免疫组化步骤
免疫组化步骤
免疫组化步骤1、烤片：放于60℃烘箱内，20-25min；2、脱蜡：二甲苯i、ii、iii，3次，5min/次；注意：从烤箱中取出，迅速放入二甲苯中，防止蜡凝结；3、复水：100%酒精---100%酒精---95%酒精---90%酒精---80%酒精---70%酒精——50%酒精，5分钟/次；4.用DDH 2O清洗两次，5min/次；5、抗原修复：柠檬酸盐抗原修复液1x（迈新mvs-0100），125℃，5分钟注：1x修复液：198mlddh2o+2ml抗原修复液100x,混匀；抗原修复压力锅的使用：确认垫片和传热片的放置，加入700mLDH2O，放入铁架固定片盒，小心不要按压传热片，盖上锅盖，检查排气喷嘴是否能自由旋转，将锅盖上的“关闭”对准白点，并且在“开放”和边缘之间没有间隙，设置程序并启动；之后，等待排气口的红色指示消失，然后打开锅盖；6、修复结束后冷却至室温（30min），1xpbs洗2次，5min/次；7、去除h202酶：3%h202，15min；注意遮光；注：用1xpbs将30%H202稀释至3%H20（例如5ml 30%H202+45ml 2PBS00ml 3%H202）8、pbs2次，pbst1次，5min/次；9.堵塞：先将薄膜擦干，注意保持组织湿润，再用专用记号笔沿距离组织3mm处画圈，然后加入封闭液，室加热1小时，湿盒；不要使用过多的密封液，以免溢出；注：封闭液：1xpbs，0.3%tritonx-100，10%goatserum（如：870ulpbs+30ul10%tritonx-100+100ul10%goatserum1ml封闭液）；10.一抗孵育：用封闭液稀释一抗。
不同抗体的稀释倍数不同，4℃，过夜（有的抗体是室温1h），湿盒。
对照组加不含抗体的封闭液；注：拿到4℃冰箱时动作延缓慢，小心不要使一抗跑出圈外；加一抗前可以重新画圈，以免一抗外流；常用抗体的稀释比例：gfap--1:200，ki67--1:200，CD31-1:20~1:40，flag-1:200，nestin-1:200，III微管蛋白-1:100011，室温，30min；（从冰箱中取出时要慢慢移动）12。
免疫组化相关步骤
免疫组化相关步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测、定位和定量特定蛋白质在组织或细胞中的表达。
以下是免疫组化的一般步骤：1.取材和预处理：首先，选择需要研究的物种的组织样本，可以是固定和包埋的组织切片，也可以是细胞培养物。
对于固定组织，常用的固定剂包括福尔马林、乙醛等。
然后进行脱水、透明化、包埋等预处理步骤。
2.标本切片：将处理好的组织或细胞样本切成较薄的切片，常见的切片厚度为4-6微米。
切片后，可以将其固定在载玻片上。
3.抗原恢复：对于一些已经固定的样本，抗体可能无法充分与蛋白质结合。
因此，进行抗原恢复是必要的。
常见的抗原恢复方法包括加热诱导抗原恢复（如高温加热或压力加热）和酶或蛋白酶诱导的抗原恢复。
这些方法有助于揭示抗原并提高抗体的结合。
4.阻断非特异性结合：在进行免疫组化反应之前，需要阻断非特异性结合位点，以减少假阳性结果。
常用的非特异性结合位点阻断方法包括使用血清蛋白、牛血清白蛋白、胶原蛋白等。
5.一抗反应：将特异性抗体（一抗）加入切片或细胞上，并进行孵育。
一抗可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
一般情况下，常用的抗体稀释倍数为1:100到1:1000。
此步骤的时间和温度也需要根据具体的抗体选择进行调整。
6.洗涤：完成一抗反应后，需要进行多次洗涤来去除未结合的抗体。
洗涤可以使用生理盐水、PBS等缓冲液，重复2-3次洗涤，每次洗涤时间持续5-10分钟。
