(优选)人教版高中生物选修一血红蛋白的提取和分离

1.通过进行探究实验，结合观看实验视频，能够 尝试从血液中提取和分离血红蛋白 2.通过阅读资料，结合教师讲解，能够了解色谱 法、电泳法等分离生物大分子的基本原理
1 基础知识
（一）凝胶色谱法
1、概念：根据被分离物质（如蛋白质）相对分子 质量的大小，利用具有多孔网状结构的凝胶的分 子筛作用，来进行分离。
（优选）人教版高中生物选修 一血红蛋白的提取和分离
思考
1、分离生物大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理 或化学性质的生物大分子。 2、蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大 小、所带电荷的性质和多少、溶解度等等，可以 用来分离不同种类的蛋白质。
性质：微小的多孔球体 本质：多糖类化合物 实例：葡聚糖、琼脂糖
2、原理：
当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ 相对分子质量较小） 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ 较长），移动 速度（ 较慢 ），而（相对分子质量较大）的蛋白质无法 进入凝胶内部的通道，只能在（ 凝胶外部 ）移动，路程 （ 较短 ），移动速度（ 较快 ），相对分子质量不同的
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所 带电荷相反的电极移动。 ③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的 差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分 子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分 子的分离。
3、类型：琼脂糖凝胶电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳
蛋白质因此得以分离。
3、具体过程
（二）缓冲溶液
1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、 强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。 2、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影 响，维持pH基本不变。 3、配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。 调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使 用的缓冲液。
血液 100mL
低速离心 2 min
血浆 红细胞
重复洗涤3次，直至上清液没有黄色
红细胞
搅拌10min
问题： ①刚采集的血样要做怎样的处理？为什么？ 加入抗凝血剂，防止血液凝固。 ②洗涤的目的是什么？ 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。 ③洗涤干净的标志是什么？ 直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。
3. 你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的 移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分 离效果？
若凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的 话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、 平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散 乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的 装填有关。
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱 旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得 均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色 葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。若 色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。 如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气 泡，消除不了时要重新装柱。
思考
在提取血红蛋白实验中用的缓冲液是什么？ 它的目的是什么？
使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模 拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和 功能，便于观察（红色）和材料的科学研究。
思考
你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶 的装填要紧密、均匀吗？
如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色 谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的 样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动 次序，影响分离的效果。
2.释放血红蛋白
阅读思考：
释放血红蛋白过程中，在洗涤好红细胞加入了哪 些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？
目的分析： ①蒸馏水的作用是___使__红__细__胞__大__量__吸__水__胀__裂____。 ②加入甲苯的作用是___溶__解__红__细__胞__的__细__胞__膜____。 ③充分搅拌的目的是___加___速__红__细__胞__的__破__裂_____。
分离过程
红细胞 混合液
3.分离血红蛋白
脂类物质
高速离心 10min
滤纸 过滤
烧杯
离心管
有机溶剂 血红蛋白
（二）凝胶色谱操作
1、 凝胶色谱柱的制作 打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管 2、凝胶色谱柱的装填 固定色谱柱→配凝胶悬液→装填色谱柱→洗涤平衡 3、样品的加入和洗脱 调节缓冲液面→滴加透析样品→样品渗入凝胶床→ 洗脱→收集分装蛋白质
1.调液面
样品的加入和洗脱
2.加样 3.再调液面
4.洗脱
缓冲液
凝胶
5.收集
注意事项
1.红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2.色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液 不能断流。 3.凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡 4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。
应用：测定蛋白质分子量、进行蛋白质纯度鉴定 原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决
于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 SDS：消除净电荷对迁移率的影响。
2 实验操作
（一）样品处理
1、 红细胞的洗涤 2、血红蛋白的释放 3、分离血红蛋白溶液 4、透析
3g柠檬酸钠
1来自百度文库红细胞的洗涤
析出血浆 5倍体积生理盐水
你认为在血红蛋白整个实验中用的缓 冲液是什么？目的是什么？
本实验使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液 模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构 和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。
（三）电泳
1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移过程。 2、原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上 正电或负电。
3 结果分析评价
1. 你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后 的样品发生了哪些变化吗？
观察你处理的血液样品离心后是否分层？若分层不明 显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白原因。此外， 离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉 淀，得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白提取纯度。
2. 你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱 柱装填得成功吗？你是如何判断的？