食品毒理学_04食品毒理学实训资料

7.组织匀浆的制备
(1) 动物处死 应根据试验要求选择合适的方法，如制 备肺组织匀浆时不能用断头法处死，因易引起肺淤血 (2) 脏器制备 动物处死后快速取出所需完整脏器，迅速 置冰浴中，用冷生理盐水洗去血污，必要时用冷生理盐 水灌流以除去血液。剥去脏器外膜，用滤纸吸干脏器表 面水分，称重、定位留取所需组织备用或置冰箱(或液氮 )中冻结保存。 (3) 匀浆制备 定量称取脏器、剪碎，置匀浆机中，按设 计要求加入一定量比例的溶液(生理盐水、缓冲液、有机 溶剂等)，在一定转速下研磨一定时间，有时需在冰浴中 研磨，如制备肝匀浆S9上清液或分离细胞组分，全部操 作均应在低温(0～10℃)下进行
最小致死采 血量/mL
10.0 40.0
2．血清与血细胞分离 (1) 血清的制备 将全血置37℃温箱保温lh，4℃冰箱中保存 3～4h，以3000～4000r／min离心15min，取上清液低温保 存备用。血清呈淡黄色，如呈淡红色或红色，表明有溶血， 可能影响许多指标的测定，一般应废弃。
(2) 血细胞分离 将血液采集在经抗凝剂处理的容器中，混 匀，2000r／min离心20min，小心吸出血浆。血浆与红细胞 之间有一薄层白细胞，需要时小心吸出置另一离心管中， 不需要时可弃去。离心管中的沉淀为红细胞，加入等体积 生理盐水，轻轻混匀，使红细胞悬浮，再次离心，弃上清 液。如此重复3次，直至上清液无色透明为止，即获得红细 胞。白细胞可依同法洗涤处理。
图4-3 小鼠抓取法
图4-4 大鼠抓取法
2．大鼠 基本同小鼠，但大鼠牙齿很尖利，不要突 然袭击式去抓。捉拿时右手慢慢伸向抓鼠尾，尽 可能向尾根部靠近，将大鼠放在粗糙面上；左手 戴防护手套，抓起其颈背部尽可能多的皮肤并固 定其头部以防咬伤(如图4-4)。也可将大鼠固定在 固定器。注意捉拿时勿用剧烈动作激怒之。 3．豚鼠 以拇指和中指从豚鼠背部绕到腹下，另一 只平托其臀部(如图4-5)。体重小时可用一只手捉 拿，体重大时宜用双手。
图4-5 小鼠灌胃法
图4-6小鼠腹腔注射法
图4-7小鼠皮下注射法
4.小鼠尾静脉注射法：一人抓住小鼠，或将小白鼠置于固定 器内，使鼠尾外露，用酒精棉球涂擦，或将鼠尾浸人50℃ 热水中0. 5min，使血管扩张。用左手拉住尾尖，选择一条 扩张最明显、距尾尖1/4处的尾静脉，右手持带有4号针头 的注射器刺人血管注射。如注射有阻力，且局部变白，应 拔出针后，在第一次刺点的上方重新进行(如图4-8)。 5.小鼠脑室注射法：由两人合作，一人固定好小鼠，另一人 用眼科镊提起两耳连线中间处的皮肤，用手术剪快速剪去 距镊尖0.3cm处的皮肤，暴露出颅骨。在距冠状缝和矢状缝 各砰1.5mm左右处，先用小号钟表改刀(固定刀头深为 2.0mm)在颅骨上穿一小孔，然后将4号或5号针头垂直插入 2-2.5mm，进行脑室注射(如图4-9)。
随机分组表
动物号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
随机数目 97 74 24 67 62 42 81 14 57 20 42 53 32 37 32 1 2 0 1 2 0 3 2 3 2 0 5 2 1 2 除6余数 A B F A B F C B C B F E B A B 归 组 动物号 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
图4-1大鼠和小鼠染色标号法
（2）耳缘孔口法。大、小鼠常用此法。在耳缘不 同部位（图4-2)用针穿孔和剪刀剪口，穿孔和剪 口后，用墨黑酒精液涂抹，使其着色，不易脱失。 常以右耳代表个位，左耳代表十位。孔表示1号、 2号、3号和10号、20号、30号，一道口为4号、5 号、6号和40号、50号、60号，二道口为7号、8号、 9号和70号、80号、90号。穿孔和剪口配合，也可 编1-99号，不穿不剪为100号。
(一)健康动物的选择和性别鉴定 1.健康动物选择： 2.性别鉴定： ①大、小鼠；②豚鼠；③家兔。
（二)称重、分组与标记
1．称重：根据不同试验要求，选择不同体 重的动物。在同一组内，同性别动物体重差 异应小于平均体重的10％，组间同性别动物 体重均值应小于5％。称量大、小鼠体重时天 平的感量要求在0.1 g以下。
