紫外和荧光分光光度计..
各种分光光度计主要参数简介
荧光分光光度计【RF-5301PC SHIMADZU(津岛)公司】：英文名称：spectrofluorophotometer;fluorescencespectrophotometer;spe ctrofluorometer;spectroflurimeter主要技术参数：1. 测定波长范围：220~750nm及白色光2. 带宽：1.5,3,5,10,2Onm3. 灵敏度：S/N比150以上(带宽5nm水拉曼峰时)4.测定方式：荧光、激励、同期光谱测定、定量测定、时间过程测定功能及特点：1. 荧光发射光谱选择某一固定波长的光激发样品，记录样品中产生的荧光发射强度与发射波长间的函数关系，即得荧光发射光谱。
2. 荧光激发光谱选定某一荧光发射波长记录荧光发射强度作为激发光波长的函数，即得荧光激发光谱。
3. 时间分辨技术；可用于对混合物中光谱重叠但有寿命差异的组分进行分辨并分别测量。
时间分辨荧光测定公式如下：P(t) = P0 EXP (-t / T )式中P(t):拟合指数函数P0:强度取值检测器高灵敏度、宽光谱范围光电倍增管EXP 指数运算符t :时间取值T :荧光平均时间寿命原子吸收分光光度计【WFX-1F2B2 北京瑞德分析仪器公司】 英文 名称：atomic absorption spectrophotometer和279.8nm ）且谷峰能量比＜30% 4、基线稳定性 < 0.003A/30mi n5、光源系统 灯电流调节微机自动调节并显示,宽脉冲0~25mA 能量自动平衡微机自动调整负咼压并平衡能量 6、光学系统单色仪Czerny — Turner 型光栅单色仪 光栅刻线1800 条 /mm 焦距 400mm闪耀波长250nm 光谱宽带 0.1 nm、0.2nm 、0.4nm 、2nm 7、检测与数据处理系统主要技术参数:1、 波长范围2、 波长准确度190 900nm 优于士 0.25nm 3、分辨率光谱带宽0.2nm 时分开锰双线（279.5nm检测器 高灵敏度、宽光谱范围光电倍增管全塑雾化室 高效玻璃喷雾器8特征浓度和检出限普通空气一乙炔火焰特征浓度Cu:<0.025mg/L ,检出限< 0.006mg/L 9、功能及应用：一、火焰原子吸收分光光度计，利用空气一乙炔测定的 元 素可达30多种，若使用氧化亚氮一乙炔火焰，测定的元素可达 70多种。
紫外分光光度计及荧光积分球
前言：在分光光度计中，一个是作为检测器用的光电倍增管，另一个是作为附件用的积分球，两者看似没有直接的联系，实际上，积分球的问世和使用正是弥补了光电倍增管在检测多样化样品时的自身缺陷。
而对于积分球检测器这种附件，许多仪器使用者了解甚少，甚至没有听说过。
为此，本文针对这两者的关系做一简单介绍，以飨读者。
1．光电倍增管的使用：光电倍增管英文名称是photomultiplier tube，简称PTM。
在目前的一些双光束分光光度计中经常使用光电倍增管作为检测器。
由于光电倍增管具有灵敏度高，噪声低及响应速度快的特点，所以被广泛地应用在许多光学仪器中作为检测器，这是众所周知的常识。
2．光电倍增管的结构：光电倍增管有侧窗式和端窗式两种，在实际应用范围里又以侧窗式居多，因此、本文以R 928型侧窗式光电倍增管为例加以介绍。
R928型光电倍增管有11个电极，分别为：1个光阴极（Ｋ），9个倍增极，也称打拿极（D Y）和1个阳极（P）；外观图和内部图如图－1，图－2所示：图－1、R928型光电倍增管外观图图－2、R928型光电倍增管内部结构顶视图3．光电倍增管的简单工作原理：当入射的检测光信号（S/R）照射到光阴极（K）后，光阴极向真空中激发出光电子。
这些光电子首先进入倍增系统的第一个打拿极DY1，然后通过进一步的二次电子发射，逐级通过其余的8个打拿极（DY2～DY9）而得到递增式的倍增放大；最后这些被多次放大后的电子被阳极（P）收集作为信号输出。
图－3是R928电极排列及供电电路示意图：图－3、R928电极排列及供电电路示意图4．光电倍增管灵敏度特性的分析：虽然光电倍增管有许多优点，但暇不掩玉，该器件自身也有两个致命的缺陷；①灵敏度因强光照射（这也就是为何仪器在通电的情况下样品室盖子不能打开的原因）或因照射时间过长而降低，停止照射后又部分地恢复；鉴于光电倍增管的这种特性致使它随着使用时间的累加，灵敏度会逐渐下降（一般从长波长开始下降，俗称“红外紫移”）且噪声输出却逐渐加大，直至被弃用。
紫外、荧光分光光度计说明
一、设备名称：RF-5301PC荧光分光光度计；二、使用原理1、荧光分光光度计由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。
荧光是光致发光，任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱，发射波长总是大于激发波长。
荧光激发光谱是通过测定荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱，反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。
荧光发射光谱是当荧光物质在固定的激发光源照射后所产生的分子荧光，是荧光强度对发射波长的关系曲线，表示在所发射的荧光中各种波长相对强度。
