核酸的定量测定.
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2. 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏 度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖（五碳糖 ）也有同样反应。其它多数糖类，包括核糖在 内，一般无此反应。
• 三、 实验步骤
• 1. 取同样规格的试管7支，按下表顺序分别精 确地加入各试剂。
编号
1
2
3
4
5
6
7
DNA标准液(200ug/mL) 蒸馏水(mL)
2. 钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。 当使用维生素C为还原剂时，测定的最适范围 为1-10微克无机磷。
3. 测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过 氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未 消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷 量。
4. RNA的理论含磷量为9.5%，故由所测的核 酸含磷量可计算出核酸含量。
核酸的定量测定
紫外吸收法 核酸的凝胶电泳 定磷法 二苯胺法 地衣酚法
紫外吸收法 实验原理
核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有 吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸 的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升 溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值） （表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以 计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅 速，并对被测样品无损，用量也少。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
用于小片段DNA的分析 相对分子质量小于1000bp的DNA 片断和RNA的电泳。 PAGE中一般不含RNase，用于 RNA分析时不会分解样品。
定磷法
百度文库
二、实验原理
1. 在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼 酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸， 当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的 还原产物——钼蓝。
0.00
4
0.60 2.40 3.00 0.00
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0.80 2.20 3.00 0.00
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1.00 2.00 3.00 0.00
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0.00 2.00 3.00 1.00
0.00 2.00 3.00 0.00
0.00 1.00
相当于无机磷量(微克) 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 A
消化的RNA溶液(0.06mg/mL) ：
取0.6mg酵母RNA，加入1.5M H2SO4溶液 10mL，在沸水浴中加热10-20分钟，使核酸 充分水解后，用于对各组分的鉴定。
未消化的RNA溶液(0.06mg/mL) :
取0.6mg酵母RNA,加入蒸馏水10mL，5565度消化半小时。
三、 实验步骤
B
2. 将试管内溶液立即摇匀，于45℃恒温水浴内保温3045分钟。取出冷却至室温，于660nm处测定OD(光密 度)值。
3. 以1-6号管标准磷含量（微克）为横坐标，光密度为纵 坐标，绘出标准曲线。
二苯胺法
二、实验原理
1. 脱氧核糖核酸中的2-脱氧核糖在酸性环境中与 二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm 处有最大吸收。DNA在40-400微克范围内，光 密度与DNA的浓度成正比。
试剂和器材
• 试剂：
• 材料
• 钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取 3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼 酸铵溶于96.4mL蒸馏水中， 即成0.25%钼酸铵－2.5%过 氯酸溶液。
酵母RNA干粉。
• 5-6%氨水：用25-30%氨水稀 释5倍。
操作方法
1.准确称取待测核酸样品0.5g，加少量0.01mol/L NaOH调成 糊状,再加适量水，用5-6%氨水调至pH7.0，定容至50mL。
2.取两支离心管，甲管加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水，乙管 加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂。混匀，在冰浴上放置 30min。
3.在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5 mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英 比色杯，在260nm波长处测定A值。
4.测定A280的值。求出A260/A280.判断RNA的纯度。 RNA=A260/A280=2.0
二、计算公式
ΔA260
RNA浓度 =
xN
0.024 x L
式中， ΔA260为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释 液在260nm波长处A值；
L ──比色杯的厚度，1cm；
N ——为稀释倍数；
0.024──每毫升溶液内含1μgRNA的A值；
1mL待测样品液中核酸（微克）
核酸％ ＝
1mL待测样品液中制品的毫克数
琼脂糖凝胶电泳常用于DNA分析；分析RNA时需 加入蛋白质变性剂甲醛。电泳完毕用溴化乙锭 （0.5μg/mL）染色，用紫外光检测
★琼脂糖电泳用于DNA 分子量的测定
在同一凝胶中加入已 知相对分子质量的样 品（分子marker) ， 在电泳完成后，通过 染色，照相，从照片 上比较待测样品的 DNA片段与标准样品 中的已知大小片段， 可以推测待测未知 DNA片段的分子大小。
（一）琼脂糖凝胶电泳
用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分 离范围广。
电泳迁移率决定于： （1）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比） （2）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用0.7～1%） （3）DNA的构象：超螺旋＞线状分子＞开环状分子
（4）电压 （一般5V/cm,电压与迁移率成正比) （5）碱基组成（影响不大） （6）温度（4～30℃都可以，常室温进行）
1. 取同样规格的试管8支，按下表顺序分别精确 地加入各试剂。
编号
标准磷溶液 10ug/mL(mL)
1 0.00
水(mL)
3.00
定磷试剂
3.00
消化的RNA(0.06mg/ml)
未消化的 RNA(0.06mg/ml)
0.00 0.00
2
0.20 2.80 3.00 0.00
0.00
3
0.40 2.60 3.00 0.00
在本实验中，1mL待测液中制品量为50μg。
注意事项
1. 紫外分光光度计使用前要预热。
2. 比色皿应成套使用，注意保护,不能拿在光面上。
3. 离心机使用前必须将离心管平衡，对称放置。调速必须 从低到高，离心完等转子完全停下后，再打开盖子，然 后将转速打到最低。
核酸的凝胶电泳
