固定化技术资料
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1）.选择最佳条件操作（如温度、pH）， 2）.选吸附量大的载体，控制酶和载体量， 3）.采用高酶量吸附； 4）.开发新载体， 5）.对酶进行修饰后再进行交换吸附。
如烃基-琼脂糖衍生物吸附在酸性pH的酶(脲 酶)用亲和吸附剂 ConA-葡聚糖能专一吸附糖蛋白。
对酶进行修饰以后再与载体结合，胰蛋白酶 +丙烯酸与顺丁烯二酸酐的水溶性共聚体共价偶联 再加DEAE-纤维素与之结合。
不变 不变 可变
可变
吸附法：
1、物理吸附(氢键、疏水键等作用力将酶固定于不溶性载
体上)
无机吸附剂（高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等）吸附量 小、有些酶发生吸附变性
有机吸附剂（纤维素、胶原等）吸附量略大(～50mg/g 载体),不产生变性失活，比较受重视。
有些微生物分泌胶水一样的粘多糖，使微生物与固体物 质固定化。
2、离子交换法吸附：
在合适条件下（pH、离子强度），酶的侧链 与载体发生离子交换的作用而达到的固定化， CM-纤维素、DEAE-纤维素，吸附量 50—150mg/g 优点：
操作方便，条件温和，可再生后反复使用
缺点：
吸附力弱，不适宜的pH,高盐浓度，高底物浓度， 高温等都能把吸附的酶解吸下来。
可以改善方法：
可以看成一般化学反应的固体催化剂一样对待，既具有 酶的催化特性又具有一般化学催化剂是具有一种容易回收， 反复使用，成为可连续化、自动化的水不溶性酶，称固定 化酶，有时也叫水不溶酶。
固定化酶现在的发展是不一定全是酶，研究可以用细胞 或细胞器、菌体。统称为固定化催化剂。
4.2固定化酶的优点
溶性酶的缺点：
格型包埋 微囊包埋
现在又有多孔物质包络法，超过滤法等。实际上， 用包埋法最多。
各种固定化方法的优缺点比较
吸附法
固定化方法 物理吸附法 离子吸附法 包埋法 共价键结合法 交联法
制备难易
易
易
较难
难
较难
结合程度
弱
中等
强
强
强
活力回收 高,酶易流失
高
高
低
中等
再生
可能
可能 不能 不能
不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
超过滤法吸附细胞：
利用超过滤膜将细胞固定化。底物和产物可以 自由进出超过滤膜，而膜内的细胞却出不来。制 备成膜反应器和生物传感器。但是需要防止细胞 生长导致浓度过高而使超过滤膜破裂。
采用的吸附方法：
1].静态吸附：自然吸附、解吸、再吸附的固定化方 法。效率低，时间比较长，而且不完全。
2].电沉积：在载体附近加电极，酶移向载体表面的 固定化方法。需要酶在电场中不破坏，保持原来 酶性能。。
如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶固定化，偶联到重氮化 的电中性载体如对氨基苄基纤维素时，产生固定化 酶无活性。偶联到重氮化的苯胺-多孔玻璃时，得 到固化酶都具很高酶活性。
2） 异硫氰酸反应 含芳香氨基的载体先用硫芥子（或者光气）
处理成异硫氰酸盐的衍生物，这种产物在温和条件 下，优先与酶分子的氨基反应，在中性pH下优先 与α-氨基反应，可达到选择性偶联的目的。
第四章
固定化酶和细胞
Immobilized Enzymes and Cells
固定化酶是酶工程研究中的一个重要领域
4.1 什么是固定化酶
固定化酶被确定下来是在1971年第一届国际酶工程会 议上提出并确定的。固定化酶是设计一种方法，使酶被束 缚在特殊的载体上，使它与整体的流动相分隔开，但能进 行底物与效应物等的分子交换。
3].动力法固定化：酶与载体混合后搅拌等条件下进 行固定化，注意速度，不破坏酶和载体。
4].反应器固定化：载体装入反应器，再循环加入酶 溶液达到固定化。但是吸附少，不适合的条件 （pH、盐等）容易解吸。注意操作条件。
最主要的、且更加有效的策略还是开发新的 吸附剂。
共价偶联：
通过载体的功能基团与酶侧链基团上非必需基团共 价结合，制备成的固体酶的方法。
结果：结合力增大(吸附量也大),也相当稳定，使 用寿命长，有时可以连续使用3个星期。
多孔物质包络法吸附细胞：
利用棉布、尼龙布、金属死网、海绵、塑料 等固定化放线菌、真菌组成盘状生物反应器，进 行连续生产有机酸、糖化酶、四环素。