由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长，可用它来鉴定荧光物质。
有些发荧光的物质其荧光强度与物质的浓度成正比，故可用荧光分光光度法测定其含量。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
利用某些物质受激发出的荧光，其光强度与该物质的含量成一定函数关系的性质而制成的。
三、组成结构光源、光件、样品池、检测器、数据处理器1、荧光分光光度计图RF5301PC荧光分光光度计主要是由激发光源、激发单色器、样品池、发射单色器、检测器以及数据处理系统几部分组成1. 光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。
2．激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
3．发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
4．样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
一、荧光分光光度计配置及参数(进口)
技术参数：*1、单色器：机刻凹面衍射光栅,900g/mm,F2.2校正像差，且可见光区高的光通量,提高检测灵敏度。
2、闪跃波长：激发300nm，发射400nm。
*3、检测器测量波长范围：200~750nm和零次光；带自增益功能：连续可调（0-1000V）4、分辨率：最低分辨率1.0nm。
5、波长准确度：最低要求±1.0nm。
*6、波长扫描速度：30~60000nm/min，调节步距1nm，亦可按时间收集数据。
7、光谱带宽：EX：1，2.5，5，10，20nm；EM：1，2.5，5，10，20nm8、光源：150w连续光源氙灯。
*9、水平狭缝，最小试样体积：0.6mL(使用标准10mm池)，微量池最小体积0.2ml。
*10、水拉曼检测激发波长350nm，带宽5nm，响应时间2.0s，取水拉曼峰处噪声，灵敏度大于800：1（RMS）；11、可进行时间扫描和定量分析，三维荧光图谱。
*12、具有全波长预扫描功能，能自动、快速地寻找到最佳的激发和发射波长。
*13、线性动态范围：6个数量级；14、全波段的光谱校正，排除仪器的依赖性，确保高精度的数据。
15、控制系统和软件15.1计算机一台：计算机配置不低于i3处理器、2GB内存、500GB硬盘、DVD可刻录光驱、22英寸LED显示器，Windows7操作系统。
15.2分析软件：定性及定量分析软件，以及与此有关的应用分析软件。
16、固体支架：配套的标准固体支架。
17、恒温样品支架17.1、冷却循环水系统：与仪器标配套的标准的国产冷却循环水系统。
18、滤光片1套，带通滤光片250-390nm，低通截止滤光片，295、320、370、395、420nm19、氙灯1支20、激光打印机1台，满足仪器使用。
21、附件、配件按正常实验配齐，安装调试后能够正常进行实验。
技术参数1 技术规格1.1 电源电压：220V，50Hz1.2 温度：10~35℃1.3 相对湿度：45~85%2 现场免费培训，各项性能指标达到技术要求，由供需双方共同签字认可，现场验收，仪器验收合格后，供方须提供整机一年免费保修，并提供终身维修服务。
紫外分光光度计
紫外分光光度计：工作原理：物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。
由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同。
因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。
分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。
又因为许多物质在紫外-可见光区有特征吸收峰，所以可用紫外分光光度法对这些物质分别进行测定（定量分析和定性分析）。
紫外分光光度法使用基于朗伯-比耳定律。
利用物质的分子或离子对某一波长范围光的吸收作用，对物质进行定性、定量分析以及结构分析。
紫外分光光度法首先确定实验条件，并在此条件下测得标准物质的吸收峰以及其对应波长值（同时可获得该物质的最大吸收波长）；再在选定的波长范围内（或最大波长值处），分别以（不同浓度）标准溶液的吸光度和溶液浓度为横、纵坐标绘出化合物溶液的标准曲线得到其所对应的数学方程；接着在相同实验条件下配制待测溶液，测得待测溶液的吸光度，最后用已获得的标准曲线方程求出待测溶液中所需测定的化合物的含量。
使用范围：凡具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物，根据在特定吸收波长处所测得的吸收度，可用于药品的鉴别、纯度检查及含量测定。
分光光度法只适用于微量组分的定量分析(稀溶液，浓度在线性范围内，（c ＜0.01 mol/L)，浓溶液中光吸收定律将发生偏离，最适宜的吸光度测量范围为0.2-0.8之间（此时误差小）。
波长范围：可见-紫外分光光度计。
其应用波长范围为200～400nm的紫外光区、400～850nm的可见光区。
主要由辐射源（光源）、色散系统、检测系统、吸收池、数据处理机、自动记录器及显示器等部件组成。
光源：在仪器的波长范围内提供足够的、稳定的连续的光。
紫外分光光度法和荧光分析法..
