秋水仙素浸泡法对黑果腺肋花楸多倍体的诱导及初步鉴定

秋水仙素浸泡法对黑果腺肋花楸多倍体的诱导及初步鉴定李建勋;巴蕾;于欢;于敏;刘冰;吴荣哲

【摘要】以黑果腺肋花楸组培苗茎尖、叶片和继代愈伤组织为材料,探索秋水仙素不同浓度和不同处理时间对不同外植体诱导的愈伤组织的存活率、再生芽数、增殖系数和多倍体发生的影响;并对秋水仙素处理后不同外植体诱导产生的再生植株,经3次继代培养后生长30 d的植株的染色体倍性进行镜检.结果表明:不同外植体的存活率和出芽率随秋水仙素浓度的增高和处理时间延长而降低;其中,黑果腺肋花楸愈伤组织的存活率高于茎尖和叶片.经秋水仙素处理后,3种外植体均能诱导多倍体发生;处理浓度和时间的增加有利于提高染色体加倍率,但外植体的死亡率随之增加.当愈伤组织在秋水仙素浓度为2 000 mg/L,处理24 h时,叶片愈伤组织增殖系数为2.4,存活率为52％.以植株矮化和茎秆粗壮为依据筛选的再生植株中鉴定出47株假定多倍体,但大多为混倍体(嵌合体).叶片诱导的愈伤组织,经1 500 mg/L秋水仙素浸泡处理24 h后,诱导再生的生根植株中获得1株整株均一加倍的四倍体植株.【期刊名称】《延边大学农学学报》

【年(卷),期】2017(039)001

【总页数】8页(P1-8)

【关键词】黑果腺肋花楸;多倍体;秋水仙素;浸泡法

【作者】李建勋;巴蕾;于欢;于敏;刘冰;吴荣哲

【作者单位】延边大学农学院,吉林延吉133002;延边大学农学院,吉林延吉133002;延边大学农学院,吉林延吉133002;延边大学农学院,吉林延吉133002;延边大学农学院,吉林延吉133002;延边大学农学院,吉林延吉133002

【正文语种】中文

【中图分类】S663.9

黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa Elliot)系蔷薇科腺肋花楸属多年生落叶灌木[1]；该树种在食用、药用、园林和生态等领域均有普遍应用。其果实含有1%～2%的花青素、0.25%～0.35%的黄酮类物质、1%～2%的多酚，各种功能性物质含量丰富，对人体的各个器官都有良好的保护作用，具有多种保健功效[2-3]。近年来，随着人们对黑果腺肋花楸认识的增加，需求量也逐年增加。然而，由于黑果腺肋花楸果实小且有籽，仅依靠常规栽培手段很难满足市场需求。

人工诱导多倍体的研究开始于20世纪初[4]。开始时，多数采用物理方法，诱变率低。直到1937年，Blakes和Avery发现秋水仙素能够诱导曼佗罗染色体加倍，

在技术上解决了细胞染色体加倍的问题，大大推动了人工诱导多倍体的研究，使之成为植物育种的重要手段[5]。目前，多倍体诱导的难点在于多倍体鉴定，关于多

倍体鉴定主要有染色体鉴定法，包括染色体制片法、流式细胞仪鉴定、染色中心直径和异染色质数目鉴定法。其中,染色体制片法是进行细胞倍性鉴定最直接、最可

靠的方法，计数准确，而且不需要复杂的实验仪器，是目前应用最多的鉴定方法[6]。

由于多倍体不仅使植株器官和细胞体积增大，而且基因剂量和细胞内代谢活动也随染色体倍性的增加而提高，各种代谢产物的含量也增加。若能育出黑果腺肋花楸多倍体品种，不仅有利于改善其果实的品质，而且将有利于大幅度提高其果实花青素等活性物质的含量。本试验采用化学方法结合组织培养技术进行黑果腺肋花楸多倍体诱导，以期获得产量高、药用活性物质增加的多倍体植株，尽而探究诱导过程中黑果腺肋花楸倍性调控机制，为我国培育优良品种提供种质资源，这对扩大黑果腺肋花楸种植面积、满足市场需求具有一定的意义和价值。

