免疫球蛋白超家族成员Izumo是精卵融合的必要蛋白

免疫球蛋白超家族成员I z u m o 是精卵融合的必要蛋白1

Naokazu Inoue, Masahito Ikawa, Ayako Isotani & Masaru Okabe 2

陈凌 译、江一平 校

作为构建人体的60万亿细胞的代表，精子和卵子相遇、互相识别并融合形成新一代生命。精卵膜融合即受精是非常重要的事件，人们长期致力于寻找与该事件相关的因子[1]。最近，已发现CD9是卵膜上与精卵融合相关的基本因子[2-4]，但精子方面与卵膜融合相关的因子尚未找到。本文报道，运用抑制融合的单克隆抗体[5]和基因克隆技术，我们找到了精子的融合相关抗原，并发现该抗原是免疫球蛋白超家族的一个新蛋白。我们将该基因命名为Izumo 并培育了该基因缺陷的小鼠品系。Izumo -/-小鼠是健康的，但其雄性不育。雄性的Izumo -/-小鼠能产生外观正常且能结合并穿透透明带的精子，但这些精子却不能与卵膜融合。人精子也含有Izumo ，而且抗人Izumo 抗体能阻止人精子与去透明带的金黄地鼠卵融合。 为了寻找人精子中与卵膜融合的关键因子，我们利用2-D 电泳分离小鼠精子粗提蛋白，然后用能特异性阻断精卵融合的抗精子单克隆抗体OBF13[5]进行免疫标识，分离到一种精子跨膜蛋白成分，我们以日语中的婚姻之神 “Izumo ”① 为之命名。通过液相串联质谱（LC-MS/MS ）分析发现，该蛋白中的10条短肽段与小鼠蛋白质数据库中一段名为RIKEN 的注册序列的部分肽段完全匹配（NCBI 登录号：XM_133424）。利用该注册序列设计引物，我们成功地利用RT-PCR 从小鼠睾丸总RNA 中分离到该蛋白的编码序列。同时，从人类基因组数据库中我们还查到了该蛋白的人类同源物的编码序列（NCBI 登录号：BC034769），该序列编码一种特殊的免疫球蛋白超家族（IgSF ），是一种I 型跨膜蛋白，其胞外部分为免疫球蛋白结构域，并可能含有一个糖基化位点（图1，a ，b ）。利用重组Izumo 蛋白制备的多克隆抗体进行免疫标识，我们发现，小鼠Izumo 蛋白大小为56.4KD ，并只在小鼠睾丸组织中表达（图1，c ），而人类Izumo 蛋白大小

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Inoue N, Ikawa M, Isotani A, Okabe M. The immunoglobulin superfamily protein Izumo is

required for sperm to fuse with eggs. Nature 2005 Mar 10;434(7030):234-8.

2 Naokazu Inoue1, Masahito Ikawa2, Ayako Isotani1,

3 & Masaru Okabe1,2,3* 1.Genome Information Research Center, 2.Research Institute forMicrobial Diseases,3.Faculty of Pharmaceutical Sciences, Osaka University, Yamadaoka 3-1, Suita,Osaka 565-0871, Japan; *Correspondence and requests for materials should be addressed to M.O.(e-mail: okabe@gen-info.osaka-u.ac.jp). Sequences have been deposited with GenBank under accession numbers AB195681 for mouse Izumo, AB195682 for human Izumo and AB195683 for

rat Izumo.

图1. Izumo 基因的鉴定：a ，小鼠（上方）以及人类（下方）Izumo 的氨基酸序列的同源性比对，同源部分用星号表示，通过LC-MS/MS 确认的肽段用红色标记，橘红色、蓝色和绿色分别标记Izumo 的信号肽、跨膜结构域以及免疫球蛋白样结构域，短箭头表示参与形成二硫键的Cys 残基；b ，Izumo 是一类典型的I 型跨膜糖蛋白，具有一个免疫球蛋白样结构域以及一个N-糖基化位点（Asn204）；c ，Izumo 蛋白在睾丸组织中特异性表达，图为各种组织中Izumo 的免疫印记结构，从左到右依次为脑、心脏、胸腺、脾、肺、肝脏、肌肉、肾、卵巢、睾丸以及精子，可溶性蛋白的上样量为30μg/Lane ，用1μg/ml 的抗鼠Izumo 抗体检测。箭头所指为鼠Izumo 蛋白。d ，人类精子Izumo 蛋白的免疫印记，箭头所指为人类Izumo 蛋白。e ，利用精子顶体特异性表达EGFP 的转基因小鼠进行Izumo 的免疫染色，在顶体完整的精子中不能检测到Izumo 蛋白(顶体完整的精子其顶体部位有绿色荧光，为绿色箭头所示)，而只有在发生顶体反应后，才能检测到Izumo 蛋白（被抗鼠Izumo 多克隆抗体标记为红色，为白色箭头所示，此时顶体被破坏，绿色荧光消失）。f ，用抗人Izumo 多克隆抗体标记人类精子，发生顶体反应的精子能被抗体标记为红色（发生顶体反应的精子被CD-46抗体标记为绿色），但是同样的抗体不能标记顶体完整的精子（顶体完整的精子不能被CD-46着色）。Bar ＝10μm 。