波长紫外可见分光光度计
主要应用
1、药物的杂质检查
利用药物与杂质对光的选择性吸收性质的差异，若药物在杂质的 最大吸收波长处没有吸收，则可在此波长处测样品溶液的吸收度，通 过控制样品溶液吸收度来控制杂质的量。 例：地蒽酚中二羟基蒽醌的检查 二羟基蒽醌的三氯甲烷溶液 在432nm处有最大吸收，而 地蒽酚在该处几乎无吸收。
双波长分光光度法
不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两
束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1 作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收 较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、 选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提 高。 ΔＡ＝A λ2 －A λ1 ＝（ελ2 －ελ1 ) b c 两波长处测得的吸光度差值ΔＡ与待测组分浓度 成正比 （例子：课本366页）
在溶液中，当荧光物质 的浓度较低时,其荧光强 度与该物质的浓度通常 有良好的正比关系,即
IF=KC
光照 分子基态 辐射跃迁 荧光 激发态
若光源是：
由荧光波长可确定物质分子 可见-紫外光源 分子荧光分析法 具有结构 由荧光强度可测物质的含量 原子特征光谱作光源 原子荧光分析 X射线作光源 X射线荧光分析
其他
卡尔曼滤波法
偏最小二乘法 小波变换
三波长分光光度法
系数倍率法
……
原理 与紫外-可见法异同点
应用
原理
荧光 — 分子吸收电磁波后，从其最低激发 态重新发射紫外线或可见光的现象 利用某些物质被一定波长的光照射后所产 生的，能够反映该物质特性的荧光来进行 定性定量的分析方法——荧光分析法。
导数分光光度法
导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、
大学荧光实验报告
一、实验目的1. 掌握荧光光度计的基本原理及使用方法。
2. 了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。
3. 掌握分子荧光光度计分析物质的特征荧光光谱：激发光谱、发射光谱的测定方法。
4. 通过荧光光谱法对罗丹明B进行定性和定量分析。
二、实验原理荧光光谱法是一种基于物质分子在特定波长光照射下产生荧光现象的分析方法。
当分子吸收光能后，外层电子从基态跃迁到激发态，随后以发射荧光的形式释放能量，回到基态。
根据发射荧光的波长和强度，可以确定物质的种类和浓度。
在本实验中，我们使用罗丹明B作为研究对象。
罗丹明B是一种具有特征荧光光谱的染料，其激发光谱和发射光谱分别对应不同的波长区域。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：荧光分光光度计、紫外可见分光光度计、恒温水浴、移液器、容量瓶、试管等。
2. 试剂：罗丹明B标准溶液、乙醇、去离子水等。
四、实验步骤1. 准备罗丹明B标准溶液：根据实验要求，配制一定浓度的罗丹明B标准溶液，并稀释至所需浓度。
2. 测定激发光谱：将罗丹明B标准溶液置于荧光分光光度计样品池中，在固定发射波长下，扫描激发光波长，记录激发光谱。
3. 测定发射光谱：在固定激发波长下，扫描发射光波长，记录发射光谱。
4. 标准曲线绘制：取一定浓度的罗丹明B标准溶液，测定其荧光强度，以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
5. 样品分析：取待测样品，按照上述步骤测定其荧光强度，根据标准曲线计算样品中罗丹明B的浓度。
五、实验结果与讨论1. 激发光谱：罗丹明B的激发光谱显示，在激发波长为540nm处出现一个明显的峰，表明罗丹明B在540nm附近具有较强的吸收能力。
2. 发射光谱：罗丹明B的发射光谱显示，在发射波长为590nm处出现一个明显的峰，表明罗丹明B在590nm附近具有较强的发射能力。
3. 标准曲线：根据罗丹明B标准溶液的荧光强度和浓度，绘制标准曲线，线性关系良好。
4. 样品分析：根据待测样品的荧光强度和标准曲线，计算样品中罗丹明B的浓度为X mol/L。
紫外、荧光光度计测定甲基红的发射光谱
紫外、荧光光度计测定甲基红的发射光谱一、目的与要求1．加深对紫外可见分光光度计和荧光光度计原理的理解;2．巩固紫外可见分光光度计和荧光光度计的基本操作。
二、方法原理紫外可见分光光度计分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。
由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量。
根据Lambert-Beer定律说明光的吸收与吸收层厚度成正比，比耳定律说明光的吸收与溶液浓度成正比；如果同时考虑吸收层厚度和溶液浓度对光吸收率的影响，即得朗伯-比耳定律。
即A=εbc，(A为吸光度,ε为摩尔吸光系数，b为液池厚度，c为溶液浓度)就可以采用标准曲线法对溶液进行定量分析。
荧光光度计物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光正比关系,即If光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
激发荧光物质的激发波长的选择通常为其最大吸收波长。
紫外、荧光光度计均由5个部件组成：①辐射源。
②单色器。
③样品室。
对紫外分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。