2.对动物进行观察检查后，认真填写以下记 录表，作出相应评价。
健康观察记录表
动物品系： 内容评价 情况记录
行为习惯 体态营养 神态反应 被毛皮肤 采食饮水 粪尿 呼吸、心搏、体温 妊娠哺乳生长发育 其他
综合评价： 观察人： 日期：
实训二 实验动物的分组、 标记和染毒技术
一、实训目的
实验动物科学的分组、标记和合理的染毒是取
3．尿液收集
(1) 代谢笼法 适用于大、小鼠，尿液通过代谢笼 的大小便分离漏斗与粪便分开。因大、小鼠尿量 较少，操作中有损失和蒸发可造成较大的误差， 故一般要采集5h以上的尿液，取平均值。
(2) 反射排尿法 适用于小鼠，提起小鼠，可反射 性排尿。
4．实验动物的处死方法
(1) 颈椎脱臼法： 多用于小鼠。
图4-8 小鼠尾静脉注射法
图4-9 小鼠脑室注射法
实训三 实验动物解剖和生物样 本采集、制备技术
一、实训目的
实验动物解剖和生物样本采集、制备是毒理学研
究中极为重要的基本操作技术，通过本次实训了 解实验动物的内脏形态结构特征，掌握实验动物 的处死方法、解剖技术，能辨认内部器官、正确 分离组织器官；掌握血液采集方法、血清和血细 胞分离技术，大鼠尿液收集方法、组织匀浆制备 技术。
得良好试验结果和结论的前提，也是每一项毒 理学试验首先要做的工作。通过本次试验掌握 实验动物雌雄鉴别方法、科学分组、标记和常 用基本染毒技术。
二、仪器和材料
1．实验动物：成年健康小鼠、大鼠、豚鼠、 家兔若干只。 2．染料：结晶紫、苦味酸、品红。 3．毛笔或棉签。 4．动物称或天平 5．灌胃针
三、操作方法和步骤
6. 组织病理学检查
常用部位有心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、睾
丸、肠等。对指定的器官或组织用锋利的刀剪取 材，应统一取材部位。组织块一般在10倍体积的 10％福尔马林中固定，此后常规制片(组织石蜡包 埋、切片、HE染色)。应详细记录显微镜下观察到 的病变，并做出病理诊断。必要时，请其他的病 理学家对有疑问的或有争论的发现进行复查。利 用特殊染色、组织化学及电子显微镜技术研究毒 作用机制。
(1) 工作人员进入兔室前须着工作服，穿胶鞋， 戴口罩，戴手套、帽子。 (2) 进入兔室后先观察兔只健康状况，记录异 常兔只并交由兽医师处置。
(3) 饮水
(4) 饲料
(5) 卫生消毒
(6)记录
3.实验动物健康的观察和评价
（1）动物的外表与行为观察
（2）个体检查
（3）采食和饮水观察
四、实训结果
1.计算动物一昼夜之内的摄食量和饮水量。
2.小鼠腹腔注射法：左手紧握动物，右手将注射针 头从左或右下腹部朝头部方向插入，针头与腹壁 角度不宜太小，否则易人皮下。针头插人不宜太 深或太近上腹部，以免刺伤内脏。(如图4-6)
3.小鼠皮下注射法：可由两人合作，一人抓住小白 鼠，另一人左手捏起背部皮肤，右手持注射器将 针头刺人背部皮下。若熟练，也可一人操作(如图 4-7)。
1.采血
(1) 鼠尾采血 (3) 摘眼球采血
(4) 腹主动脉或股动(静)脉采血
(5) 断头采血
(2) 眼眶静脉丛采血
(6) 心脏采血
实验动物安全采血量
动物 最大安全采 血量/mL
小鼠 大鼠 0.1 1.0
最小致死采 血量/mL
0.3 2.0
动物 最大安全采 血量/mL
豚鼠 家兔 5.0 10.0
4．家兔 用右手大把抓住颈背部皮肤，轻轻提起， 左手立即托住家兔的臀部或腹部，使其重量移向 左手(图4-6)，这样既不伤害家兔，也避免兔抓伤 人。捉家兔切忌只抓两耳。
图4-5 豚鼠抓取法
图4-6 家兔抓取法
（四)染毒方法
1．大、小鼠灌胃法： 使用lmL注射器和灌胃针，用左 手拇指和食指捏住大、小鼠两耳及头后皮肤，其余手指 将大鼠或小鼠的背部皮肤和尾巴压在手掌间，使其躯干 垂直，腹部朝内，头部向上，略有一个倾斜度，固定好 后，右手持注射器，将针头由动物口角插入口腔，避开 牙齿，再从舌面沿咽后壁顺着吞咽动作徐徐滑入食道下 端，遇有阻力时，可轻轻上下左右滑动，一旦感觉阻力 消失，即可滑入胃内(如图4-5)。灌胃针插入深度，一般 小鼠3～4cm，大鼠、豚鼠4～6cm。