7.二抗反应：8.洗涤：与一抗反应类似，完成二抗反应后需要进行多次洗涤来去除未结合的二抗。
洗涤可以使用生理盐水、PBS等缓冲液，重复2-3次洗涤，每次洗涤时间持续5-10分钟。
9.染色和显微镜观察：根据实验需要，可以选择合适的染色方法，如荧光染色或酶联染色。
染色后，可以使用荧光显微镜或光学显微镜进行观察和拍照记录。
10.分析和结果解读：根据染色的结果和显微镜观察，进行定性和定量分析。
可以使用图像处理软件来分析染色的强度和分布情况。
根据实验设计和相关的对照组，对实验结果进行解读。
免疫组化步骤
免疫组化步骤（改良的二步法）1.烤片：65℃2小时。
2.脱蜡：二甲苯I 15min，二甲苯II 15min。
3.水化：无水乙醇2min，95%乙醇2min，85%乙醇2min，75%乙醇2min。
4.DD水浸泡2min，PBS洗一下。
（DD水：双蒸水，一般指经过2次蒸馏而得的水）5.高压抗原修复：高压锅放枸橼酸钠没过玻片架1档至冒气，然后加加压阀，待喷气后改2档10min，后冷却。
6.PBS水洗3min X 3次，组化笔画圈，然后加内源性过氧化物酶阻断剂孵育10min。
（双氧水10分钟才是针对过氧化物酶的，可以先抑制，或者是抗原修复后再滴双氧水，我是先抗原修复再去除内源性过氧化物酶）。
7.PBS水洗3min X 3次，孵育1抗（4度才是过夜，常温你要孵育10多个小时肯定是过了，常温孵育2小时左右，但是效果没有过夜的好，冰箱孵育过夜要注意不能干片）4℃冰箱过夜（16-18小时）8.PBS水洗，第一次8min，后2次5min （第一次洗的时间最好适当延长，可以8-10min），Polymer helper （试剂I）20分钟PBS水洗5min X 3次，II抗+辣根酶（试剂2）（2抗之前是先用黄色的试剂1室温孵育20min，可能起的是一个通透剂作用，2抗室温孵育1h，根据温度而定，如果室温有30度以上，要适当缩短孵育时间，可考虑40-50min，你的2抗孵育顺序错了），PBS水洗5min X 3次。
9.DAB染色：DAB试剂现配染色（稀释比例为50ul的DAB浓缩液用1ml的稀释液稀释，），根据染色深浅（最好是镜下观察显色）用自来水终止。
辣根过氧化物酶反应10.自来水洗2-3遍，方法就是更换2-3次组化盒里的自来水，玻片架放进去洗涮，洗干净残存的DAB显色剂之后。
11.苏木素染色，具体时间根据苏木素效果而定，5-10min，自来水冲洗干净，用百分之一盐酸酒精分化，快速刷3下（酒精用完回收循环使用），然后在流动的自来水下返蓝10min。
免疫组化的基本步骤
免疫组化的基本步骤免疫组化（immunohistochemistry, IHC）是一种常用的实验技术，用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原。
它是一种特异且可靠的方法，通过结合抗体与抗原的特异性相互作用，利用显色或荧光信号来检测特定抗原的存在和定位。
以下是免疫组化的基本步骤。
1.组织样本处理:首先，需要准备适当的组织样本。
组织可以是固定的、冰冻的或者石蜡包埋的。
固定的样本通常使用福尔马林进行固定，并应在切片前进行脱水、透明和石蜡浸渍等处理。
2.抗原恢复：组织样本中的一些抗原可能因为固定和处理过程而被破坏或掩埋。
为了恢复抗原的免疫原性，需要进行抗原恢复步骤。
这一步骤的目的是去除或解开横断的蛋白质交联，以使抗体能够更容易进入细胞或组织内部。
抗原恢复可以使用高温、酶解或化学溶解等方法进行。
3.抗体处理：接下来，需要选择适当的一抗（primary antibody）对特定的抗原进行标记。
一抗通常是由动物免疫系统产生的，可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