④检测器，又称光电转换器。
⑤显示装置。
三、仪器与试剂1. PE LAMBDA 35 型紫外可见分光光度计2. F7000型荧光光度计3．试剂：甲基红、乙醇四、内容与步骤1．配制一定浓度的甲基红的乙醇溶液（约10-5 mol/L）。
分光光度计
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双光束分光光度计 经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通 过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的 透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。 双光束分光光 度计一般都能自动记录吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比池和样品池， 还能自动消除光源强度变化所引起的误差。 双波长分光光度计 由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得 到两束不同波长1和2 的单色光；利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸 收池，然后经过光电倍增管和电子控制系统，最后由显示器显示出两个波长处的吸 光度差值。对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干 扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏 度和选择性。利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。
六、紫外可见分光光度计的分析及应用
紫外可见分光光度计的定性分析 物质吸收不同波长的光的特性只与溶液中物质的结构有关，而与溶液的浓度无关不同的 物质，所得的吸收光谱曲线各不相同。因此，在分光光度法中，将吸收光谱曲线作为定性的依 据。 紫外可见分光光度计在定性分析上的应用
1,.用吸收谱图推测化合物的结构
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二、、不同类型分光光度计的特点
荧光分光光度计 荧光分光光度计的优缺点；
1.灵敏度高
个数量级。 2.定性更可靠
检测限可达10-10～10－12g/ml,比紫外可见分光光度法低3～4
荧光物质具有激发光谱和发射光光谱，可提供荧光强度、
荧光效率、荧光寿命、等多种物理参数，特征性强，较单一图谱定性更为可靠。 3.干扰因素较多 对试剂、环境等实验条件要求严格，测量精密度较差。 能产生荧光的物质相对较少，但许
紫外与荧光实验讲义
实验一绘制吸收光谱及测定摩尔吸光系数一.实验目的通过紫外吸收光谱的绘制和摩尔吸光系数的测定，掌握Agilent8453 UV-V is的使用方法。
学习导数光谱计算方法及特点。
二.实验原理1．本实验用Agilent8453型分光光度计绘制氨基酸（苯丙氨酸，色氨酸）的紫外吸收光谱，找出它的吸收峰波长并计算摩尔吸光系数。
紫外分光光度法是利用物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，波长范围为200-400nm的紫外光谱。
各种分子都有其特征的吸收光谱，即吸光度与摩尔吸光系数随波长的变化而变化的规律。
吸收光谱的形状与物质的特征有关，以此进行定性分析。
为了清楚地描述各种物质对紫外区域电磁辐射的选择性吸收的情况，往往需绘制吸收光谱曲线，即吸光度对波长的曲线。
在吸收光谱曲线上可以找到最大吸收峰波长。
根据比尔定律：A = ε b c式中A—吸光度ε—摩尔吸光系数b—液槽厚度，单位：厘米c—摩尔浓度，单位：mol/l摩尔吸光系数可按下式计算：ε=A b c实验测得的吸收光谱及摩尔吸光系数与仪器及其狭缝宽度有关。
因此实验结果须注明所用仪器的型号及缝宽条件。
2．导数分光光度法：利用紫外-可见分光光度计软件系统带有的数学处理功能，对吸收光谱进行处理，可以获得导数光谱。
利用导数光谱进行分光光度测定，称为导数分光光度法。
通常可以获得1-4阶导数光谱。
在各阶导数光谱中，吸光度对波长的微分值与溶液中组分的浓度c保持线性关系：ssd Acdλ∝。
其中s为导数的阶数。
因此，可以利用导数光谱进行定量测定。
导数光谱可用于放大图谱间差别，定性分析中分辨重叠谱带，而且还可以减少定量分析中来自散射、基体、及其它吸收物的干扰影响。
由于导数光谱灵敏度高，因此对于试样纯度检验，多组分混合物的测定，消除共存杂质的干扰和背景吸收，测定混合式样都具有特殊的优越性。
三.实验仪器和试剂1.Agilent8453 UV-Vis分光光度计;2.移液枪(德国BRAND公司生产);3.25ml容量瓶，50ml容量瓶10支;4.氨基酸储备液：色氨酸0.400 g/l，苯丙氨酸2.00 g/l;5.去离子水四.实验步骤1.波长测定（1）用氨基酸储备液及去离子水在50ml容量瓶中配置氨基酸溶液，色氨酸浓度为50mg/l, 苯丙氨酸720mg/l；（2）分别取上述溶液，用1cm石英比色皿，以水作参比溶液，在波长范围为190nm——450nm间测定他们的吸收光谱。
紫外分光光度计
4.4.2 紫外－可见分光光度计的类型
1. 单波长单光束分光光度计 缺点：受电源波动的影响较大，误差较大。
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2. 单波长双光束分光光度计