是当前核酸研究中最常用的方法。有许多的 优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的 有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
• 三、 实验步骤
• 1. 取同样规格的试管7支，按下表顺序分别精 确地加入各试剂。
编号
1
2
3
4
5
6
7
DNA标准液(200ug/mL) 蒸馏水(mL)
2. 钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。 当使用维生素C为还原剂时，测定的最适范围 为1-10微克无机磷。
3. 测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过 氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未 消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷 量。
4. RNA的理论含磷量为9.5%，故由所测的核 酸含磷量可计算出核酸含量。
核酸的定量测定
紫外吸收法 核酸的凝胶电泳 定磷法 二苯胺法 地衣酚法
紫外吸收法 实验原理
核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有 吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸 的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升 溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值） （表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以 计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅 速，并对被测样品无损，用量也少。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
用于小片段DNA的分析 相对分子质量小于1000bp的DNA 片断和RNA的电泳。 PAGE中一般不含RNase，用于 RNA分析时不会分解样品。
定磷法
百度文库
二、实验原理
1. 在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼 酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸， 当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的 还原产物——钼蓝。
0.00
4
0.60 2.40 3.00 0.00
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0.80 2.20 3.00 0.00
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0.00 2.00 3.00 0.00
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相当于无机磷量(微克) 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 A
消化的RNA溶液(0.06mg/mL) ：
取0.6mg酵母RNA，加入1.5M H2SO4溶液 10mL，在沸水浴中加热10-20分钟，使核酸 充分水解后，用于对各组分的鉴定。
未消化的RNA溶液(0.06mg/mL) :
取0.6mg酵母RNA,加入蒸馏水10mL，5565度消化半小时。
三、 实验步骤
B
2. 将试管内溶液立即摇匀，于45℃恒温水浴内保温3045分钟。取出冷却至室温，于660nm处测定OD(光密 度)值。
3. 以1-6号管标准磷含量（微克）为横坐标，光密度为纵 坐标，绘出标准曲线。
二苯胺法
二、实验原理
1. 脱氧核糖核酸中的2-脱氧核糖在酸性环境中与 二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm 处有最大吸收。DNA在40-400微克范围内，光 密度与DNA的浓度成正比。
试剂和器材
• 试剂：
• 材料
• 钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取 3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼 酸铵溶于96.4mL蒸馏水中， 即成0.25%钼酸铵－2.5%过 氯酸溶液。
酵母RNA干粉。
• 5-6%氨水：用25-30%氨水稀 释5倍。
操作方法
1.准确称取待测核酸样品0.5g，加少量0.01mol/L NaOH调成 糊状,再加适量水，用5-6%氨水调至pH7.0，定容至50mL。
2.取两支离心管，甲管加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水，乙管 加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂。混匀，在冰浴上放置 30min。
3.在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5 mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英 比色杯，在260nm波长处测定A值。
4.测定A280的值。求出A260/A280.判断RNA的纯度。 RNA=A260/A280=2.0
二、计算公式
ΔA260
RNA浓度 =
xN
0.024 x L
式中， ΔA260为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释 液在260nm波长处A值；
L ──比色杯的厚度，1cm；
N ——为稀释倍数；
0.024──每毫升溶液内含1μgRNA的A值；
1mL待测样品液中核酸（微克）
核酸％ ＝
1mL待测样品液中制品的毫克数
琼脂糖凝胶电泳常用于DNA分析；分析RNA时需 加入蛋白质变性剂甲醛。电泳完毕用溴化乙锭 （0.5μg/mL）染色，用紫外光检测
★琼脂糖电泳用于DNA 分子量的测定
在同一凝胶中加入已 知相对分子质量的样 品（分子marker) ， 在电泳完成后，通过 染色，照相，从照片 上比较待测样品的 DNA片段与标准样品 中的已知大小片段， 可以推测待测未知 DNA片段的分子大小。
（一）琼脂糖凝胶电泳
用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分 离范围广。
电泳迁移率决定于： （1）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比） （2）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用0.7～1%） （3）DNA的构象：超螺旋＞线状分子＞开环状分子
（4）电压 （一般5V/cm,电压与迁移率成正比) （5）碱基组成（影响不大） （6）温度（4～30℃都可以，常室温进行）
1. 取同样规格的试管8支，按下表顺序分别精确 地加入各试剂。
编号
标准磷溶液 10ug/mL(mL)
1 0.00
水(mL)
3.00
定磷试剂
3.00
消化的RNA(0.06mg/ml)
未消化的 RNA(0.06mg/ml)
0.00 0.00
2
0.20 2.80 3.00 0.00
0.00
3
0.40 2.60 3.00 0.00
在本实验中，1mL待测液中制品量为50μg。
注意事项
1. 紫外分光光度计使用前要预热。
2. 比色皿应成套使用，注意保护,不能拿在光面上。
3. 离心机使用前必须将离心管平衡，对称放置。调速必须 从低到高，离心完等转子完全停下后，再打开盖子，然 后将转速打到最低。
核酸的凝胶电泳
是当前核酸研究中最常用的方法。有许多的 优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的 有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。