抗体的选择是非常重要的，需要确定其与特定抗原的特异性和亲和性。
一次性需要把一抗稀释到合适的浓度，并与特定的缓冲液混合。
4.反应：抗体与抗原的结合需要一定的时间来达到最佳的结果。
实验者需要将一抗混合物加到组织样本上，并进行足够的反应时间。
反应时间可以根据实验条件或需求进行调整，通常为30分钟至几小时。
5.洗涤：反应完毕后，需要对样本进行洗涤以去除未结合的一抗、杂质和非特异性结合物。
洗涤步骤通常使用缓冲液，可重复进行多次，以确保清除掉所有不必要的物质。
6.二抗处理：一抗与目标抗原结合后，需要加入相应的二抗（secondary antibody）对一抗进行检测。
二抗可以与一抗特异性结合，并携带染色剂或荧光标记。
常见的二抗有抗小鼠IgG的免疫球蛋白和抗兔IgG的免疫球蛋白。
二抗也需要适当的稀释并与缓冲液混合。
7.反应：类似于一抗反应，二抗也需要一定时间来与一抗结合和形成复合物。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的存在和定位。
其步骤包括样本制备、抗原去原、阻断试验、一次抗体处理、二次抗体处理、显色和镜检。
下面将详细介绍每个步骤：1.样本制备：收集需要检测的样本，可以是细胞、组织或体液。
样本收集后，需要进行固定和切片处理，以保持细胞和组织结构的完整性。
2.抗原去原：蛋白质在组织中可能会被结构和其他因素影响，使其在免疫组化实验中难以被检测到。
因此，需要进行抗原去原处理。
常用的方法有热处理、酸碱处理、酶解处理等。
3.阻断试验：细胞和组织常常会存在非特异性结合位点，会使得后续的免疫反应变得模糊不清。
为了减少这种非特异性结合，需要进行阻断试验。
常用的阻断试验方法有牛血清白蛋白（BSA）、动物血清等。
4.一次抗体处理：在一次抗体处理步骤中，需要准备与目标蛋白质特异性结合的一次抗体。
将制备好的一次抗体加入样本中，使其与目标蛋白质发生反应，并形成抗原抗体复合物。
5.二次抗体处理：一次抗体只能与抗原结合，无法提供光学信号。
因此需要加入与一次抗体结合的二次抗体，该二次抗体与荧光物质或酶偶联，可以提供可视化信号。
常见的二次抗体有HRP（辣根过氧化物酶）、荧光染料等。
6.显色：通过加入合适的显色底物，可以使得与二次抗体结合的酶产生可见的颜色反应。
常用的显色底物有DAB（3,3'-二氨基联苯），其在酶的作用下会产生棕色的显色产物。
7.镜检：最后一步是使用光学显微镜对样本进行观察和分析。
通过镜检可以确定抗原存在的位置和分布情况，并对结果进行定量分析。
总结：免疫组化是一种确定蛋白质存在和分布的重要实验技术。
通过以上步骤的顺序操作，可以获得可靠的结果。
实验人员需要熟悉每个步骤的操作方法，并根据实验样本的要求进行调整和优化，以获得准确和可重复的结果。
免疫组化原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，用于检测组织切片中特定抗原的分布和表达水平。
它结合了免疫学和组织学的原理，能够在组织切片上定位和检测抗原，并通过染色方法将抗原可视化，从而实现对抗原的定性和定量分析。
免疫组化实验的步骤通常包括固定、脱脂、抗原修复、抗体和检测步骤。
下面将详细介绍每个步骤的操作和常用试剂。
1.组织固定：组织固定的目的是保持组织结构完整并固定细胞的抗原。
常用的固定试剂包括10%中性缓冲福尔马林（10% neutral buffered formalin，NBF）和乙醇等。
2.脱脂：脱脂是将组织切片中的脂质去除，以提高抗体对抗原的结合效率。
常用的脱脂试剂包括二甲苯、甲醛和乙醚等。
3.抗原修复：抗原修复是为了使被固定的组织恢复原样，增强抗原的可检测性。