优点：消除电源电压波动的影响，减小放大器 增益的漂移，能自动扫描吸收光谱。
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3. 双波长分光光度计
优点：消除光谱干扰，可获得微 分光谱和进行系数倍率法测定。
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分子在辐射能的作用下能量的改变（ΔE）为：
ΔE=ΔEe +ΔEv +ΔEr
对多数分子而言，
ΔEe （电子）约为1-20ev，紫外可见 ΔEv （振动）约为0.05-1ev，近红外、中红外区 ΔEr （转动）小于0.05ev，远红外、微波区 ΔEe >ΔEv >ΔEr
在辐射能作用下，分子内能级间的跃迁产生的光谱称为 分子光谱。
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4.4.1 基本结构
1. 光源
功能：提供能量激发被测物质分 子，使之产生电子光谱谱带（提 供宽带辐射）。
连续光源： 紫外光区 氘灯、氢灯（气体放电光源)） 可见光区 钨丝灯、卤钨灯（热辐射光源）
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2. 单色器 功能：从光源辐射的复合光中分出单色光。
3. 吸收池 功能：盛放分析试样
氯化镨溶液的吸收光谱
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（2）d-d 跃迁
过渡金属离子的d轨道在受到配位体场的 作用时产生分裂。d电子在能级不同的d轨道 间跃迁，吸收紫外或可见光产生吸收光谱。 这种光谱的吸收带比较宽，吸收峰强烈地受 配位环境的影响。
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例：某些金属离子的吸收光谱
例：水合铜离子是浅蓝色的， 它的氨络合物却是深蓝色的。
第四章 紫外可见分光光度法
Ultraviolet-visible Spectrophotometry
荧光法实验报告
一、实验目的1. 掌握荧光法的原理和操作步骤。
2. 学会使用荧光分光光度计进行样品的定量分析。
3. 通过实验了解荧光法在物质含量测定中的应用。
二、实验原理荧光法是一种利用物质在特定波长光照射下产生的荧光现象进行定量分析的方法。
当物质分子吸收了特定波长的光子后，电子会从基态跃迁到激发态，随后在返回基态的过程中释放出能量，产生荧光。
荧光的强度与物质的浓度成正比，因此可以通过测量荧光强度来定量分析物质的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：罗丹明B标准溶液、罗丹明B样品溶液、乙醇、水等。
2. 实验仪器：荧光分光光度计、紫外可见分光光度计、移液器、容量瓶、试管等。
四、实验步骤1. 标准曲线的绘制（1）取一系列容量瓶，分别加入不同体积的罗丹明B标准溶液，用乙醇稀释至刻度线，配制成一系列不同浓度的标准溶液。
（2）使用荧光分光光度计，在激发波长和发射波长分别为530nm和580nm的条件下，测量各标准溶液的荧光强度。
（3）以罗丹明B浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品溶液的测定（1）取一定量的罗丹明B样品溶液，用乙醇稀释至刻度线，配制成待测溶液。
（2）使用荧光分光光度计，在激发波长和发射波长分别为530nm和580nm的条件下，测量待测溶液的荧光强度。
（3）根据标准曲线，计算待测溶液中罗丹明B的含量。
五、实验结果与讨论1. 标准曲线的绘制根据实验数据，绘制标准曲线，得出线性回归方程为：y = 0.0123x + 0.0045，其中y为荧光强度，x为罗丹明B浓度。
2. 样品溶液的测定根据实验数据，计算待测溶液中罗丹明B的含量为0.045mg/L。
3. 实验讨论（1）本实验采用荧光法测定罗丹明B的含量，具有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点。
（2）实验过程中，应注意标准溶液的配制、测量条件的选择等，以保证实验结果的准确性。
（3）本实验结果表明，荧光法是一种有效、可靠的罗丹明B含量测定方法。
六、实验总结通过本次实验，我们掌握了荧光法的原理和操作步骤，学会了使用荧光分光光度计进行样品的定量分析。
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较定义：紫外可见分光光度法：根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围（150～800纳米）单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法；分子荧光光度法：利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。
可以从发射光谱或激发光谱进行分析。
组成部件：紫外可见分光光度法：①辐射源。
必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米），氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。
②单色器。
它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。
③试样容器，又称吸收池。
供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。
容器的光程一般为 0.5～10厘米。
④检测器，又称光电转换器。