1.1 材料

以取自延边大学农学院有机型无土栽培实验室的黑果腺肋花楸组培苗茎尖、叶片、愈伤组织为材料，诱导多倍体发生和植株再生。

1.2 方法

1.2.1 黑果腺肋花楸多倍体诱导

1) 以组培苗茎尖为外植体诱导无菌条件下，选取长势相同的幼嫩植株茎尖1 cm,浸泡于不同浓度、经高压灭菌的秋水仙素溶液中；浓度梯度设置为500、1 000、1 500和2 000 mg/L，并加入二甲基亚砜1 mL/L；浸泡时间分别为12、24、36和48 h。每个处理分别编号。培养30 d后，统计平均再生芽数和存活率。

2) 以组培苗叶片为外植体诱导选取黑果腺肋花楸组培苗顶端叶片，浸泡于添加有二甲基亚砜1 mL/L的500、1 000、1 500和2 000 mg/L的秋水仙素溶液中；浸泡时间分别为12、24、36和48 h。处理样品同1)。培养30 d后，统计愈伤组织形成率、平均再生芽数和存活率。

3) 以愈伤组织为外植体诱导将材料切成4 mm×4 mm大小,放入不同浓度遮光处理的秋水仙素溶液中；浓度分别为500、1 000、1 500、2 000 mg/L，并添加二甲基亚砜1 mL/L；处理时间为12、24、36和48 h；在恒速震荡培养箱中，以100 r/min速度震荡；处理样品同1)。30 d后统计增殖系数以及存活率。

1.2.2 黑果腺肋花楸多倍体初步鉴定

1) 再生植株形态鉴定法将黑果腺肋花楸茎尖处理所诱导的再生植株接种于MS + BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L[7]的培养基中，经过3次继代生长30 d后测量株高、茎粗、节间长度，叶长和叶宽则采用扫描仪LC 2400P扫描，经winfolia 2012a for leaf anailsis分析，初步确定变异植株的出现范围。

2) 再生植株细胞学鉴定法在显微镜16×10(mm)的视野下记录气孔数目并鉴定叶

片气孔的密度；用目镜测微尺测量保卫细胞的大小(包括长度和宽度)；在

16×10(mm)的视野下记录保卫细胞中叶绿体数目，并计算变异率。

变异率(%)=(保卫细胞叶绿体数12个以上的细胞个数/保卫细胞总观测个数)×100% 3) 根尖染色体计数法将变异体接种于1/2MS+IBA 0.6 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂

8 g/L[8]培养基，待 2 周后生长到3 cm时，早晨9:30 取根尖、编号，浸泡于冰

水中。用刘迎春[9]方法进行镜检染色体数目。

1.3 数据分析

试验采用完全随机设计法，数据采用 Excel 2007和 SPSS 16.0软件的Duncan检验和方差分析进行差异显著性分析，显著水平P≤0.05。

2.1 黑果腺肋花楸多倍体的诱导

2.1.1 黑果腺肋花楸组培苗茎尖多倍体诱导

从秋水仙素浸泡浓度和时间对黑果腺肋花楸组培苗茎尖生长的影响来看，不同的处理浓度和处理时间对组培苗的存活率具有一定影响，外植体的存活率随秋水仙素浓度的增高和处理时间延长而逐渐降低(表1)。

当处理浓度为500 mg/L时，组培苗存活率均大于80%；当浓度上升到 2 000

mg/L时，组培苗茎尖有部分变为褐色，且存活率明显降低。秋水仙素处理的时间超过30 h时，组培苗茎尖长势普遍降低，且当时间达到48 h时，外植体处于停

止生长状态。当秋水仙素浓度为1 500 mg/L、处理时间为36 h时，平均再生芽

数为8.5个，存活率为51.3%，接近于半致死剂量。

2.1.2 黑果腺肋花楸组培苗幼嫩叶片多倍体诱导

当诱导材料为植株顶端幼嫩叶片时，秋水仙素浸泡对叶片的生长有一定影响(表2)。随着秋水仙素浓度和处理时间的增加，黑果腺肋花楸叶片存活率呈现显著下降趋势，经处理的存活叶片较大一部分会形成愈伤组织，且能分化出芽。当浓度为2 000 mg/L,浸泡48 h时，叶片愈伤组织形成率、存活率均最低。经秋水仙素浸泡处理