二、仪器和材料
小鼠、大鼠、兔、饲养盒、垫料、水瓶
及辅助器材、开口器、体温表等
三、操作方法 1.大、小鼠的日常饲养管理
(1) 进入屏障动物房的准备
(2) 进入动物房后的观察
(3) 大、小鼠的喂料
(4) 大、小鼠的喂水 (5) 大、小鼠换饲养盒 (6) 清洁卫生和消毒 (7) 记录
2.兔的日常饲养管理
二、仪器和材料 (1)实验动物 成年健康小鼠、大鼠、家兔。 (2)器材 鼠笼，大鼠代谢笼，大、小鼠固定板。手术 剪，镊子，儿科小骨钳，塑料离心管(2～10 mL)，玻 璃毛细管(内径l～1.5mm)，注射器(1mL、2mL和 5mL)，吸管，滴管，匀浆器。离心机，电子天平。 (3)试剂 抗凝剂(0.5％肝素生理盐水溶液)；溶液(生理 盐水或某种缓冲液)。 (4)其他 碘酒，酒精棉球，干棉球，滤纸。
第四章 食品毒理学实训
实训一 实训二 实验动物的饲养管理 实验动物分组、标记和染毒技术
实训三
实训四 实训五 实训六
实验动物解剖和生物样本采集、制
备技术 小鼠急性毒性试验 小鼠骨髓细胞微核试验 小鼠精子畸变试验
实训一 实验动物的饲养管理
一、实训目的
实验动物的饲养管理是保障食品毒理学动物
实验的基础技术，通过本次实训了解实验动 物房的环境要求及管理要点，掌握实验动物 饲养管理的操作方法和程序，掌握实验动物 健康的观察和评价方法。
（三)抓取和固定方法
1.小鼠 捉拿方法有二种：一种办法是用右手提 起尾部，放在鼠笼盖或其它粗糙面上，向后上 方轻拉，此时小鼠前肢紧紧抓着粗糙表面，轻 轻抚摸，使安静，然后迅速用左手拇指和食指 捏住小鼠双耳和颈背部皮肤，并以小指和手掌 尺侧夹持其尾部固定于手中(如图4-3)；另一种 抓法只用左手，先用食指和拇指抓住尾都，再 用手掌尺侧及小指夹住尾根，然后用拇指及食 指捏住其颈部皮肤。后者适于快速捉拿给药。
图4-2 耳缘孔口标号法
来自百度文库
（3）烙印法。适用于兔以上的动物。耳部消毒后， 用刺数钳在动物耳上刺号，再以墨黑酒精液着 色。也可用铸铁号码烧红后烙在动物体表部位， 留下标记。这种方法可较长时间保留记号，适 用于大动物标记。 （4）号牌法。适用于大动物。将金属或塑料牌号 固定在该动物的耳上或颈下，也可挂在饲养动 物的笼上。
(2) 空气栓塞法：多用于兔、犬、猴等大动物。 (3) 断头法：用于大、小鼠、琢鼠。 (4) 急性放血法：用于大鼠、小鼠。 (5) 击打法：适用于较小的动物。
(6) 化学药物致死法：适用于各种动物。
(8) 其他：电击法、枪击法、微波法等。
5.实验动物的大体解剖 在实验动物处死后应立即解剖，越早越好。小鼠仰放在解剖 盘上，用大头针固定住四肢，提起生殖器前方的皮肤，用剪子 剪一小口，沿腹中线剪到颌下，把皮肤向两边分离。再剪开下 腹部的肌肉，也沿中线剪开肌肉到胸骨下缘，向左侧剪断肋骨 下端后，向前上方剪，直到断开左边锁骨。剪时注意刀尖稍向 上挑以免伤及内脏。右侧也同样处理后就可以揭去胸部前壁， 这样就显示出其内部器官自然排列位置。将肝脏和胃向后推可 见横膈，隔开胸腔和腹腔，中央为结缔组织的中央腱，其他部 分为膈肌，为哺乳类所特有。观察心脏跳动情况以及肠蠕动的 情况；观察有关脏器的外形和表面情况、颜色、边界和大小、 质地、切面。 依次完整的取出①腹腔脏器；②胸腔脏器；③肾脏和肾 上腺；④泌尿器官和生殖器官；⑤颅腔脏器并对指定的脏器称 重，并计算脏器系数。
随机数目 27 07 36 07 51 24 51 79 89 73 16 76 62 27 66 3 1 0 1 3 0 3 1 5 1 4 4 2 3 0 除6余数 C A F A C F C A E A D D B C F 归 组
3.编号及标记
（1）染色法。染料有苦味酸酒精饱和液(黄色)、甲 基紫酒精饱和液(紫色)或美蓝溶液(蓝色)、0.5％中 性红或品红溶液(红色)等。具体方法：a.按右上肩、 右肋、右后肢、颈部、背中、尾根、左前肢、左 肋、左后肢顺序分别为1-9号，不染色为10号［图 4-1(a)］；b.以头部为1号，按顺时针方向依次在右 耳、右前肢、右后肢、颈部、背中、尾根、左耳、 左前肢、左后肢染色，分别为2-10号［图4-1(b)］ 。