细菌常用的几种试验
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临床细菌检验 常用的几种试验
菏泽市立医院
常做的实验方法
革兰氏染色法 拉丝试验 抗酸染色法 氧化酶试验 触酶试验 凝固酶试验 奥普妥辛实验 卫星实验 CAMP 杆菌肽敏感实验 硝酸盐还原试验 DNA酶试验 生化反应 血清学分型(志贺,沙门，霍乱、链球菌)
革兰氏染色
快速染色法： 1、初染：结晶紫染色10秒，水洗，甩干； 2、媒染：革兰氏碘液染色10秒，水洗，甩 干； 3、脱色：95%酒精脱色10~20秒，水洗， 甩干； 4、复染：沙黄或复红染色10秒，水洗，干 后镜检。 5、结果判定：G +呈紫色，G-菌呈红色
硝酸盐还原试验
1.原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐生成亚硝酸盐、 氨和氮等。亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸再与 对氨基苯磺酸作用形成重氮苯磺酸，它可与a-萘胺结合成 红色的N-a-奈氨苯磺酸。 2.方法：将待检菌接种硝酸盐培养基中，35℃24小时， 加入硝酸盐还原试剂甲液（对氨基苯磺酸和醋酸）和乙液 （ a-萘胺和醋酸）各一滴后观察结果。 3.判断结果：呈现红色为阳性。若不出现红色，则加入少 许锌粉，仍不出现红色者为阳性，出现红色为阴性。 4.意义：肠杆菌科细菌，硝酸盐还原试验阳性
触酶试验
1.原理：具有触酶（过氧化氢酶）的细菌，能催 化过氧化氢，放出新生态氧，继而形成分子氧， 出现气泡。 2.方法：用接种环挑取固体培养基上的菌落置于 洁净的玻片上，然后滴加3%过氧化氢溶液一滴， 观察结果。 3.结果判断：在5秒内释放大量的气泡为阳性。 4.意义：大多数球菌触酶试验阳性，但链球菌为 阴性，主要用于鉴别葡萄球菌与链球菌。
CAMP试验
1.原理：B群链球菌在血平板上能产生CAMP因子， 可促使金黄色葡萄球菌β 溶血素的活性，故在血 平板上两种细菌交界处溶血能力增强，形成箭头 状透明状溶血区。其他链球菌一般不产生CAMP 因子，故此试验可作为B群链球菌的鉴定指标之 一。 2.方法：在血平板上，用金黄色葡萄球菌划一条 横线，再于该直线相距5mm左右用被检菌接种一 或两条垂直短线，35℃24小时观察结果。 3.结果观察：在被检菌接种线与金葡菌接种线之 间有一个箭头形或半月形透明溶血区为阳性，可 推断为B群链球菌。无溶血区为阴性。
DNA 酶试验
1.原理：某些细菌可产生DNA 酶。 DNA 酶能将 DNA 长链水解成有几个单核苷酸组成的寡核苷酸 链。水解形成的寡核苷酸可溶于酸，在DNA平板 上加入酸后，可在菌落周围形成透明环。 2.将待检菌点种于DNA琼脂平板上，35℃24小 时，用1mol/L盐酸滴加在细菌生长的平板表面， 观察结果。 3.结果观察：菌落周围出现透明环为阳性，无透 明环为阴性。此试验用于奈瑟菌与卡他布兰汉菌 的鉴别。卡他布兰汉菌为阳性，奈瑟菌为阴性。
杆菌肽敏感试验
1.原理：A群链球菌对杆菌肽非常敏感，而 其他链球菌对杆菌肽通常耐药，故此试验 可鉴别链球菌。 2.方法：将被检链球菌，密涂于血平板上， 将杆菌肽纸片贴于血平板表面，35℃24小 时观察结果。 3.在杆菌肽周围出现明显抑菌环 〉10mm 为阳性，则被推断为A群链球菌,〈10mm 为阴性，为其他群的链球菌。
血浆凝固酶试验