抗原修复的方法包括热处理、酶解法和pH调整等。
常用的抗原修复试剂包括热解剂例如EDTA缓冲液、Tris-EDTA缓冲液，酶解剂例如胰蛋白酶和蛋白酶K，以及甲酸、盐酸等酸性溶液。
4.抗体：5.检测：检测步骤用于将抗原-抗体复合物可视化。
这通常通过染色方法完成。
常用的染色方法包括免疫酶标记、免疫荧光和免疫金标记等。
免疫组化实验所需的试剂种类繁多，下面列举一些常用的试剂：1. NBF（10% neutral buffered formalin）：用于组织固定，保持组织形态完整。
2.二甲苯：用于脱脂步骤，去除组织中的脂质。
3.甲醛：用于脱脂步骤。
4.乙醚：用于脱脂步骤。
5.EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。
6. Tris-EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。
7.胰蛋白酶：用于抗原修复的酶解剂。
8.蛋白酶K：用于抗原修复的酶解剂。
9.盐酸：用于抗原修复的酸性溶液。
10.一抗：选择特异性良好的一抗抗体，常用的有多克隆和单克隆抗体。
11.二抗：用于检测一抗结合的抗体，常用的二抗有反兔、反小鼠或反人的多克隆抗体。
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理和步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于组织学和细胞学研究中的实验方法，主要用于检测和定位蛋白质在组织或细胞中的分布和表达水平。
它结合了免疫学原理和组织学技术，通过使用特异性的抗体和染色剂来实现对目标蛋白质的检测和可视化。
免疫组化的原理主要是利用抗体的高度特异性与抗原相结合，然后使用染色技术来显示抗原的位置。
该技术的基本原理可分为抗原-抗体反应、信号放大和信号显示三个步骤。
第一步：抗原-抗体反应免疫组化的第一步是选择合适的抗体，通过与目标蛋白质的特异性结合来形成抗原-抗体复合物。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
单克隆抗体具有高度特异性，只能结合到特定的抗原上。
多克隆抗体具有高度敏感性，可以结合多个位点，从而实现信号放大。
通常，为了提高抗原的可检测性，需要对组织样本进行抗原修复处理。
这可以通过热处理（如蒸汽加热、微波加热）或酶切处理来实现。
修复可以解除组织样本中抗原与蛋白质结构之间的交联，增加抗体的渗透性和可结合性。
当抗原-抗体反应发生时，可通过一系列化学反应来形成抗原-抗体复合物。
例如，可以使用二抗来与抗原-抗体复合物结合，然后使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的二抗来与二抗结合。
该反应可形成稳定的抗体-酶复合物。
第二步：信号放大由于抗原-抗体复合物的信号很弱，通常需要进行信号放大以便更好地检测到目标蛋白质。
放大信号的方法有很多种，其中最常用的是酶免疫标记联合酶放大技术。
酶免疫标记是通过将抗体与酶结合，使其能够催化特定的化学反应来产生荧光、色素或光学信号。
常用的酶免疫标记包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
这些酶能够催化荧光素、二苯基胺、硝基蓝等底物的氧化还原反应，从而产生可视化的信号。
酶放大技术常用的方法包括：免疫酶化学法（如DAB法）、免疫荧光法和免疫酶学荧光混合法等。
这些方法可通过将底物转化为可见的色素或荧光信号来标记抗原-抗体复合物，从而实现目标蛋白质的检测和定位。
免疫组化步骤范文
