酶促反应动力学实验

“蛋白酶凝乳特性研究”

1.实验目的

通过研究胃蛋白酶、木瓜蛋白酶作用于脱脂乳的最适凝乳温度、最适pH值、以及金属离子对酶凝乳效果的影响，使学生掌握酶学研究的基本方法，从而掌握生物化工研究的一些基本理论和主要思路，为科研开发打下必要的基础。

2.实验原理

胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等具有很强的蛋白质催化特性，又具有良好的凝乳特性。因脱脂乳含大量酪蛋白，木瓜蛋白酶的凝乳特性主要表现为随机切割精氨酶-苯丙氨酸的肽键，达到破坏蛋白质稳定的效果，进而发生凝乳。奶酪的生产以前主要利用牛凝乳酶达到凝乳效果，但牛凝乳酶主要是从小牛的第四胃中提取得来，其来源受到极大的限制，通过研究蛋白酶、木瓜蛋白酶的凝乳特性并对其进行优化，一定程度地缓解凝乳酶来源的紧缺状态。

3.实验材料、仪器和试剂

3.1实验材料优质脱脂乳

3.2实验药品和器皿

3.3试剂

（1）配制浓度为100g/L的脱脂乳1000ml,混匀后待用。（5组）

（2）配制浓度为10g/L的木瓜蛋白酶液和浓度为2g/L胃蛋白酶溶液各500ml，混匀后待用。（5组）

（3）配制0.1mol/L NaOH和0.1mol/L的HCl溶液各1000ml,用于调节溶液pH 值。（5组）

4.操作步骤

4.1木瓜蛋白酶（胃蛋白酶）凝乳活力的测定

取 5mL100g.L-1的脱脂乳,在65℃下保温5min,加入0.5mL10g.L-1的木瓜蛋白酶液（或胃蛋白酶液）,迅速混合均匀,准确记录从加入酶液到乳液凝固的时间(s)。把40min凝固1mL100g.L-1的脱脂乳的酶量定义为一个索氏单位(Soxhletunit),并以相对活性(RU)表示各因素的影响效果。SU=（2400/T）×（5 / 0.5）。式中:T为凝乳时间(s)

RU(％)=（各因素下SU / 最大SU）×100

4.2酶的最适凝乳温度的测定：分别在55,60,65,70, 75℃下测定酶凝乳活性。

4.3酶的热稳定性：酶液分别在55 ，60，65,70,75℃下处理10,30,60min后,

测定酶的凝乳活性。（上述温度对凝乳特性研究，可根据实际情况，缩小两个水平间的差距）

4.4 pH对酶凝乳效果的影响：用0.1mol/LHCl和0.1mol/L NaOH将100g/L的

脱脂乳的pH调到6.0,6.5,7,7.5，8在65℃下测定酶的凝乳活性。

4.5 酶对pH的稳定性：用0.1mol/L HCl和0.1moL/LNaOH将酶液调到pH为

4.0,

5.0,

6.0,

7.0,

8.0,室温下(约25℃)放置1h后,再将酶液pH调到6.0,

在65℃下测定酶的凝乳活性。（上述pH对凝乳特性研究，可根据实际情况，缩小两个水平间的差距）

4.6 NaCl对酶活的影响：在酶液中添加0.2,0.5,0.8,1.1,1.5 (%)浓度的NaCl

溶液，分别测定酶的凝乳活性。

4.7 Ca2+、Mg2+、K+对酶凝乳效果的影响：在乳液中添加CaCl

2,MgCl

2

、KCl使其

含量分别为0.2,0.5,0.8, 1.1,1.4 (%),然后测定酶的凝乳活性。（上述离子对凝乳特性研究，可根据实际情况，缩小两个水平间的差距）

五. 实验要求

通过酶学实验研究，找出木瓜蛋白酶、蛋白酶的最适温度、最适pH 值、最适底物浓度以及那些金属离子对蛋白酶具有抑制作用、哪些离子具有促进作用。画出趋势图或用表格加以说明。最后写出总结报告，内容类似于研究论文（包括题名，摘要、关键词、前言和正文部分，最后还要有结论部分以及参考文献等）。另外，实验前务必提交预习报告，否则不予参加实验。

