结核性脑膜炎的实验室诊断进展

结核性脑膜炎的实验室诊断进展胡美姣1 向本友*21.吉首大学医学院湖南吉首 416000；2.湖南省湘西土家族苗族自治州人民医院湖南吉首416000【摘要】结核性脑膜炎是具有较高的死亡率、致残率的肺外结核形式，目前临床上诊断结核性脑膜炎较为困难，而早期诊断和早期治疗对于结核性脑膜炎的预后至关重要。

本文针对结核性脑膜炎的实验室诊断方法进行介绍和分析，为临床诊断结核性脑膜炎提供思路。

【关键词】结核性脑膜炎；诊断；综述Progress in laboratory diagnosis of tuberculous meningitisHU meijiao1，XIANG benyou21 School of Medicine in Jishou University，Hunan Province，Jishou 416000，China2 Hospital of Xiangxi Autonomous Prefecture in Hunan Province，Jishou 416000，China 【Abstract】Tuberculous meningitis is a form of extrapulmonary tuberculosis with high mortality and disability rate.At present，clinical diagnosis of tuberculous meningitis is more difficult，and early diagnosis and early treatment are crucial for the prognosis of tuberculous meningitis.This article introduces and analyzes the laboratory diagnosis methods of tuberculous meningitis，and provides ideas for clinical diagnosis of tuberculous meningitis.【Key words】Tuberculous meningitis；Diagnosis；Review结核性脑膜炎（Tuberculous meningitis，TBM）是结核分枝杆菌（MTB）侵袭脑膜和脊膜引起的非化脓性炎症疾病，也可累及脑实质、脑血管。

结核性脑膜炎是肺外结核最严重的表现形式，具有较高的致残率和死亡率。

结核脑膜炎早期临床表现多无特异性，易被误诊为病毒性脑膜炎、化脓性脑膜炎、真菌性脑膜炎等。

早期诊断对及时治疗、降低致残率和病死率具有重要意义。

本研究通过查阅文献对各项实验室检查方法进行分类综述，为临床早期诊断提供参考。

一、病原学检查结核性脑膜炎的诊断“金标准”：在脑脊液涂片或培养中发现抗酸杆菌，是目前临床上常用的病原学检测方法。

1、涂片：传统抗酸染色具有操作方便、成本低、速度快等优点，但应用于TBM敏感性低（约10%-20%）[1]。

脑脊液结核杆菌含量低，使得检出率低。

有研究表明增加脑脊液容量和镜检时间可提高检出率[2]。

曾江[3]等人将沉降式制片技术联合改良抗酸染色法应用于脑脊液找抗酸杆菌，其检出率为91.6%，明显高于传统涂片法。

结核杆菌细胞壁含大量脂质，TritonX-100能溶解脂质增加细胞壁的通透性，使染色剂更易渗入增加细菌检出率。

荧光显微镜镜检能使MTB在显微镜下更易被发现，具有检测速度快、灵敏度高的特点。

文献表明[4-8]通过TritonX-100 预处理、荧光显微镜镜检可提高灵敏度。

Minion等人[8]通过对比LED荧光显微镜与常规荧光显微镜，LED荧光显微镜可以缩短检出时间，但是脑脊液标本中的应用价值还需进一步验证。

综上所述，目前为提高其阳性率，多通过增加脑脊液样本量、改良抗酸染色方法、改良制片方法、改良显微镜技术等方法实现改进。

抗酸染色涂片无法满足临床需求，适用于临床初筛检查。

2、MTB培养2.1改良罗氏培养法：改良罗氏培养法培养结核分支杆菌需4-8周，灵敏度不高，在临床早期诊断的应用价值有限。

2.2液体培养基培养法：液体培养基能使MTB充分的接触营养物质，生长速度较快，常见如BACTEC快速培养系统、BACTEC MGIT 960培养系统、显微镜观察药物敏感性（MODS）技术等。

Bactec MGIT 960培养系统是一种全自动MTB快速培养试验，既可以检测和培养MTB，也可进行药敏实验。

结合国内外文献该试验的平均培养时间大约在9.5-15.8d[9-11]，培养时间明显缩短。

MODS技术是一种基于液体培养基的药物敏感性试验，较液体培养法经济，可以在2周内同时进行MTB培养和药物敏感性试验。

黄自坤[12]等人得出MODS诊断结核性脑膜炎的阳性率为54.O％，显著高于抗酸染色法和改良罗氏培养法。

国外文献报道对156份结核性脑膜炎患者的脑脊液标本进行MODS法、Ziehl-Neelsen涂片、MGIT和罗氏培养，以临床诊断标准为金标准，敏感度分别为64.9%、52.6%、70.2%和70.2%，特异度均为100%[13]，MODS法中位报阳时间为6天，较MGIT法（15.5天）和罗氏培养法（24天）明显缩短。

液体培养法较固体培养法相比培养时间和药敏时间缩短，且灵敏度、特异度较高，在临床上已逐步取代传统的罗氏培养。

3、噬菌体裂解试验：是一种检测MTB较快速的诊断方法，主要是通过结核分枝杆菌噬菌体感染活结核杆菌并大量繁殖，最终使结核杆菌裂解释放出子代噬菌体感染指示细胞并使其裂解出现噬菌斑，出现噬菌斑即为阳性，约2天能获取结果，还可进行药敏分析。