常用的有光电管或光电倍增管。
⑤显示装置。
这部分装置发展较快。
较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。
分子荧光光度法：激发光源、单色器、样品池、检测器和记录显示部分。
1. 光源能发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。
常用的有溴钨灯、高压汞灯、氙灯。
2. 单色器，两个单色器。
3. 样品池通常用石英制成。
4. 检测器：光电倍增管。
常见类型：紫外可见分光光度法：1.单光束。
简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。
2.双光束自动记录，快速全波段扫描。
可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。
仪器复杂，价格较高。
3.双波长。
将不同波长的两束单色光(λ、λ1 ) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。
荧光分光光度计使用说明 光度计常见问题解决方法
荧光分光光度计使用说明光度计常见问题解决方法荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能供应包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等很多物理参数荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能供应包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等很多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定,不但可以做一般的定量分析,而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化,从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190～650nm，发射波长扫描范200～800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便、工作曲线线形范围宽等优点，可以广泛应用于生命科学、医学、药学和药理学、有机和无机化学等领域。
荧光分光光度计使用说明：开机时，请先开氙灯电源，再开主机电源。
每次开机后请先确认一下一起两边排热风扇工作正常，以确保仪器正常工作，发觉风扇有故障，应停机检查。
主机工作时顶部排热器温度很高,切勿触摸,以免受伤.氙灯点亮后需确定时间稳定，故进行精密测试应在30分钟以上。
当氙灯未能触发，并连续发生“吱吱”高频声或“叭叭”打火声时，请立刻关掉氙灯电源，稍后数秒重新触发。
请尽量削减不必要的氙灯触发次数，避开氙灯在高压下反复触发。
封闭氙灯电源后，若要重新使用，请等待60秒以后重新触发。
运行未知浓度的样品测试时，灵敏度设置请从低位向高围（0—7）渐渐设置，当灵敏度较高时（>3），为了保护光电倍增管，请拥护勿将强光置进样品室内。
当（仅当）操纵者错误操纵或其他干扰引起微机错误时，应当立刻关断主机电源，重新启动，但无须关断氙灯电源。
单色器内用螺丝紧固处不得松动，光学器件和仪器运行环境需保护清洁。
清洁仪器外表时,请勿使用乙醇乙MI等有机溶剂,请勿在工作中清洁,不使用时请加防尘罩.比色皿保持清洁。
荧光分光光度计(分子荧光)
荧光分光光度计（分子荧光）Fluores_cence •1楼1、基本原理在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快通过振动弛豫、内转换等方式释放能量后下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
再由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（ex citation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluoresc ence analysis）。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
2、检测荧光的仪器测定荧光可用荧光计和荧光分光光度计，其二者的结构复杂程度不同，但其基本结构是相似的。
荧光分光光度计
荧光分光光度计Fluorescence Spectrophotometer原理及应用HITACHI F-4500一、荧光分光光度计的工作原理二、荧光分光光度计的构造三、荧光分光光度计的应用四、影响荧光分析的因素荧光光度分析法任何荧光化合物都具有两种特征光谱荧光激发光谱（吸收光谱吸收光谱））固定某一发射波长，测定该波长下的荧光发射强度随激发波长变化所得的光谱化所得的光谱。
荧光发射光谱（荧光光谱荧光光谱））固定某一激发波长，测定荧光发射强度随发射波长变化得到的光谱。
分子荧光光谱与物质本身的结构有关，荧光强度的大小与物质的含量有关，利用物质荧光光谱的形状和强度的大小即可对物质进行定性和定量的分析。
工作原理定性分析::定性分析将未知物测定到的光谱参数与已知化合物进行比较,从而确定未知物的基本性质。
不同物质，由于其分子结构的不同，其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱，因此，可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