1.原理：金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶。一种是结合 凝固酶，结合在细胞壁上，使血浆中纤维蛋白原变成纤维 蛋白附着于细菌表面上，发生凝集，用玻片法测出。另一 种是菌体生成后释放与培养基中的游离凝固酶，能使凝固 酶原变成凝血酶类物质，从而使血浆凝固，可用试管法测 出。 2.方法： （1）玻片法：取血浆和生理盐水各一滴分别滴到清 洁玻片上，挑去待检菌落分别与血浆及盐水混合，如血浆 中出现明显凝集颗粒而盐水中无自凝现象者为阳性。 （2）试管法：取试管两支，分别加入0.5ml的血浆 （经生理盐水1：4稀释）挑去菌落数个加入测定管充分研 磨混匀，用一只阳性菌株加入对照管，37℃3-4小时。血 浆凝固者为阳性。
G+菌
G-菌
氢氧化钾拉丝试验
“氢氧化钾拉丝试验”快速鉴定革兰氏阳性菌 1、原理：由于革兰阴性细菌的细胞壁肽聚糖层数少于稀 碱溶液内易于破裂，而释放出未断裂的DNA螺旋，使 KOH菌悬液呈现粘性，可有搅拌后拉出丝来，而革兰阳性 菌在稀碱溶液中仍保持不变。 2、试剂：4%KOH水溶液。应新鲜配制。 3、方法：取1滴4%KOH水溶液于洁净玻片上，用接种环 于固体培养基上取新鲜配制菌落少许，于KOH溶液中搅拌 混匀，并每隔几秒钟上提接种环，观察能否拉出丝来。 4、结果：能用接种环拉出丝来为阳性，仍为混悬液则为 阴性。大多数革兰阴性菌于5到10秒内出现阳性，有的需 30到45秒。革兰阳性菌于60秒以后仍阴性。
抗酸染色
1、初染：石炭酸复红加热染色3-5分钟，水 洗，甩干； 2、脱色：3%盐酸酒精脱色30~60秒，水 洗，甩干； 3、复染：碱性美兰60秒，水洗，干后镜检。 4、结果判定：抗酸菌呈红色 ，非抗酸菌呈 兰色 5、意义：用于鉴别抗酸菌与非抗酸菌
抗酸染色---抗酸菌
氧化酶试验
原理：具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧 化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生 成有色的醌类化合物。 方法：取一洁净的滤纸一小块，涂抹菌苔少许， 加一滴氧化酶试剂（对苯二胺溶液）于菌上，观 察颜色变化。 判断：立即呈粉红色并迅速转变为紫红色为阳性， 不变色为阴性。 意义：肠杆菌科细菌与气单胞、假单胞菌的鉴别
卫星试验
1.原理：流感嗜血杆菌生长时需要X、V两种因子，在血 平板上形成极小、圆形透明的菌落，若与金葡菌同时培养， 由于金葡菌产生V因子，促进流感嗜血杆菌的生长，在金 葡菌周围的细菌菌落较大，形成卫星生长现象。在普通培 养基上不生长。 2.方法：用取菌环挑去可疑菌落分别接种在血平板、MH 平板上，再用取菌针挑取金葡菌与原划线垂直划一直线接 种在平板上。35℃24小时观察结果。 3.结果判断：金葡菌周围的细菌菌落较大，卫星试验阳性 4.意义：仅血平板上出现卫星现象--流感嗜血杆菌； 血平板与MH均呈卫星现象--副流感嗜血杆菌。 借此用于鉴别流感与副流感嗜血杆菌。
奥普妥辛实验 （OP试验）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1.原理：肺炎链球菌对Optochin（乙基氢化去甲 奎宁）十分敏感，作用机理是干扰肺炎链球菌叶 酸的合成，可抑制其生长，其他链球菌如草绿色 链球菌对其不敏感。借此可对肺炎链球菌与草绿 色链球菌加以鉴别。 2.方法：将待检的a溶血的链球菌均匀的涂布于血 平板上，贴放Optochin纸片（含药5mg)35℃孵 育18-24小时，观察抑菌圈的大小。 3.结果判断：抑菌圈〉14mm为肺炎链球菌，无 或见很窄的抑菌圈为草绿色链球菌。
