微生物检验的基本技术

图4-4 斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞
液体接种法
1.如斜面接种法持好菌种管及培养基管。 1.如斜面接种法持好菌种管及培养基管。 2.灭菌接种环，从菌种管取菌，伸入培养基管中，在接近 2.灭菌接种环，从菌种管取菌，伸入培养基管中，在接近 液面的管壁上方轻轻研磨，并沾取少许培养基液体调和， 使细菌混合于培养基的液体中。液体培养基一般以 18~24小时培养后观察生长特征。 18~24小时培养后观察生长特征。 肉汤培养可观察如下几项：
接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接 种的器具必须经干热或火焰等灭菌。 接种环的火焰灭菌方法： 接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上 充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过 火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环 冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体， 迅速地接种到新的培养基上。然后，将接种环从柄 部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环， 以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。 平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿 的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养 基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边， 试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。
斜面接种法
主要用于经划线分离培养所获得的单个 菌落的移种，以及观察细菌的某些培养特征。 菌落的移种，以及观察细菌的某些培养特征。 以菌种移种为例，其接种方法是： 1.取一菌种管和培养基管，置左手食指、中指、 1.取一菌种管和培养基管，置左手食指、中指、 无名指间，拇指压住两管底部上侧面，使菌 种管位于外侧，培养基管位于内侧。 2.右手拇指和食指分别旋松两管棉塞。火焰灭 2.右手拇指和食指分别旋松两管棉塞。火焰灭 菌接种环。 3. 以右手小指与手掌，小指与无名指分别夹取 棉塞（先外管后内管），将两管口迅速通过 火焰1~2次。 火焰1~2次。
菌落形态观察
1)大小:以mm表示。菌落的大小随细菌种类、 1)大小 mm表示。菌落的大小随细菌种类、 大小: 培养基及培养时间等条件而不同。同一种细 菌在同一平板上，在密集处的菌落比疏散处 菌在同一平板上，在密集处的菌落比疏散处 小。因此，表示菌落大小时，应注明培养基 名称。一般以培养18~24小时后，选散在处 名称。一般以培养18~24小时后，选散在处 18~24 的菌落大小。1mm 的菌落大小。1mm左右为小菌落；2~3mm 1mm左右为小菌落；2~3mm 为中等大；3mm以上 为中等大；3mm以上为大菌落。 以上为大菌落。 2)形状及边缘：圆形、不规则、放射状、树根 2)形状及边缘 形状及边缘： 状、边缘整齐、波形、锯齿状、卷发状等。 3)隆起：平的、突起的、凸面的、凸形的等。 3)隆起 平的、突起的、凸面的、凸形的等。 隆起： 4)表面：光滑（S型）、粗糙（R型）；有无光 4)表面 光滑（S型）、粗糙（R 表面： 泽等。
4.将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上 4.将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上 取菌少许，迅速伸入待接种的培养基管中， 在斜面底部向上划一条直线， 在斜面底部向上划一条直线，然后从底部起 向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端。 向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端。 5.取出接种环，火焰灭菌管口，塞上棉塞（先 5.取出接种环，火焰灭菌管口，塞上棉塞（先 塞内管）；最后将接种环经火焰灭菌放好。 6.做好标识，置35℃培养 6.做好标识，置35℃ 箱中培养18~24小时。 箱中培养18~24小时。 斜面培养一般形成均匀一 致的菌苔。一般可观察表 面、透明度、色泽等特征。
BS
SS
XLD
DHL
科玛嘉显色
沙门氏菌在各种选择性琼脂平板的典型特征
选择性琼脂平板 BS琼脂 BS琼脂 菌落特征 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色， 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌 落周围培养基可呈黑色或棕色； 落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株 形成灰绿色的菌落， 形成灰绿色的菌落，周围培养基不变 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心， 株可呈现大的带光泽的黑色中心， 株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现 全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落， 全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落， 带或不带黑色中心 蓝绿色或蓝色， 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全 部黑色；有些菌株为黄色， 部黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几 乎全黑色 菌落为紫红色
a.发育程度：有无生长、微弱、中等、旺盛。 a.发育程度：有无生长、微弱、中等、旺盛。 b.混浊度：有无及程度（混、中等、微混、透明）、均匀混浊、 b.混浊度：有无及程度（混、中等、微混、透明）、均匀混浊、 有颗粒、絮状生长。 c.沉淀: c.沉淀:有无及量多少、性状（粉状、颗粒状、絮状、沾性）。 d.表面：有无生长、性状（膜状、环状）、菌膜厚薄及表面特征 d.表面：有无生长、性状（膜状、环状）、菌膜厚薄及表面特征 （光滑、颗粒、皱状）。 e.其他：有无特殊气味，色素。如果是糖发酵培养基则主要观察 e.其他：有无特殊气味，色素。如果是糖发酵培养基则主要观察 是否产酸和有无气体。
大肠杆菌显色培养基 大肠杆菌显蓝绿色，大肠菌群显无色， 大肠杆菌显蓝绿色，大肠菌群显无色，其它 菌显黄色或无色，革兰氏阳性菌被抑制。 菌显黄色或无色，革兰氏阳性菌被抑制。
沙门氏菌
普通琼脂：生长不良； 普通琼脂：生长不良； 麦康凯：琼脂上形成灰白 麦康凯：琼脂上形成灰白 色菌落。 色菌落。 SS:产生较小、黑色菌落。 SS:产生较小、黑色菌落。 产生较小 菌落
接种法与纯培养的分离技术
含有一种以上的微生物培养物称为 混和培养物（ culture）。 混和培养物（Mixed culture）。 如果在一个菌落中所有细胞均来自 于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯 于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯 培养（ 培养（Pure culture）。 culture）。 在进行菌种鉴定时，所用的微生物 一般均要求为纯的培养物。得到纯培养 的过程称为分离纯化 的过程称为分离纯化。 分离纯化。
