第八章 荧光分光光度法与检测技术

第二节 荧光定量分析
当其他条件也一定时，荧光物质在稀溶液中的 荧光强度与浓度呈线性关系，这是荧光定量分析的 依据。
但只有当荧光物质的浓度很小时， 即ε·c·L ≤ 0.05，这种关系才成立。
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第二节 荧光定量分析
课堂互动 请您分析为什么荧光分光光度法的灵敏度 比紫外-可见分光光度法要高？
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第二节 荧光定量分析
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
（二）多项选择题
1. 下列关于分子荧光分析特点的叙述正确的是（
A、检测灵敏度高
B、用量大，分析时间长
C、用量少，操作简便 D、选择性强
E、应用广泛
2. 分子中有利于提高荧光效率的结构特征是（
A、双键数目较多 B、共轭双键数目较多
C、含重金属原子 D、分子为平面刚性
、
、
、
部件组成。
等四大
3. 荧光分析法进行定量分析的依据是
。
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
四、实例分析题 1．用荧光法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量时，取供试品20片（每
片含炔雌醇应为31.5~38.5g），研细溶于无水乙醇中，稀释至250ml ， 滤 过 ， 取 滤 液 5ml ， 稀 释 至 10ml ， 在 激 发 波 长 285nm 和 发 射 波 长 307nm处测定荧光强度。如炔雌醇对照品的乙醇溶液（1.4g/ml）在 同样测定条件下荧光强度为65，则合格片的荧光读数应在什么范围 内？
F = K′（I0 – I）
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第二节 荧光定量分析
K′为常数，称荧光比率，其大小取决于一定条 件下的荧光效率，结合比尔定律可得到下式：
F = 2.303·φF·I0·ε·c·L
入射光强度I0在波长一定，光源稳定时为固定 值，因此可以将2.303·φF·I0·ε·L视为常数K，故：
F = Kc
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
3. 荧光量子效率是指（ ）。 A、荧光强度与吸收光强度之比 B、发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比 C、发射荧光的分子数与物质的总分子数之比 D、激发态的分子数与基态的分子数之比 4. 一种物质能否发出荧光主要取决于（ ）。 A、分子结构 B、激发光的波长 C、温度 D、溶剂的极性
（四）荧光分光光度计
荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出 的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发 射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏 振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和 结构情况。
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第一节 基本原理
（一）仪器类型
➢ 滤光片荧光计 ➢ 滤光片-单色器荧光计 ➢ 荧光分光光度计
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
5. 下列叙述中，错误的是（ ）。 A、荧光分析的待测物应含有大π键 B、紫外分光光度法待测物应含有π键 C、质谱法待测物应含离子 D、气象色谱分析物的沸点应较低 6. 下列因素会导致荧光效率下降的有（ ）。 A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小 C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子
E、苯环上有给电子基团
）。 ）。
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
3.下列跃迁方式属于无辐射跃迁的有（ ）。
A、振动弛豫
B、内转换
C、体系间跨越 D、荧光发射
E、磷光发射
4. 分子荧光法与紫外-可见分光光法的主要区别为（
A、分析方法不同 B、仪器结构不同
C、灵敏度不同 D、光谱带个数不同
E、光源不同
二、定量分析方法 标准曲线法
配制一系列浓度为c1、c2、c3……对照品溶液， 分别测其F1、F2、F3……值，用F~c作图绘制标准曲
线。 然后在同样条件下测定试样溶液的Fx，在标准
曲线上查找对应的浓度cx。
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第二节 荧光定量分析
比例法 若荧光分析标准曲线过原点，则可选择其线性范围
用比例法测定。即配制一对照品溶液（cs）测其荧光强 度（Fs），再测定试样溶液（cx）的荧光强度（Fx）， 然后进行比较。测定时同样要以空白（F0）校正：
一、荧光的产生过程 （一）单重态与三重态 A 单重基态 B 激发单重态 C 激发三重态
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第一节 基本原理
（二）荧光的产生 电子由激发单重态 →基态单重态的跃 迁
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第一节 基本原理
（二）磷光的产生 电子由激发三重态→基态单重态的跃迁
课堂互动 您能比较荧光和磷光的主要区别吗？
4
第一节 基本原理
二、激发光谱和荧光光谱（发射光谱）
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第一节 基本原理
任何荧光物质都具有两个特征光谱：
激发光谱和荧光光谱（发射光谱）
激发光谱是当荧光波长一定时，荧光强度随激发光 波长而变化的关系曲线（以激发光波长λex为横坐标 ，荧光的发光强度F为纵坐标的光谱）。
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第一节 基本原理
荧光光谱是当使激发光波长和强度不变，而让物质
所产生的荧光通过发射分光系统 ( II )分光，测定每 一发射波长荧光强度F，以发射光波长λem为横坐标 ，荧光的发光强度F为纵坐标作图所得的关系曲线。
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第二节 荧光定量分析
点滴积累
➢ 当其他条件（即φF、I0、ε、L）一定时，荧光物质在 稀溶液中的荧光强度F与浓度c成正比。
➢ 荧光分析的定量方法与紫外-可见分光光度法基本相同。
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第三节 应用与发展
第三节 应用与发展
一、荧光分析的应用 （一）有机化合物的荧光分析 芳香族及具有芳香结构的化合物，因存在共轭体系在 紫外光照射下很多能发射荧光。为提高测定灵敏度和 选择性，可使弱荧光物质与某些荧光试剂作用，以得 到强荧光性产物。因此，荧光分析法在有机物测定方 面的应用很广。
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第一节 基本原理
（三）仪器校准 ➢ 灵敏度校准 ➢ 波长校准 ➢ 激发光谱和发射光谱校准
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第一节 基本原理
课堂互动 请您比较荧光分光光度计与紫外-可见分光 光度计的主要区别
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第一节 基本原理
点滴积累
➢荧光和磷光在实验现象上的区别：激发光停止照射 时，荧光随之消失而磷光则将延续一段时间。
能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验证明，
在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这 是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。
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第二节 荧光定ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分析
一、荧光强度与物质浓度的关系
当溶液中荧光物质的浓度为c，液层厚度为（吸收 池内径）L时，由于荧光强度F正比于被荧光物质吸
收光的强度：F∝（I0 – I），用线性方程表示为：
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第三节 应用与发展
（二）无机化合物的荧光分析 直接荧光法 荧光猝灭法 催化荧光法
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第三节 应用与发展
二、荧光分析新技术 激光荧光分析 时间分辨荧光分析 同步荧光分析 胶束增敏荧光分析 三维荧光光谱分析
原油试样在环乙烷中的 等角三维投影光谱图
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
一、选择题
目标检测
➢ 最强荧光波长λem和最强激发波长λex是物质的定性 依据，也是定量测定时的最适宜波长。
➢强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构， 如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。
➢ 影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。
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第二节 荧光定量分析
第二节 荧光定量分析
由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同， 发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法对
第一节 荧光分光光度法的基本原理
某些物质吸收紫外-可见光后，可以发射其波长比 吸收光更长的光，并且随照射光的消失而消失，这 种发射光称为荧光（fluorescence）。
荧光分析法（fluorometry）是利用某些物质发射荧 光的特性进行定性、定量分析的光学分析方法，又 称荧光光谱法
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第一节 基本原理
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第一节 基本原理
（二）荧光分光光度计的基本结构
1.光源 2. 4. 7. 9. 狭缝 3. 激发单色器 5. 样品池 6. 表面吸光物质 8. 发射单色器 10. 检测器 11. 放大器 12. 指示器 13. 记录器
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第一节 基本原理
➢ 光源 目前最常用的是氙灯 ➢ 单色器（分光系统） 激发单色器 发射单色器 ➢ 样品池 测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英 ➢ 检测器 光电倍增管
）。
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
二、填空题
1. 激发光波长和强度固定后，荧光强度与荧光波长的关系曲线称为
后，荧光强度与激发光波长的关系曲线称为
。
；荧光波长固定
2. 荧光分光光度计的主要部件有
、
、、
四大部件组成。
3. 荧光分析法进行定量分析的依据是
。
三、简答题
1．何谓荧光效率？具有哪些分子结构的物质有较高的荧光效率？
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本章结束！ 谢谢！
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
2. 用荧光分析法测定食品中维生素B2的含量：称取2.00g食品，用 10.0ml氯仿萃取（萃取率100%），取上清液2.00ml，再用氯仿稀释 为10.0ml。维生素B2氯仿标准溶液浓度为0.100µg/ml。测得空白溶液、 标准溶液和样品溶液的荧光强度分别为：F0=1.5，Fs=69.5，Fx=61.5， 求该食品中维生素B2的含量（μg/g）。
Fs F0 cs Fx F0 cx