菏泽市立医院
常做的实验方法
革兰氏染色法 拉丝试验 抗酸染色法 氧化酶试验 触酶试验 凝固酶试验 奥普妥辛实验 卫星实验 CAMP 杆菌肽敏感实验 硝酸盐还原试验 DNA酶试验 生化反应 血清学分型(志贺,沙门，霍乱、链球菌)
革兰氏染色
快速染色法： 1、初染：结晶紫染色10秒，水洗，甩干； 2、媒染：革兰氏碘液染色10秒，水洗，甩 干； 3、脱色：95%酒精脱色10~20秒，水洗， 甩干； 4、复染：沙黄或复红染色10秒，水洗，干 后镜检。 5、结果判定：G +呈紫色，G-菌呈红色
硝酸盐还原试验
1.原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐生成亚硝酸盐、 氨和氮等。亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸再与 对氨基苯磺酸作用形成重氮苯磺酸，它可与a-萘胺结合成 红色的N-a-奈氨苯磺酸。 2.方法：将待检菌接种硝酸盐培养基中，35℃24小时， 加入硝酸盐还原试剂甲液（对氨基苯磺酸和醋酸）和乙液 （ a-萘胺和醋酸）各一滴后观察结果。 3.判断结果：呈现红色为阳性。若不出现红色，则加入少 许锌粉，仍不出现红色者为阳性，出现红色为阴性。 4.意义：肠杆菌科细菌，硝酸盐还原试验阳性
触酶试验
1.原理：具有触酶（过氧化氢酶）的细菌，能催 化过氧化氢，放出新生态氧，继而形成分子氧， 出现气泡。 2.方法：用接种环挑取固体培养基上的菌落置于 洁净的玻片上，然后滴加3%过氧化氢溶液一滴， 观察结果。 3.结果判断：在5秒内释放大量的气泡为阳性。 4.意义：大多数球菌触酶试验阳性，但链球菌为 阴性，主要用于鉴别葡萄球菌与链球菌。
CAMP试验
1.原理：B群链球菌在血平板上能产生CAMP因子， 可促使金黄色葡萄球菌β 溶血素的活性，故在血 平板上两种细菌交界处溶血能力增强，形成箭头 状透明状溶血区。其他链球菌一般不产生CAMP 因子，故此试验可作为B群链球菌的鉴定指标之 一。 2.方法：在血平板上，用金黄色葡萄球菌划一条 横线，再于该直线相距5mm左右用被检菌接种一 或两条垂直短线，35℃24小时观察结果。 3.结果观察：在被检菌接种线与金葡菌接种线之 间有一个箭头形或半月形透明溶血区为阳性，可 推断为B群链球菌。无溶血区为阴性。
DNA 酶试验
1.原理：某些细菌可产生DNA 酶。 DNA 酶能将 DNA 长链水解成有几个单核苷酸组成的寡核苷酸 链。水解形成的寡核苷酸可溶于酸，在DNA平板 上加入酸后，可在菌落周围形成透明环。 2.将待检菌点种于DNA琼脂平板上，35℃24小 时，用1mol/L盐酸滴加在细菌生长的平板表面， 观察结果。 3.结果观察：菌落周围出现透明环为阳性，无透 明环为阴性。此试验用于奈瑟菌与卡他布兰汉菌 的鉴别。卡他布兰汉菌为阳性，奈瑟菌为阴性。
杆菌肽敏感试验
1.原理：A群链球菌对杆菌肽非常敏感，而 其他链球菌对杆菌肽通常耐药，故此试验 可鉴别链球菌。 2.方法：将被检链球菌，密涂于血平板上， 将杆菌肽纸片贴于血平板表面，35℃24小 时观察结果。 3.在杆菌肽周围出现明显抑菌环 〉10mm 为阳性，则被推断为A群链球菌,〈10mm 为阴性，为其他群的链球菌。
血浆凝固酶试验