酶促反应动力学—蔗糖酶米氏常数的测

【目的要求】

1．了解酶促动力学研究的范围。

2．以蔗糖酶为例，掌握测定米氏常数(Km)

【实验原理】

在酶促反应中，当反应体系的温度、pH 和酶浓度恒定时，反应初速度(v)则随底物

浓度[S]的增加而加速，最后达到极限，称为最大反应速度(v)。Michaelis 和Menten 根据反应速度与底物浓度的这种关系，推导出如下方程：

]

[]

[S k S V v m +=

此式称为米氏方程，式中Km 称为米氏常数，按此方程，可用作图法求出Km 。方法有：

1．以v[S]作图

由米氏方程可知，v=V ／2时，Km ＝[S]即米氏常数值等于反应速度达到最大反应速度一半时所需底物浓度。因此，可测定一系列不同底物浓度的反应速度v,以v 对[S]作图。当v ＝V ／2时，其相应底物浓度即为Km 。

2．以1／v 对1／[S]作图

取米氏方程的倒数式：

V

S V k v m 1][11+∙=

以1／v 对1／[S]作图可得一直线，其斜率为Km ／V ，截距为1/V 。若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于—l ／Km 。

本实验以蔗糖为底物．利用一定量蔗糖酶水解不同浓度蔗糖所形成的产物(葡萄糖和果糖)的量来计算蔗糖酶的Km 值。葡萄糖和果糖能与3，5—二硝基水杨酸试剂反应，生成桔红色化合物，可于520nm 处比色测定之。 【试验材料】 1．试剂

(1)标准葡萄糖溶液：准确称取100mg 葡萄糖溶于少量饱和的苯甲酸溶液(0.3%)，再转移到100ml 容量瓶中，用饱和苯甲酸溶液稀释到刻度，混匀，即得浓度为1mg ／m1的标准葡萄糖溶液。冰箱贮藏可长期保存； (2)pH4.5的0.1mol/L 醋酸缓冲液：取lmol/L 醋酸钠溶液43m1及lmol ／L 醋酸溶液57m1，稀释至1000m1即得； (3)pH4.5的10％蔗糖溶液：准确取l0g 蔗糖溶于少量pH4.5的0.1mol ／L 醋酸缓冲液，转移到100ml 容量瓶中，用同样缓冲液稀释到刻度备用；

(4)3，5—二硝基水杨酸试剂：溶液I ：4.5％NaOH 溶液300m1，1％3，5一二硝基水杨酸溶液880m1及酒石酸钾钠(KNaC4O6·4H20)255g 三者一起混合均匀。 溶液Ⅱ：取结晶酚10g 及lo ％NaOH 溶液22m1，加蒸馏水稀释成100ml ，混匀。 溶液Ⅲ：取6.9gNaHSO3溶于64ml 溶液n 中。

将溶液皿和溶液I 混合，激烈振摇混匀，即得3，5—二硝基水杨酸溶液，放置一周后备用。

(5)酵母蔗糖酶溶液：称取鲜酵母l0g 于研钵中，加少量细砂及10一15ml 蒸馏水研磨。磨细后置冰箱中，过滤，滤液加2—3倍体积冷丙酮，搅拌均匀后离心，沉淀用丙酮洗两次，真空干燥得固体粉末状酶，再溶于100ml 蒸馏水，即得酶溶液。若有不溶物可用离心法除去。

该酶液活力以6—12单位为佳。蔗糖酶活力单位的定义为：在一定条件下反应5min ，每产生lmg 葡萄糖所需要的酶量。备用。