纤维素酶活力的测定

β-糖苷酶活力的测定(CＭC)

一目的:

掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。

原理:

纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠(CMＣ-Nａ)中分解出还原糖,还原糖又同3,５－而硝基水杨酸发生反应,产生一种黄橙混合色,用分光光度计可测定其色度,计算酶活力。

二试剂:

1.3,5-而硝基水杨酸显色剂(又称DNS试剂): 称取10g3,5-而硝基水杨酸,溶于蒸馏水中,加入20g分析纯NaOH,２00g酒石酸钾钠,加税5０0mｌ,升温溶解后,加入重蒸酚2ｇ,无水亚硫酸钠0、5g,加热搅拌,待全部溶解后,定容至1000mｌ。贮存于棕色瓶中,室温保存,放置一周后使用。

２.０、1moｌ／ＬｐH4、5醋酸－醋酸钠缓冲液:称取结晶醋酸钠(CＨ3COOＮａ、3 Ｈ2Ｏ)13.６１g,醋酸(ＣH３COOH)6、０0g,用蒸馏水溶解,并定容至1００0 ml,配好后用pH计矫正。

3、1mg/ml葡萄糖标准溶液:准确称取10０mｇ分析纯葡萄糖(预先在70℃、60０nm汞柱下干燥5h至恒重),用少量蒸馏水溶解并定容至100ｍl,冰箱中保存备用。

４.代测酶液:称取酶粉1、0ｇ(或吸取酶液1、０0ml),先用少量的０、05ｍoｌ／L pＨ４、5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中,沉渣部分再加上述缓冲液溶解,如此反复捣研３－4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度,４0℃水浴锅中浸提1h,用四层纱布或脱

脂棉过滤,滤液供测定用。

5、底物:０.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液,配制方法为城区0、5000g 羧甲基纤维素钠(Ｓigmａ公司生产),准确至０、0０1g,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存,有效期3d。

三仪器:

分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。

四方法步骤:

1．标准曲线的绘制

分别吸取0.２, 0.４, 0、6, ０、8, 1.0, 1.2, １.4ｍl的1ｍg／ml葡萄糖液于７支20ｍl的比色管中,分别用蒸馏水补充体积至2、ｏml,各加３,５-而硝基水杨酸1、5ml,在沸水浴中煮沸5ｍiｎ,冷却后分别用蒸馏水定容至２0ｍl,摇匀。以2ml蒸馏水加DNS溶液１、5mｌ,按上述同样操作为空白调零,在５40ｎm处比色。标准曲线绘制个试管所含物质的体积见下表。以吸光度A值为纵坐标,葡萄糖毫克数Ｗ(mg)为横坐标绘制出标准曲线(理论上此线应过原点)。

标准曲线绘制各试管所含物质的体积

2．酶样测定

取20mｌ比色管１支,加入0、５ｍol/L pＨ４、5醋酸-醋酸钠缓冲液1、5ｍl与６小片1cｍ×1cm滤纸后,再加适当稀释的酶液0、5ml,于40℃下保温1h后,再加适当稀释的酶液0、5ml,于40℃下保温1h后,加DNS液１.5ml,在沸水煮沸5ｍin显色,流水冷却,用蒸馏水定容至２0ml,摇匀;另取一支试管,加缓冲液与滤纸后,先加DNS液,再加缓冲液0、５ml,同样显色、冷却、定容作为空白,在波长540nm比色,测定Ａ值,查标准曲线得出相应的葡萄糖含量W。

五计算

酶的比活力定义:在４0℃,pH4、5条件下,每小时催化滤纸产生相当于1ｕg 分子葡萄糖的还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位,以U／g表示。

W×1０00×n

Ｘ= －-－-－---－-－

０、5×１８０×30

式中,X-－--样品酶的活力,U/g(ug／ml);

W--－-查标准曲线得出相应的葡萄糖含量,ｍg;

1０００--－-mg换算成ｕg的换算系数;

０、5-－－-吸取酶液的量,mｌ;

180－---葡萄糖分子量;

ｎ-－-－稀释倍数;

３０----反应时间,ｍin。