCl蛋白质折叠的途径分析未折叠肽链 U U↔I1↔ I2↔· · ·↔C↕M 中间体 IA其它可能： M+M↔A M+I↔A M+C↔A I +C↔A错误M正确C絮凝A复性溶液的组成：除了缓冲盐还应该有什么？变性蛋白质稀释复性溶液 （组分X+Y+Z+。
蛋白质复性(二)
蛋白质复性的主要挑战就是创造适宜的 复性条件，最大程度地抑制聚集体的生 成，提高复性收率。
包含体蛋白的复性被认为是一种复杂的、 经验性很强的工作。
8 稀释复性
最简单，最常用，传统方法
具体模式：直接稀释复性、透析复性、 流加复性
1）直接稀释复性：将变性蛋白质溶液直 接稀释到适宜的复性缓冲液中
复性剂的最佳浓度或浓度范围与蛋白质种类和浓度 有关
常需更长的复性操作时间
选用复性方法的原则：在包含体蛋白质的复性中， 若利用盐酸胍或尿素溶解包含体，应首先考虑通 过调节盐酸胍或尿素的浓度来获得满意的复性效 果。只有在复性效果不佳的情况下才考虑其他添 加剂。
表面活性剂、添加剂的去除是必须考虑的问题。
1 包含体的分离纯化
从细胞破碎开始，常采用机械破碎、化 学裂解、酶解或联用
离心沉降是常用的分离手段 膜分离也可以用于包含体的分离回收 用适宜的缓冲液对包含体进行洗涤
分离纯化注意事项
包含体的纯度对于复性收率影响显著 （包含体的纯度对复性收率的影响？）
对于特定的表达系统和表达产物，需根 据具体情况进行纯化过程开发实验，确 定适宜的纯化方案
蛋白质复性（二）
本章内容
包含体的形成和性质 包含体的纯化和溶解 稀释复性、辅助因子的作用 分子伴侣和人工分子伴侣
本章重点
蛋白质复性的概念 包含体的概念及性质 蛋白质折叠的简化动力学模型（形成的机理） 包含体体内抑制策略 包含体分离纯化的一般方法和步骤 包含体的溶解方法 稀释复性的原理 蛋白质复性中常用的辅助因子及其作用
信息，变性的蛋白质在一定条件下可以完全自 发地恢复活性。 变性蛋白质溶解在高浓度变性剂中，降低变性 剂浓度至非变性浓度范围，就可引发蛋白质折 叠复性。
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白质复性方法及其注意事项蛋白前期准备（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。
（3）透析Buffer的选择可参考文献。
蛋白复性包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。
包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。
这里主要考虑第二种方案。
包涵体的洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。
超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。
包涵体的溶解1、对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
蛋白的变性和复性
蛋白的变性和复性变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。
蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。
变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。
引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。
化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。
不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。
蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。
生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。
（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。
（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回：包涵体复性常见问题分析与解决包涵体的纯化和复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。
蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤：包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。
此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。
包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。
盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体。
SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。
另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。
这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。
二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比尿素（8-10M）较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍（6-8M）溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。
蛋白质复性
重组包涵体蛋白质复性邹平基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。
重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。
但外源基因在E.coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。
随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。
一、包涵体蛋白1、包涵体的形成包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键不能正确的配对、过多的蛋白间的非特异性结合、蛋白质无法达到足够的溶解度等；重组蛋白质的一级结构也与包涵体形成有关，一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关；重组蛋白所处的环境不适，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时易形成包涵体。
2、减少包涵体形成的策略降低重组菌的生长温度，是减少包涵体形成的最常用的方法。
低生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平低，也可减少包涵体的形成。
在培养重组菌中供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧充足、合适pH等，以减少包涵体的形成。
添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，增加细胞的渗透压。
在低的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白表达量，也可减少包涵体的形成。
利用硫氧还蛋白融合表达或与目标蛋白共表达，得到可溶性目的蛋白。
筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白可溶。
3、包涵体破菌、分离、洗涤常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞 ,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。
包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分会影响包涵体蛋白的复性，故去折叠前应洗涤包涵体，以去除杂质。
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蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白前期准备
（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。
（3）透析Buffer的选择可参考文献。
蛋白复性
包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。
包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。
这里主要考虑第二种方案。
包涵体的洗涤
破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。
超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装
40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。
包涵体的溶解
1、对于尿素和盐酸胍的选择：
尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。
但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
2、去垢剂：
温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。
问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。
包涵体的复性
1复性：
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折
叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。
2复性的效率：
复性是一个非常复杂的过程，蛋白质的复性效率在20%左右。
影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。
4、复性中常采用的方法有：
稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。
透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，缺点是易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺
点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。
复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确定！
包涵体的复性还要注意以下几点：
1.首先要获得较高纯度的包涵体。
2.包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。
3.复性前后均要离心
4.复性不能太快.