则为37.2KD （图1，d ）。在完整精子的质膜上并不能检测到Izumo ，这与精卵融合过程发生于顶体反应之后而不是在射精之后的事实是相吻合的。无论是人类还是小鼠，在顶体反应之后，都能在精子表面检测到Izumo 蛋白（图1，e ，f ），这可能是因为Izumo 不是定位在完

整精子的质膜上，而是隐藏在质膜的下方，顶体反应后才通过某种途径暴露于精子表面。这与小鼠精子膜蛋白CD46的行为十分相似[6]。

为了分析Izumo 在体内的生理功能，我们设计基因打靶载体，利用同源重组技术将

Izumo 基因的2～10号外显子替换为Neo 基因（图2，a ），然后通过ES 细胞系（D3）制备出了Izumo 基因缺陷小鼠模型，利用Southern-blot 筛选鉴定中靶细胞及其生殖系传递小鼠（图2，b ），在纯合突变小鼠个体中未检测到Izumo 的mRNA 和Izumo 蛋白的表达（图2，c ，d ）。考虑到Izumo 基因的剔除有可能造成相关基因表达水平的升高或降低[7]，我们检测了ADAM2[8]、CD147[9]、sp56[10]等一些目前认为与精卵互作有关的基因的表达水平，结果表明在Izumo 基因缺陷小鼠中，这些基因的表达水平与野生型小鼠并无显著差异（图2，d ）。

F1代杂合子小鼠（Izumo+/-）自交，产生43只野生型小鼠（Izumo+/+）；92只杂合体小鼠（Izumo+/-）以及47只突变纯合体小鼠（Izumo-/-），符合孟德尔的基因分离规律。Izumo-/-小鼠身体健康，没有明显的发育异常，雌性Izumo-/-小鼠表现出正常的生育能力（图3，a ），而雄性Izumo-/-小鼠尽管能与雌性Izumo+/+小鼠发生正常的交配、射精行为以及形成阴栓，但却不能生育（图3，a ）。在观察到28次阴栓的情况下，9对Izumo-/-雄性小鼠连续饲养4个月也没有观察到妊娠；雄性Izumo+/-小鼠仍然表现出正常的生育能力（图3，a ）。目前对基因剔除小鼠的研究表明，至少有4个基因的剔除会造成雄性小鼠的不育，而这4个基因无一例外的都是通过破坏精子与透明带的结合能力从而造成雄性不育的，而且这些不育小鼠的精子活动能力受到影响，不能迁移至输卵管部位[7,8,11,12]。然而，我们的实验结果表明，Izumo 基因

图2. 小鼠Izumo 基因剔除。a ，野生型小鼠Izumo 基因结构、打靶载体以

及突变体基因结构，分别用垂直的柱状和水平的线条来表示外显子和内含子，Neo 基因由磷酸甘油酸激酶（PGK ）启动子启动表达，白喉毒素A 链由MC1启动表达（DT ）；b ，基因剔除结果的Southern-blot 分析，基因组DNA 样品经EcoR I 酶切，用3’端探针杂交检测出1.5kb （野生型）和6.9kb （突变型）片段；c ，野生（+/+）、杂合（+/-）以及突变纯合（-/-）雄性小鼠睾丸总RNA （20μg ）的Northern-blot 杂交分析，GAPDH 为阳性对照。d ，Western-blot 结果显示突变纯合（-/-）小鼠精子没有表达Izumo 蛋白，而野生（+/+）、杂合（+/-）型小鼠均有该蛋白的表达，突变纯合小鼠精子中的ADAM2、CD147以及SP56均正常表达。

图3. Izumo 基因缺陷导致小鼠雄性不育，a ， Izumo-/-、Izumo+/-雄性小鼠

及Izumo-/-雌性小鼠的生育力分析，下方数字为亲本的数量（交配数量），b 、c ，Izumo-/-及Izumo+/-精子的体外受精实验，Izumo-/-精子能够穿越透明带到达卵子质膜，但不能与卵子融合，从而聚集在透明带卵周隙中，而Izumo+/-精子则能与卵子发生融合，d ，上图：许多 Izumo-/-精子聚集在卵子的卵周隙中，下图：用精子特异性的单克隆抗体MN9对这些聚集的精子进行标记，结果显示这些位于卵周隙的精子已发生了顶体反应。e ，体外受精2h 、6h 后与单个卵子发生融合的平均精子个数，f ，与卵子发生融合的精子被Hoechst33342特异性标记，箭头所指为融合的精子。