双向电泳PPT

IPG胶条的水化
泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形 式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。 不同的加样方法和加样量会导致最终结果的 差异：主动水化 被动水化 时间：12-16h
蛋白载样量
影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括： 待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。 电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需 考虑太多其它因素。 待研究蛋白的丰度： 样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的 了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。 如果将待检样品被富集以后则更易分析。 IPG胶条的pH范围及长度：
存在问题： 1.蛋白纯化方法还有待进一步摸索。 2.二向凝胶上得到的蛋白点数量较少，有拖 尾现象，且点与点的分离度不好，具体原 因有待进一步研究。
实验计划： 1.继续使用7cm胶条摸索样品的制备流程。 2.条件摸索成熟后，改用窄PH范围的非线性 长胶条来分离目的蛋白。并改变染色方法。 3.分析比较各处理组，找到差异蛋白后，进 行质谱分析，并用western blot验证。
凝胶的图像处理分析和
典型流程
凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递和解释： 2-DE数据库的建立：
蛋白质的胶内酶切
包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝 胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程
样品制备
与IPG胶条水化 胶内直接染色
IPG电泳
两维间的平衡
一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片 塑料膜间于－80°C保存数月。 但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被 分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS-PAGE 是电泳能顺利进行。 平衡过程导致蛋白丢失约5%-25%，还会使分辨率 降低，平衡30min时蛋白带变宽40%，缩短平衡时 间可以减少扩散，但同时会减少向第二向的转移， 所以平衡时间要充分长（至少2×10min），但不要 超过2×15min。
目前进展： 1.双向电泳试验流程已掌握熟练，基本摸清 7cm胶条第一向等电聚焦的设置程序与第 二向凝胶电泳起始电压与终止电压大小。 2.通过观察凝胶电泳上蛋白点的分布，大致 了解到肾脏蛋白的等电点范围与分子量大 小范围。 3.采用相同蛋白提取方案及相同的双向电泳 条件，比较了使用不同除杂方法（①加入 RNase及DNase②冷丙酮沉淀③不做任何 除杂处理）纯化蛋白对结果的影响。
一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG）：
IPG胶的材料是Immobilines，为拥有 CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物 系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成 了分布在pH3~10不同值的缓冲体系。根据公 布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混 合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过 乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH 梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗 透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达 到真正的平衡状态。
2. 多糖的清除 Ø 对电泳的影响：带负电的多糖会与蛋白形成复合物， 导致拖尾和影响聚焦。 Ø 解决的方法：利用超离心和高pH，高离子强度，和 TCA等沉淀法。
3. 去污剂的清除
Ø 对电泳的影响：SDS能与蛋白形成带负电的复合物， 对等电聚焦影响大，需要清除。 Ø 解决的方法：用含载体两性电解质或两性离子去污剂 （CHAPS、Triton X-100或NP-40）的溶胀液稀释，或者 丙酮沉淀法。 4. 盐离子和外源带电小分子的清除 Ø 对电泳的影响：样品中的盐会增加凝胶条的电导，使 其无法达到设置的电要，从而影响蛋白质聚焦，带电小分 子会引起水的流动，使胶条的一端肿胀而另一端变干，导 致两端的酸、碱性蛋白无法聚焦，造成拖尾或丢失。 Ø 解决的方法：常用透析去除盐成分，TCA-丙酮沉淀法 可以清除小分子。
双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括 多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰 （如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证 待研究蛋白的可检测性。
Western Blot与Southern印迹杂交或Northern杂 交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰 胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗 体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相 载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以 非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的 多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的 蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反 应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经 过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异 性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。
2、双向电泳 定义：
双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等电聚焦电泳和SDSPAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳 （按照PI分离），然后再进行SDS-PAGE （按照分子大小），经染色得到的电泳图 是个二维分布的蛋白质图。 2-DE技术是大多数蛋白质组研究中分 离复杂蛋白质混合物的首选技术。
4.起载体作用的两性电解质： 即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下， 某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持 其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI 点时会发生沉淀。 Carrier ampholytes的作用在于捕获样品 中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应 用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。 浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保 证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶 条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。
IPG IEF 中pH梯度的选择
常用方法：先宽后窄，先线性后非线性， 先短后长，预试验确定。
聚焦时间的优化
理论上讲，要获得最好的图谱质量和重复性所需 最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。 聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。 过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会 因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出 （电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产 生水平条纹以及蛋白丢失。 最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、 pH范围和胶条长度通过经验来确定。
与上样缓冲液浸润 SDS-PAGE
染色
转PVDF膜
取出蛋白点
浓缩于多孔吸附柱上 胰酶等消化 反向HPLC分离 MALDI-MS， PSD片段分析 示知 ESI-MS-MS、微测序
MALDI-MS肽指纹图
数据库查询 已知 蛋白质鉴定
质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程
Western Blot中文一般称为蛋白质印迹。 它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学 中常用的一种实验方法。其基本原理是通 过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或 生物组织样品进行着色。通过分析着色的 位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析 的细胞或组织中的表达情况的信息。
Hale Waihona Puke Baidu
生物学问题 的提出
实验模型 的设计 感兴趣 蛋白点 的切取
实验组和对照组 样品的制备
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析 质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现
蛋白信息的 初步获得
其它实验的进一步 验证（western blot 等）
实验进展情况汇报
研究生：罗珊珊 导 师：可 燕 副研究员
一、
前
言
二、
实验设计 目前进展 总 结
三、
四、
五、
实验计划
前言：
1、高血压与肾脏的关系
肾脏是高血压损害的重要靶器官，目前， 在蛋白质水平对高血压肾损害的发病机制还相当 有限。 蛋白质组学：可视为分子生物学的大规模筛 选技术，目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分 布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它 们的关系与功能。
二维SDS-PAGE
同普通SDS-PAGE类似。 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因 为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可 以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶） 充当了浓缩胶。
2-DE 胶蛋白质点的检测方法大致有： 考马斯亮蓝染色法； 银染法； 负染法； 荧光染色法； 放射性同位素标记法等。 这几种检测方法的灵敏度各不相同。 目前最常用的是银染法和考染法。由于银 染的灵敏度是考染的 50 倍，故一般用银染 法进行分析处理，再用考染法来进行样品 微量制备。
增加样品溶解性的手段
1.变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分 伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的 能量域。其典型代表是尿素和硫尿。 2.表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水 基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。 常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂 Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、 OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。 3.还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用 还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。 常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷 的三丁基膦（TBP）进行还原。
去除杂质 ——关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰 在样品中常常会含有像核酸、多糖、去污剂和代谢物 等非蛋白质杂质，需要去除，否则会影响双向电泳的结果， 这个过程有时会造成蛋白的丢失以及蛋白的化学修饰和解 聚，特别是后者会导致双向电泳图谱中蛋白点的增多（由 于电荷的改变），所以操作中要多加注意。 1. 核酸的清除 Ø 对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物 后会出现假象迁移和条纹。 Ø 解决的方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进 行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸 结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。
样品的溶解
是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。 溶解的目标： 1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完 全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品 中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的 蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下 降）； 2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂 类、多糖和核酸等物质的去除； 3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状 态。