5.纯化的最佳条件要摸索和结合相关文献。
6.变性蛋白的浓度
浓度不要太高，一般0.4-0.5mg/ml 左右较适宜，若浓度高了，可稀释至适宜浓度。
有些蛋白可能更低，此时需要结合文献和实践，确定最佳浓度。
要结合透析前后的浓度，如果透析液加入甘油，这需要结合浓缩比（10%甘油可浓缩20%左右）。
复性Buffer的选择
包涵体复性液配方
对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。
对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。
Tris
系统和PBS系统都没有明确的规定，这些需要你在实验过程中不断试验，确定合适的缓冲系统；复性过程主要是注意以下几个问题：
（1）最适pH值范围为8.0-9.0之间；(有时需要过酸或过碱性)
（2）温度适宜选择4℃；
（3）复性过程蛋白浓度不宜过大；（小于0.5 mg/ml为宜）
（4）复性时间一般为24-36小时；
（5）低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用。
（6）氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG等。
常用的氧化方法有：空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。
氧化还原电对（redox）：常采用GSSG/GSH（1:5-1:10），通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如DTT，如：5 mM GSSG/2 mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。
（7）复性过程的添加剂：
1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。
一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、0.4-0.6 M L-Arg：促进蛋白溶解，（成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，也可以抑制二聚体的形成。
）
3、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%-30%。
4、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。
5、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等（如分子伴侣等）很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。
6、特殊离子：如CaCl2，MgCl2等特殊的金属离子，可参与蛋白质的正确折叠，促进活性的作用。
（此时勿加入EDTA。
）
例如复性Buffer：
50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM CaCl2，0.4 M L-Arg, 2mM GSH/0.4mM GSSG,10%甘油。
透析buffer：
50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM CaCl2，2mM DTT, 10%甘油。
复性中蛋白析出！
出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈。
复性应该采取复性液浓度和pH值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔1个pH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。
此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。
（1）蛋白析出最大的可能性：蛋白浓度太高，建议稀释以后再复性；
（2）透析的盐浓度（比如urea）要平缓降低：8M-6M-2M-PBS；
(3）若加变性剂（尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M）；
（4）另外可将甘油浓度增加（范围可在≤30%），且在复性样品中也可加适量甘油；
（5）如果还不行，可以换新的复性缓冲液；
（6）纯度不够！出现纯化的目标蛋白纯度不够时，可以先过分子筛再复性；
带有二硫键蛋白的复性！
如果蛋白中存在两个以上的半胱氨酸，立即形成正确的二硫键是不可能的。
随着二硫键的数目增加（分子间与分子内的），可能的组合数目也在剧烈上升（3个二硫键就是15种可能组合，4个对应105，5个对应945等等）。
如果二硫键是正确折叠所必须的话，应该在溶解时加入一种还原性试剂（如1－10mM DTT）。
这种还原性试剂能够被复性用二硫化物置换试剂所取代。
加入二硫化物置换试剂（如氧化型＋还
原型谷胱甘肽）是为了提供氧化还原作用力。
这些试剂同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体。
这些二硫键的形成或断裂反应是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这种平衡才会被破坏。
这个过程被称作氧化型折叠。
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