定量分析::定量分析利用荧光分子发射荧光的强弱进行定量测定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时，其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系，利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析。
荧光分析的特点专一性强:利用荧光物质的发光性质来检测其发射光谱，使测定的物质更具有特性。
灵敏度高:测定同样浓度物质的含量,通常比吸收光谱灵敏度高2-4个数量级，可检测出10-12克数量级的物质。
选择性强:可分析发射光谱,也可分析激发光谱。
如果某几个物质的发射光谱相似，难以做出判断，就可以测量其激发光谱。
发光方式多:物理、化学、生物发光。
可分析参数多:荧光光谱、荧光强度、荧光效率、荧光寿命等。
荧光分光光度计的构造光源要求:在全波长范围提供恒定连续的光强，低噪声，使用寿命长，稳定性好，足够的输出功率。
紫外光源:氢灯----190-360nm氘灯----180-500nm(辐射能量强度大,使用寿命长,较常用)可见光源:钨灯----320-2500nm钠灯----400-1000nm紫外-可见兼用:氙灯----180-1000nm分光光度计的光源装置:反射聚光系统(J (J光源灯光源灯光源灯，，M2平面镜平面镜，，M1M1球面镜球面镜球面镜，，F 消除杂散光的滤光片消除杂散光的滤光片))光源的稳定性影响测量的重复性和精确度光源的强度影响测量的灵敏度单色器在辐射能的照射下，能够将连续复合光源分解成单一波长的单色光或者具有一定宽度谱带的分光器，称为单色器。
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较定义：紫外可见分光光度法：根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围（150～800纳米）单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法；分子荧光光度法：利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。
可以从发射光谱或激发光谱进行分析。
组成部件：紫外可见分光光度法：①辐射源。
必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米），氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。
②单色器。
它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。
③试样容器，又称吸收池。
供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。
容器的光程一般为 0.5～10厘米。
④检测器，又称光电转换器。
常用的有光电管或光电倍增管。
⑤显示装置。
这部分装置发展较快。
较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。
分子荧光光度法：激发光源、单色器、样品池、检测器和记录显示部分。
1. 光源能发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。
常用的有溴钨灯、高压汞灯、氙灯。
2. 单色器，两个单色器。
3. 样品池通常用石英制成。
4. 检测器：光电倍增管。
常见类型：紫外可见分光光度法：1.单光束。
简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。
2.双光束自动记录，快速全波段扫描。
可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。
仪器复杂，价格较高。
3.双波长。
将不同波长的两束单色光(λ1、λ) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。
仪器分析作业：荧光、紫外、红外
傅立叶变换红外光谱仪曹文芳 1014061420一、仪器结构傅立叶变换红外光谱仪的工作原理图固定平面镜、分光器和可调凹面镜组成傅立叶变换红外光谱仪的核心部件－迈克尔干涉仪。
由光源发出的红外光经过固定平面镜反射镜后，由分光器分为两束：50％的光透射到可调凹面镜，另外50％的光反射到固定平面镜。
可调凹面镜移动至两束光光程差为半波长的偶数倍时，这两束光发生相长干涉，干涉图由红外检测器获得，经过计算机傅立叶变换处理后得到红外光谱图。
IRPresting-21型傅立叶变换红外光谱仪具300入射迈克尔逊密闭型干涉仪，单光束光学系统，空冷陶瓷光源，镀锗KBr基片分束器，温度可调的DLATGS 检测器，波数范围7,800～350cm-1，S/N大于40,000∶1（4 cm-1，1分钟，2,100 cm-1附近，P—P），具有自诊断功能和状态监控器。
可收集中红外、近红外、远红外范围光谱。
二、实验原理原理概述：红外吸收光谱分析方法主要是依据分子内部原子间的相对振动和分子转动等信息进行测定。
一束具有连续波长的红外光通过物质，物质分子中某个基团的振动频率或转动频率和红外光的频率一样时，分子就吸收能量由原来的基态振(转)动能级跃迁到能量较高的振(转)动能级，分子吸收红外辐射后发生振动和转动能级的跃迁，该处波长的光就被物质吸收。
所以，红外光谱法实质上是一种根据分子内部原子间的相对振动和分子转动等信息来确定物质分子结构和鉴别化合物的分析方法。
将分子吸收红外光的情况用仪器记录下来，就得到红外光谱图。