图4-2 平板划线分离法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
斜线(分区) 斜线(分区)划线分离法
1)用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次 1)用接种环先将培养物涂布于平板1 划线,再在2 3……区依次划线。 划线,再在2、3……区依次划线。 2)每划完一个区域，均将接种环灭菌一次，待冷 2)每划完一个区域，均将接种环灭菌一次，待冷 后再划下一区域。 3)每一区域的划线均接触上一区域的接种线1~2 3)每一区域的划线均接触上一区域的接种线1~2 次，使接种量逐渐减少，以获得单个菌落。 4)其他操作与上述曲线划线分离法相同。 4)其他操作与上述曲线划线分离法相同。
穿刺接种法
多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等 多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等 也可以用于观察细菌的某些生化反应。 1.如斜面接种法持好菌种管及培养基管。 1.如斜面接种法持好菌种管及培养基管。 2.以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培养基 2.以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培养基 的中心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底 的中心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底 部（但不能完全刺到管底），接种针应沿原路 部（但不能完全刺到管底），接种针应沿原路 退出。 3.经培养后半固体培养基可观察到：沿穿刺线生 3.经培养后半固体培养基可观察到：沿穿刺线生 长，线外的培养基清亮表示细菌无动力；穿刺 长，线外的培养基清亮表示细菌无动力；穿刺 线模糊不清，或沿穿刺线向外扩散生长，或整 个培养基混浊表示细菌有动力。
二、接种、分离培养 接种、
接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工 培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
接种工具
图4-1 接种和分离工具
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀
无菌操作
培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的 工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下 接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等） 于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。 于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。 在实验室检验中的各种接种必须是无 在实验室检验中的各种接种必须是无 菌操作。 菌操作。
图4-3 细菌的培养特征 1.点状 2.圆形 3.丝状 4.不规则形 5.假根状 6.纺锤 1.点状 2.圆形 3.丝状 4.不规则形 5.假根状 6.纺锤 状 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.垫状 11.脐状 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.垫状 11.脐状 12.边缘整齐 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 12.边缘整齐 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状 17.卷发状 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状 21.疏展状 22.树根 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状 21.疏展状 22.树根 状 23.假根状 23.假根状 24.丝状 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根 24.丝状 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根 状 29.量杯状 30.萝卜状 31.漏斗状 32.囊状 33.层状 29.量杯状 30.萝卜状 31.漏斗状 32.囊状 33.层状 34.絮状 35.环状 36.蹼状 37.膜状 34.絮状 35.环状 36.蹼状 37.膜状
平板划线分离培养法
平板划线分离培养法，用无菌的接种环取培养 物少许在平板上进行划线，使培养物中混在的多种 细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，根据 菌落的形态及特征，挑选单个菌落，经过移种而获 得纯种细菌（纯培养）。 纯种细菌（纯培养）。 分离细菌的方法很多，最常用的是平板划线分 离法。根据划线的方式不同有斜线法、曲线法、 离法。根据划线的方式不同有斜线法、曲线法、方 格法、放射法、四格法等。（图4 格法、放射法、四格法等。（图4-2）
微生物检验的基本操作技术
生 化 血 清
增菌 分 离
基本技术
培 养
染色观察
2011-9-26 裴晓方 xxpei@sina.com 2
一Байду номын сангаас增菌
选用合适的的增菌培养基对样品进行选 择性增菌，可以提高分离率。 大多为液体培养基，能够给微生物的繁殖提供 较适当的生长环境，包括： A.选择性增菌培养基：能够保证特定的 A.选择性增菌培养基：能够保证特定的 微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他 菌体生长的培养基（如SC、LB、EC等）； 菌体生长的培养基（如SC、LB、EC等）； B.非选择性增菌培养基：能够保证大多 B.非选择性增菌培养基：能够保证大多 数微生物生长的培养基（如M 数微生物生长的培养基（如M肉汤、营养肉 汤）。
斜线接种示意图
细菌在固体培养基表面只能在固定 的地方生长繁殖，经过一定的培养时间后， 可形成肉眼可见的菌落。菌落中只含有一 种细菌，而每种细菌的菌落各有其特征。 菌落形态往往有助于初步识别细菌；还可 菌落形态往往有助于初步识别细菌；还可 以由此获得细菌而进行一系列的鉴定。 识别菌落的能力是从事微生物检验 识别菌落的能力是从事微生物检验 人员的极为重要的基本功。
5)构造:均匀、露滴状、颗粒状、发状、皱招状等。 5)构造 构造: 6)颜色：无色、白色、灰色、灰白色或乳白色、荧 6)颜色 颜色： 光绿、金黄色、柠檬色、红色等、 7)透明度：透明、半透明、不透明、微透明等。 7)透明度 透明度： 8)硬度：硬、软、干燥、湿润，是否附着于培养基 8)硬度 硬度： 上或嵌入培养基内不易刮取。 9)质地：脂状、粘液状、膜状等。 9)质地 质地： 10)乳化性： 10)乳化性：在盐水中研磨是否形成均匀乳剂或颗 乳化性 粒状。 溶血性： 11)溶血性 11)溶血性：在血平板上，菌落周围有无溶血环。
几种食源性致病菌在不同分离平 板上的生长状况
大肠杆菌 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌
大肠杆菌
普通琼脂：形成圆形、光滑、湿润、半透明、灰白色菌落， 普通琼脂：形成圆形、光滑、湿润、半透明、灰白色菌落， 直径约2~3mm； 直径约2~3mm； 麦康凯：琼脂上形成红色菌落较大的菌落。 麦康凯：琼脂上形成红色菌落较大的菌落。 红色菌落较大的菌落