cx

Fx Fs
F0 F0
cs
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第二节 荧光定量分析
多组分混合物测定 与吸光度一样，荧光强度也有加和性，因此混合物不需
经过分离，可用解联立方程的方法测定。可选择两物 质不同的激发波长处的荧光强度测定，也可选择不同 荧光波长处的荧光强度测定，这样选择范围比紫外可见分光光度法广泛。
萘
286
321
0.29
蒽
365
400
0.46
四苯
390
480
0.60
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第一节 基本原理
➢ 分子的刚性和共平面性
联苯φF =0.18
➢ 取代基的影响
芴F=1.0
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第一节 基本原理
（三）影响荧光强度的外界因素
➢ 温度 ➢ 溶剂 ➢ 溶液酸碱性 ➢ 荧光熄灭剂 ➢ 散射光 ➢ 激发光源
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第一节 基本原理
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
7. 荧光波长与相应激发光波长相比（ ）。 A、前者较长 B、后者较长 C、两者相等 D、关系不确定 8. 荧光光谱分析的主要优点是（ ）。 A、准确度高 B、操作简便 C、仪器简单 D、灵敏度高 9. 荧光分光光度计与分光光度计的主要区别在于（ ）。 A、光源 B、单色器 C、光路 D、检测器
2．哪些因素会影响荧光波长和强度？
3．请设计两种方法测定溶液Al3+的含量。（一种化学分析方法，一种仪器分析方法）
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
二、填空题
1. 激发光波长和强度固定后，荧光强度与荧光波长的关系曲线称为 ；
荧光波长固定后，荧光强度与激发光波长的关系曲线称为
。
2. 荧光分光光度计的主要部件有
(一)单项选择题
1. 荧光光谱属于（ ）。
A、吸收光谱 B、发射光谱 C、红外光谱 D、质谱
2. 分子荧光分析比紫外-可见分光光度法选择性高的原因是（ ）。
A、能发射荧光的物质比较少
B、分子荧光光谱为线状光谱，而分子吸收光谱为带状光谱
C、荧光波长比相应的吸收波长稍长
D、荧光光度计有两个单色器，可以更好地消除组分间的相互干扰
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第一节 基本原理
三、荧光与分子结构
（一）荧光物质的特征 ➢ 具有强的可见-紫外吸收，即具有K带强吸收 ➢ 具有高的荧光效率
发射荧光的量子数
荧光效率 F 吸收激发光的量子数
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第一节 基本原理
（二）分子结构与荧光的关系
➢ 大的共轭π键结构
λex（激发） λem（激发）
φF
苯
205
278
0.11