红外光谱图通常用波长(λ)或波数(σ)为横坐标，表示吸收峰的位置，用透光率(T%)或者吸光度(A)为纵坐标，表示吸收强度。
三、操作步骤1 、开机前准备开机前检查实验室电源、温度和湿度等环境条件，当电压稳定，室温为21±5℃左右，湿度≤65%时才能开机。
2、开机始终保持红外光谱仪右下侧黄色灯亮（除湿器指示灯）；开机时，首先打开右下侧仪器电源开关，此时绿灯亮，稳定半小时，使得仪器能量达到最佳状态。
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检测器：（光电检测器）
常见：光电池、光电管、光电倍增管和光电二极管阵列。
放大装置、转换器和记录仪：
将测量信息放大、显示并输出的装置。
单光束紫外可见分光光度计：
双光束紫外可见分光光度计：
光源—吸收池—单色器—DAD检测器—数据转换记录 全谱分析
偏离朗伯—比尔定律的因素：
在镀铝玻璃表面刻有数量 很大的等宽度等间距条痕
(600、1200、2400条/mm ) 特点：波长范围宽、色散均匀、分
辨性能好、使用方便。
平面 透射 光栅
透 镜
光屏
M1
分光原理： 光通过光栅， 发生衍射和干 涉而分光
M2
光栅衍射示意图
出 射 狭 缝
样品室
样品室：容纳各种光径的吸收池的装置和附件。 比色池：如：普通比色池、微量池、流动池等。
定波长或多波长测定
时间扫描 拟合运算功能 输出（强大的Excel 表格 输出） 液体样品
磷光分析
时间分辨（荧光寿命） 拟合运算功能 输出（强大的Excel 表格 输出） 液体、固体样品
荧光猝灭
猝灭：非光辐射跃迁 浓度猝灭：临界浓度 温度猝灭：T℃↑，发光强度降低
检测器：光电管或光电倍增管。可将光信号放大并转为电信号。
荧光光谱仪工作原理示意图
相对应该强度
紫外-可见与荧光分光光度计工作原理区别：
其它附属设施
控温系统和装置 停留装置 固体样品架
仪器功能
VU—Vis仪
荧光光谱仪
光谱扫描（Em、Ex） 时间扫描 同步荧光和共振荧光
光谱扫描（吸收、透光率、 能量）
紫外和荧光分光光度计工作原理
紫外—可见分光光度计
基本结构：六个基本部分组成
光源
单色器
比色室
检测器
显示装置
放大器
光源：
发出所需波长范围内连续光谱，有足够光强度,稳定； 所用灯的不同提供光的区间范围也不同。
可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)
紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)
DAD检测器的灵敏度比通常的UA检测器约低一个数量级。
单纯用于含量测定或杂质检查时，还是采用UA检测器为好。
F-4500 荧光分光光谱仪（日本 Hitachi）
荧光分光光谱仪
工作原理：光源的激发光照射到样品池中，激发样品中的荧光物质
发出荧光，被光电倍增管接受，最后以图或数字的形式显示出来。
什么情况下浓度的相对误差△C/C最小？ 当T%=36.8%（A=0.456）时, 测量所引起 的相对误差最小。 T=20%-65%，A=0.2~0.8之间进行测量, 相对测量误差较小.
减少误差的方法 采取调节光径与浓度C的办法减少误差 差示光谱法（低浓度、高浓度）
T
3、光的反射
朗伯—比尔定律在推导过程中，曾经忽略了溶液对光的反射作用。
猝灭公式：
小结
紫外和荧光分光光度计 工作原理和功能
如果溶液和溶剂对光的反射有较大的差异，就会引起比尔定律的偏
离。
为了消除误差，要尽可能地使参比溶液与样品溶液的组成接近。
4、其它因素的影响：
检测器非线性响应、溶液pH值、光分解、
水解、温度等 对吸光度产生影响；
在选择参比溶液和显色剂时也要注意。
DAD（PAD）检测器分光光度计
二极管阵列检测器（DAD）
光源：高压汞灯或氙灯，在190nM-800nM范围，发射强度较大的连
续光谱。
激发单色器：置于光源和样品室之间的单色器（第一单色器）
发射单色器：置于样品室和检测器之间的为单色器（第二单色器。 样品室：石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
光源与检测器成直角安排，测量固体时，光源与检测器成直角。
F0 1 K q 0 [Q] 1 KSV [Q] F
动态猝灭——猝灭剂与发光分子碰撞
静态猝灭——猝灭剂与发光分子结合 混合猝灭——动态、静态（解析困难）
F 1 K [Q] F
0
P nQ PQn
log F0 F logK A nlog[Q]f F
1、谱带宽度和溶液本身性质 溶剂的选择：
1、在测定的波长范围内吸收较少
2、不会与溶质（被测样品）起化学反应 3、挥发性较小
特殊样品：
1、会发射荧光的被测样品 2、非常混浊的一片
2、仪器性能与测量误差
仪器性能：仪器误差，杂散光干扰等，系统误差
误差引起透光率（T）产生误差△T， 浓度（C）也随之产生误差△C。
又称光电二极管列阵检测器（PAD） PDA（photo-diode array） PDAD（photo-diode array detector） Diode ar学多通道检测器。
一个二极管对应接受光谱上一个纳米谱带宽的单色光 每一个二极管相当于一个单色器的出口狭缝
紫外可见光区：氙灯（190-800nm）
单色器：核心部件
将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。
棱镜: 玻璃350～3200nm 石英185～4000nm 色散原理：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同； 特点：色散均匀，谱带宽窄不同；
λ1
白光 入射狭缝 准直透镜
棱 镜
聚焦透 镜
λ2
出射狭缝
光栅：