这些材料有足够大，但空隙又不十分大的空 隙，能够使细胞进入空隙，通常为细胞直径的几 倍大。
优点：应用最广，固定化结合牢、稳定而酶不丢失， 可以连续使用。
1．载体要求：
亲水载体优于疏水载体（酶蛋白结合量，固 定化后酶活性，稳定性方面都比较好），而 且亲水基存在可以减少疏水基的有害影响。 载体特点：
1).结构松 2).表面积大 3).机械强度大 4).带有在温和条件下可与酶侧链基团共价偶 联的功能基团 5).没有或很少有非专一性吸附
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对 其有影响），
2.不能回收，无法自动化、连续化生产， 3.专一性高。
固定化酶优点：
1.可以提高稳定性 2.能回收，自动化，连续化 3.专一性减弱 4.提高抗有机溶剂的能力
4.3固定化方法： 固定化方法
吸附法
共价偶联法 交联法 包埋法
物理 离子交 固定化 偶联 吸附法 换吸附 载体 反应
一般与亲和层析所需载体的要求、标准一致
如:天然纤维素或衍生物 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖
合成的：
聚丙烯酰胺 多聚氨基酸 聚苯乙烯，尼龙
机械性能好，但有疏水结构
2．偶联方法：
偶联成功与否取决于： 载பைடு நூலகம்：功能基团，芳香氨基，羧基，羧甲基等 酶分子:侧链非必需基团 （游离的α--氨基，lys—ζ—NH2, Arg-胍基 C-COOH, Asp—γ-羧基，Glu-羧基， 酚羟基，巯基，咪唑基)
但是，载体、酶分子上的基团不会直接反应， 其功能基团要活化。
1)重氮化 芳香氨基载体 方法特点：
载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，再在 温和条件下和酶分子上相应基团直接偶联。
芳香族重氮化具疏水性，倾向于进入蛋白质 分子中Tyr等集中的疏水区并偶联化而导致失效。
a.当载体为电中性或疏水性时，这种倾向性越大。 b.当载体用亲水极性物质时，这种疏水区的特性就 大大减小了。
3） 溴化氰-亚氨碳酸基反应 带羟基的载体纤维素、葡聚糖、琼脂糖等是最
常用的载体。在碱性条件下，载体的OH基和溴化 氰反应，生成活泼的亚氨碳酸基，在弱碱中直接和 酶的氨基进行共价偶联。 最后一种是主要产物。
如烃基-琼脂糖衍生物吸附在酸性pH的酶(脲 酶)用亲和吸附剂 ConA-葡聚糖能专一吸附糖蛋白。
对酶进行修饰以后再与载体结合，胰蛋白酶 +丙烯酸与顺丁烯二酸酐的水溶性共聚体共价偶联 再加DEAE-纤维素与之结合。
不变 不变 可变
可变
吸附法：
1、物理吸附(氢键、疏水键等作用力将酶固定于不溶性载
体上)
无机吸附剂（高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等）吸附量 小、有些酶发生吸附变性
有机吸附剂（纤维素、胶原等）吸附量略大(～50mg/g 载体),不产生变性失活，比较受重视。
有些微生物分泌胶水一样的粘多糖，使微生物与固体物 质固定化。
2、离子交换法吸附：
在合适条件下（pH、离子强度），酶的侧链 与载体发生离子交换的作用而达到的固定化， CM-纤维素、DEAE-纤维素，吸附量 50—150mg/g 优点：
操作方便，条件温和，可再生后反复使用
缺点：
吸附力弱，不适宜的pH,高盐浓度，高底物浓度， 高温等都能把吸附的酶解吸下来。
可以改善方法：
可以看成一般化学反应的固体催化剂一样对待，既具有 酶的催化特性又具有一般化学催化剂是具有一种容易回收， 反复使用，成为可连续化、自动化的水不溶性酶，称固定 化酶，有时也叫水不溶酶。
固定化酶现在的发展是不一定全是酶，研究可以用细胞 或细胞器、菌体。统称为固定化催化剂。
4.2固定化酶的优点
溶性酶的缺点：
格型包埋 微囊包埋
现在又有多孔物质包络法，超过滤法等。实际上， 用包埋法最多。
各种固定化方法的优缺点比较
吸附法
固定化方法 物理吸附法 离子吸附法 包埋法 共价键结合法 交联法
制备难易
易
易
较难
难
较难
结合程度
弱
中等
强
强
强
活力回收 高,酶易流失
高
高
低
中等
再生
可能
可能 不能 不能
不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
超过滤法吸附细胞：