有文献报道[14，15] 噬菌体裂解试验在细菌含量100-500CFU/ml即能检出。

部分文献[14，15]对脑脊液标本用噬菌体裂解试验检测结核杆菌阳性检出率为30-40%。

噬菌体裂解试验对实验及操作技术要求较低，但操作较为繁琐，较MTB培养耗时短，较涂片阳性率提高，在不发达地区有一定的价值，在脑脊液标本的应用还需更多数据支持。

二、免疫学检查1、γ-干扰素释放试验（IGRA）：当结核杆菌感染后，T淋巴细胞在结核感染部位聚集接受抗原刺激后成为致敏T淋巴细胞。

通过在体外检测致敏淋巴细胞再次接受类似结核杆菌特异性抗原刺激时产生的γ-干扰素，以判断是否感染结核分枝杆菌[16]。

IGRA适用于潜伏感染（latent TB infection，LTBI）的诊断和活动性结核病的辅助诊断，但不能区分LTBI和活动性肺结核。

目前有两种检测方法[17]，（1）Quantiferon-TB Gold（QFT-G）：检测T细胞接受抗原刺激后产生的γ-干扰素；（2）酶联免疫斑点检测（T SPOT.TB）：检测能产生γ-干扰素的T细胞数量。

近年来IGRA的检测样本除了血液还有非血体液，部分文献[18]表明非血体液检测特异度高于血液检测。

一项meta分析[18]也表明血和脑脊液IGRA的总敏感度分别为0.78和0.77，特异性分别为0.61和0.88，并表明其诊断结核性脑膜炎准确率适中。

2015年Quantiferon-TB Gold plus投入使用，近期一项荟萃分析[19]显示QFT-Plus在检测具有LTBI风险的患者方面与QFT-GIT相当，但QFT-Plus试验比QFT-GIT试验具有更高的敏感性。

2、腺苷脱氨酶检测（ADA）：是一种与细胞免疫活性相关的核苷酸代谢酶，主要分布于淋巴组织，结核分支杆菌刺激并激活T淋巴细胞，使脑脊液中ADA升高。

一项评价ADA诊断结核性脑膜炎准确性的meta分析显示[20]，敏感性和特异度皆为90%，但其纳入的ADA临界值在6-15.5U/L之间，界限值相差较大。

目前ADA在诊断结核性脑膜炎没有明确的界限值。

ADA具有简单、快速、便宜等优点，但应用于诊断结核性脑膜炎还需结合临床表现及其他相关检查。

三、分子生物学检测核酸扩增试验（NAATs）：随着NAATs的发展，除了常规的PCR技术外，还出现环介导等温扩增技术（LAMP）、利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术（Xpert MTB/RIF）、线性探针技术等。

2019年一项meta分析[21]显示以培养为标准NAATs的灵敏度和特异度分别为82%、99%，以临床诊断标准（Composite reference standard，CRS）的灵敏度和特异度分别为68%、98%。

NAATs目前无法取代培养作为单独确诊结核性脑膜炎的诊断工具，但其具有耗时短的优点，在临床上仍需与培养结合使用。

1、聚合酶链式反应（PCR）：PCR是检测结核分支杆菌常用的方法之一，继常规PCR后，涌现出多种PCR检测方法，如巢式PCR（nested PCR）、实时荧光定量PCR（FQ-PCR）、多重PCR（mPCR）等。

常规PCR用于检测结核杆菌DNA其敏感性和特异性分别为31%-100%、66%-100%[22]。

应用常规PCR面临脑脊液含菌量少、脑脊液存在扩增抑制剂等问题。

巢式PCR和FQ-PCR主要通过提高扩增效率、降低非特异性扩增产物、改善终点检测、杜绝PCR产物对实验室污染等方法改进常规PCR，其敏感性和特异性也较常规PCR有所提高。

mPCR通过联合多引物提高PCR的诊断价值，有多项研究证明，mPCR诊断TBM较单一引物PCR更具优势[23，24]。

2、环介导等温扩增技术（LAMP）：是在恒温条件下针对目标DNA链上的六个区段设计四个特异引物，再通过链置换反应快速的实现核酸扩增，具有特异性高、操作简单、较便宜、扩增效率高、耗时较少等优点。

LAMP不需要昂贵的核酸扩增仪和检测设备，省去了PCR法中需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。

脑脊液中结核杆菌常用的PCR基因靶点是IS110、MPB64、16S、65kDa的热休克蛋白。

国内部分文献[25，26]报道以IS6110为基因靶点的LAMP法对诊断结核性脑膜炎的灵敏度为43.02%-58.02%，特异度92%-100%。

许多研究多以单一基因靶点进行核酸扩增，部分MTB个体可能无法覆盖，这可能导致假阴性结果，多基因靶点可以解决这一问题。

在国外一项[27]以IS6110和MPB64为基因靶点对250份脑脊液样本进行LAMP法分析，IS6110靶点、MPB64靶点、双靶点诊断结核性脑膜炎的灵敏度分别为82.6%、86.6%、88%，特异度均为100%。

LAMP的灵敏度优于涂片、培养、传统PCR，对专业人员及实验室要求不高，有利于其在基层地区的推广。

3、利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术（Xpert MTB/RIF）：是以聚合酶链反应为基础，通过对利福平耐药基因（ropB突变基因）进行核酸扩增技术，能检测结核杆菌杆菌和利福平耐药。