家畜胚胎超低温冷冻保存的研究进展

家畜胚胎超低温冷冻保存的研究进展

蔡元1、2，张凤鸣1、2，潘红梅1、2、，陈四清1、2

(1.重庆市畜牧科学院重庆荣昌402460 .2.重庆市养猪工程技术研究中心重庆荣昌402460)

摘要：本文对家畜胚胎冷冻保护液的成分、冷冻方法、胚胎解冻方法与冷冻保护剂的脱除及最新研究进展进行了综述。

关键词：家畜；胚胎；冷冻保存

Present Research Advance in Cryopreservation of Livestock Embryos

Cai yuan1、2, Zhang fengming1 2 ,Pan hongmei1、2 ,Chengsiqing1 2

(1.Chongqing Institute of Animal Science ,Chongqing Rongchang 402460

2.Chongqing Swine engineering Research，Chongqing Rongchang 402460)

Abstract： Advances on cryoprotextive solution, freezing way, thaw way and the elimination of cryoprotective solution and recent situation in livestock embryos were reviewed in this paper. Key words：Livestock；Embryo；Cryopreservation

家畜胚胎的超低温冷冻保存技术不仅为动物种质资源的保存和良种家畜的国际交流提供了简单有效的手段,而且还是胚胎移植、体外受精、转基因和克隆等胚胎生物技术不可分割的组成部分。自从1972年,英国学者Whittingham等人首次冷冻保存小鼠胚胎获得成功后[1]，到目前已经在20多种哺乳动物上获得成功，奶牛、黄牛、山羊、绵羊、马、兔和小鼠等的冷冻胚胎已得到较广泛的使用[2-3]，特别是牛和羊的胚胎冷冻保存研究进展很快，其冷冻胚胎已经走向商品化应用。目前人们对冷冻保存原理、冷冻保存的因素和冷冻方法进行了广泛的研究并取得了巨大进步。

1、抗冻保护剂和冷冻溶液

在哺乳动物的胚胎冷冻过程中，加入抗冻保护剂的目的是为了防止冰晶的形成。抗冻保护剂常可分为三类：(1)细胞内液抗冻保护剂。常用低分子量可渗性物质，例如甲醇、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)等；(2)细胞外液抗冻保护剂。常用低分子量不可渗性物质，例如半乳糖(Galactose)、蔗糖(Sucrose)、海藻糖(Trchaose)、聚蔗糖(Ficoll)等。（3）大分子量不可渗性物质，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)，羟乙基淀粉及其它一些聚合物。

在实际应用中，缓慢冷冻法经常只使用一种抗冻保护剂，如甘油或乙二醇等，而快速冷冻和玻璃化冷冻常应用多种抗冻保护剂，如甘油和丙二醇、甘油和乙二醇或者乙二醇和丙二醇，再加入葡萄糖、蔗糖或半乳糖。甘油可调节细胞脱水并保护蛋白结构，而糖类，例如海藻糖可以保持膜结构，甘油本身并不能保持细胞膜结构，而且在高浓度和高温下可以诱发膜融合，因此解冻后需尽快除去甘油。这些不同低温保护液的特性表明，他们是以不同方法来保持胚胎细胞免受冷冻损伤，有效的低温保护液应将各种低温保护剂

有机结合起来。

2、冷冻方法

自从哺乳动物胚胎冷冻保存成功以来，研究者从冷冻速度、解冻速度和操作程序等方面进行了改进，目前主要由常规冷冻法、直接冷冻法和玻璃化冷冻法。

2.1常规冷冻法

该方法是Whittingham首次成功应用在小鼠卵母细胞低温保存时建立起来的方法。随后研究者不断完善该方法，目前已被广泛采用。一般G、DMSO 和EG 等作为冷冻保护剂。在冷冻的初始阶段, 分三或四步将胚胎浸入浓度由低到高的冷冻保护剂中, 每步间隔10min, 使保护剂充分渗入胚胎细胞。有的研究者把保护剂的添加由三步或四步减为一步, 即直接将胚胎放入含最终浓度的保护剂中, 经比较这两种方法差异不显著。其冷冻程序一般为: 胚胎先以1℃/min 的速度由室温降至- 7℃, 植冰, 然后以0.1- 0.5℃/min 降温至-35℃, 平衡10min 后, 投入液氮保存。植冰使细胞外保护剂冻结, 胚胎慢慢冷却并开始脱水收缩。当温度降至-15℃时, 胚胎细胞体积收缩50% , 降至- 20℃时收缩60%。慢速冷冻使胚胎过度脱水, 必须采用缓慢解冻法使胚胎复原, 提高其存活率[4]。

2.2直接冷冻法

直接冷冻法也叫一步细管法，就是冷冻胚胎解冻后,将细管内的溶液混合静置,然后可直接移植的冷冻胚胎保存方法。1982年Niemonn 等用蔗糖二步清除防冻剂的方法,法国的Renard 等对此进行了改进,采用0.125mol/L 蔗糖液一步清除法。此后不久,Leibo 等提出了在胚胎解冻后,不需分几步洗脱防冻剂,可直接移植的一步吸管法,该法特别在现场给受体母牛移植时,操作十分简便。阳年生等对胚胎一步脱除防冻剂的冷冻方法也进行了深入的研究[5]。贺文杰等1998年应用一步解冻法对奶牛胚胎解冻取得了33.13%的移植受胎率[6]。

2.3玻璃化冷冻法

玻璃化冷冻法是将胚胎在适当的冷冻保护剂混合液中做短暂处理后,直接投入液氮。它是根据物理学原理,将高浓度的低温保护剂在超低温环境下凝固,形成无规则的玻璃化固体,这种固态物质能保持液态时的正常分子与离子分布,因而在细胞内发生玻璃化起到保护作用。Rall 和Fathy[7]首次报道了用玻璃化方法来冷冻保存小鼠胚胎。这种方法不仅大大简化了冷冻过程,而且减少了由于细胞冰晶形成所引起的一系列物理及化学损伤。此外,这种方法采用迅速通过临界温度区,从而减轻了一些动物胚胎冷冻中常见的冻伤现象。玻璃化冷冻过程中必须有至少一种渗透性冷冻保护剂(如DMS0、PG、EG、PROH等)，而且浓度要在5～8mol/L，还需要非渗透性冷冻保护剂如蔗糖等。降温速度越快越好，操作一定要迅速。目前，玻璃化冷冻方法已有好多种。如按照冷冻过程中使用工具的不同可分为细管法、微滴法、电子显微镜铜网法（electron microscopic grid,EMG)[8]、开放式拉长塑料细管法(0pen pulled straw,0PS)[9]、低温环法（Cryoloop）[10]、玻璃微细管法(glass micropipette,GMP)、微型冷冻瓶法(cryovial)[11]。