利用超过滤膜将细胞固定化。底物和产物可以 自由进出超过滤膜，而膜内的细胞却出不来。制 备成膜反应器和生物传感器。但是需要防止细胞 生长导致浓度过高而使超过滤膜破裂。
采用的吸附方法：
1].静态吸附：自然吸附、解吸、再吸附的固定化方 法。效率低，时间比较长，而且不完全。
2].电沉积：在载体附近加电极，酶移向载体表面的 固定化方法。需要酶在电场中不破坏，保持原来 酶性能。。
如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶固定化，偶联到重氮化 的电中性载体如对氨基苄基纤维素时，产生固定化 酶无活性。偶联到重氮化的苯胺-多孔玻璃时，得 到固化酶都具很高酶活性。
2） 异硫氰酸反应 含芳香氨基的载体先用硫芥子（或者光气）
处理成异硫氰酸盐的衍生物，这种产物在温和条件 下，优先与酶分子的氨基反应，在中性pH下优先 与α-氨基反应，可达到选择性偶联的目的。
第四章
固定化酶和细胞
Immobilized Enzymes and Cells
固定化酶是酶工程研究中的一个重要领域
4.1 什么是固定化酶
固定化酶被确定下来是在1971年第一届国际酶工程会 议上提出并确定的。固定化酶是设计一种方法，使酶被束 缚在特殊的载体上，使它与整体的流动相分隔开，但能进 行底物与效应物等的分子交换。
3].动力法固定化：酶与载体混合后搅拌等条件下进 行固定化，注意速度，不破坏酶和载体。
4].反应器固定化：载体装入反应器，再循环加入酶 溶液达到固定化。但是吸附少，不适合的条件 （pH、盐等）容易解吸。注意操作条件。
最主要的、且更加有效的策略还是开发新的 吸附剂。
共价偶联：
通过载体的功能基团与酶侧链基团上非必需基团共 价结合，制备成的固体酶的方法。
结果：结合力增大(吸附量也大),也相当稳定，使 用寿命长，有时可以连续使用3个星期。
多孔物质包络法吸附细胞：
利用棉布、尼龙布、金属死网、海绵、塑料 等固定化放线菌、真菌组成盘状生物反应器，进 行连续生产有机酸、糖化酶、四环素。
这些材料有足够大，但空隙又不十分大的空 隙，能够使细胞进入空隙，通常为细胞直径的几 倍大。
优点：应用最广，固定化结合牢、稳定而酶不丢失， 可以连续使用。
1．载体要求：
亲水载体优于疏水载体（酶蛋白结合量，固 定化后酶活性，稳定性方面都比较好），而 且亲水基存在可以减少疏水基的有害影响。 载体特点：
1).结构松 2).表面积大 3).机械强度大 4).带有在温和条件下可与酶侧链基团共价偶 联的功能基团 5).没有或很少有非专一性吸附
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对 其有影响），
2.不能回收，无法自动化、连续化生产， 3.专一性高。
固定化酶优点：
1.可以提高稳定性 2.能回收，自动化，连续化 3.专一性减弱 4.提高抗有机溶剂的能力
4.3固定化方法： 固定化方法
吸附法
共价偶联法 交联法 包埋法
物理 离子交 固定化 偶联 吸附法 换吸附 载体 反应
一般与亲和层析所需载体的要求、标准一致
如:天然纤维素或衍生物 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖
合成的：
聚丙烯酰胺 多聚氨基酸 聚苯乙烯，尼龙
机械性能好，但有疏水结构
2．偶联方法：
偶联成功与否取决于： 载பைடு நூலகம்：功能基团，芳香氨基，羧基，羧甲基等 酶分子:侧链非必需基团 （游离的α--氨基，lys—ζ—NH2, Arg-胍基 C-COOH, Asp—γ-羧基，Glu-羧基， 酚羟基，巯基，咪唑基)
但是，载体、酶分子上的基团不会直接反应， 其功能基团要活化。
1)重氮化 芳香氨基载体 方法特点：
载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，再在 温和条件下和酶分子上相应基团直接偶联。
芳香族重氮化具疏水性，倾向于进入蛋白质 分子中Tyr等集中的疏水区并偶联化而导致失效。
a.当载体为电中性或疏水性时，这种倾向性越大。 b.当载体用亲水极性物质时，这种疏水区的特性就 大大减小了。
3） 溴化氰-亚氨碳酸基反应 带羟基的载体纤维素、葡聚糖、琼脂糖等是最
常用的载体。在碱性条件下，载体的OH基和溴化 氰反应，生成活泼的亚氨碳酸基，在弱碱中直接和 酶的氨基进行共价偶联。 最后一种是主要产物。