1.原理：金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶。一种是结合 凝固酶，结合在细胞壁上，使血浆中纤维蛋白原变成纤维 蛋白附着于细菌表面上，发生凝集，用玻片法测出。另一 种是菌体生成后释放与培养基中的游离凝固酶，能使凝固 酶原变成凝血酶类物质，从而使血浆凝固，可用试管法测 出。 2.方法： （1）玻片法：取血浆和生理盐水各一滴分别滴到清 洁玻片上，挑去待检菌落分别与血浆及盐水混合，如血浆 中出现明显凝集颗粒而盐水中无自凝现象者为阳性。 （2）试管法：取试管两支，分别加入0.5ml的血浆 （经生理盐水1：4稀释）挑去菌落数个加入测定管充分研 磨混匀，用一只阳性菌株加入对照管，37℃3-4小时。血 浆凝固者为阳性。
G+菌
G-菌
氢氧化钾拉丝试验
“氢氧化钾拉丝试验”快速鉴定革兰氏阳性菌 1、原理：由于革兰阴性细菌的细胞壁肽聚糖层数少于稀 碱溶液内易于破裂，而释放出未断裂的DNA螺旋，使 KOH菌悬液呈现粘性，可有搅拌后拉出丝来，而革兰阳性 菌在稀碱溶液中仍保持不变。 2、试剂：4%KOH水溶液。应新鲜配制。 3、方法：取1滴4%KOH水溶液于洁净玻片上，用接种环 于固体培养基上取新鲜配制菌落少许，于KOH溶液中搅拌 混匀，并每隔几秒钟上提接种环，观察能否拉出丝来。 4、结果：能用接种环拉出丝来为阳性，仍为混悬液则为 阴性。大多数革兰阴性菌于5到10秒内出现阳性，有的需 30到45秒。革兰阳性菌于60秒以后仍阴性。
抗酸染色
1、初染：石炭酸复红加热染色3-5分钟，水 洗，甩干； 2、脱色：3%盐酸酒精脱色30~60秒，水 洗，甩干； 3、复染：碱性美兰60秒，水洗，干后镜检。 4、结果判定：抗酸菌呈红色 ，非抗酸菌呈 兰色 5、意义：用于鉴别抗酸菌与非抗酸菌
抗酸染色---抗酸菌
氧化酶试验
原理：具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧 化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生 成有色的醌类化合物。 方法：取一洁净的滤纸一小块，涂抹菌苔少许， 加一滴氧化酶试剂（对苯二胺溶液）于菌上，观 察颜色变化。 判断：立即呈粉红色并迅速转变为紫红色为阳性， 不变色为阴性。 意义：肠杆菌科细菌与气单胞、假单胞菌的鉴别
卫星试验
1.原理：流感嗜血杆菌生长时需要X、V两种因子，在血 平板上形成极小、圆形透明的菌落，若与金葡菌同时培养， 由于金葡菌产生V因子，促进流感嗜血杆菌的生长，在金 葡菌周围的细菌菌落较大，形成卫星生长现象。在普通培 养基上不生长。 2.方法：用取菌环挑去可疑菌落分别接种在血平板、MH 平板上，再用取菌针挑取金葡菌与原划线垂直划一直线接 种在平板上。35℃24小时观察结果。 3.结果判断：金葡菌周围的细菌菌落较大，卫星试验阳性 4.意义：仅血平板上出现卫星现象--流感嗜血杆菌； 血平板与MH均呈卫星现象--副流感嗜血杆菌。 借此用于鉴别流感与副流感嗜血杆菌。
奥普妥辛实验 （OP试验）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1.原理：肺炎链球菌对Optochin（乙基氢化去甲 奎宁）十分敏感，作用机理是干扰肺炎链球菌叶 酸的合成，可抑制其生长，其他链球菌如草绿色 链球菌对其不敏感。借此可对肺炎链球菌与草绿 色链球菌加以鉴别。 2.方法：将待检的a溶血的链球菌均匀的涂布于血 平板上，贴放Optochin纸片（含药5mg)35℃孵 育18-24小时，观察抑菌圈的大小。 3.结果判断：抑菌圈〉14mm为肺炎链球菌，无 或见很窄的抑菌圈为草绿色链球菌。