免疫组化步骤范文免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种应用于组织学研究中的技术方法，用于检测和定位特定的抗原或蛋白质在组织或细胞中的表达。
免疫组化可以提供细胞和组织的一些重要信息，如蛋白质分布、定位和表达的数量。
以下是免疫组化的一般步骤：1.材料准备：-组织切片：将组织固定、包埋和切片。
-切片预处理：将切片置于载玻片上，并进行脱脂、水洗和固定处理。
2.抗原修复：-如果组织经过了形态改变或抗原损失，需要对切片进行抗原修复。
常见的方法有热处理（如煮沸、加热蒸汽、加热压力等）和酶处理（如胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等）。
3.阻断非特异性结合：-切片上的非特异性结合位点可能与前体抗体非特异性结合，导致假阳性结果。
因此，需要将非特异性结合位点进行阻断，通常使用牛血清蛋白（如BSA或NGS）或非特异性抗体进行阻断。
4.一抗处理：5.洗涤：-用缓冲液对切片进行洗涤，以去除未结合的一抗和非特异结合的物质。
6.二抗处理：-加入二抗，即针对一抗的抗体。
二抗通常是与标记物连接的抗体，可以是荧光染料、酶或金纳米等。
7.洗涤：-用缓冲液对切片进行洗涤，以去除未结合的二抗和非特异性的结合。
8.标记物检测：-标记物可以是荧光染料、酶或金纳米等，它们与二抗结合形成复合物，并可通过荧光显微镜或酶反应显色方法来观察。
9.洗涤和封片：-用缓冲液对切片进行彻底的洗涤，以去除未结合的标记物或荧光染料。
然后，将切片用有机溶剂除去水分，然后使用封片剂覆盖并封装切片。
10.观察和分析：-将切片放入显微镜下观察和分析，如荧光显微镜观察、酶反应显色方法观察等。
可以通过比较反应强度、分布和定位等特征来分析抗原或蛋白质在组织或细胞中的表达情况。
以上是一般的免疫组化步骤，具体操作可能会根据实验设计和研究目的的不同而有所差异。
在进行免疫组化实验时，需要严格控制实验条件和相应的质量控制，以确保结果的可靠性和准确性。
此外，还需要根据具体的实验需求选择合适的抗体、标记物和检测方法，以及根据组织类型和抗原性质选择适当的抗原修复和阻断非特异性结合的方法。
免疫组化怎么做
免疫组化怎么做
免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种在组织切片中使用抗体标记的方法，用于检测和定位特定蛋白质在组织中的表达和分布情况。
下面是免疫组化的一般步骤：
1. 固定组织：采集组织样本后，使用适当的组织固定剂将组织固定，以保持其形态和结构。
2. 切片制备：将固定的组织样本进行蜡块包埋或冷冻切片，并进行切片制备，以获得薄片。
3. 抗原恢复：在切片上进行抗原修复，以恢复抗原的免疫活性。
这通常通过热处理（如在高压锅或微波炉中加热样本）或酶消化来实现。
4. 阻断非特异性结合：使用一定的阻断剂，如动物血清或蛋白质阻断剂，来阻断非特异性结合。
5. 一抗反应：将待检测的一抗加入切片中，使其与靶蛋白结合。
一抗通常是通过小鼠或兔子产生的单克隆或多克隆抗体。
6. 二抗反应：加入与一抗同种动物种属产生的二抗，如小鼠或兔子抗小鼠或兔子的二抗。
这些二抗可以与一抗结合，从而形成复合物。
7. 可视化：使用适当的检测系统（如酶标法、荧光法或金标法）来对二抗进行可视化，以显示靶蛋白的定位和表达情况。
8. 盖玻片：将切片洗涤并用透明包玻片覆盖。
9. 观察和分析：使用显微镜观察组织切片，检查靶蛋白的表达和分布情况。
根据需要，可以使用计算机图像分析系统对切片进行定量分析。
以上是免疫组化的一般步骤，实际操作中可能会根据具体实验目的和试剂的不同进行一些微调和优化。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤1.溶解和固定样本：首先，将需要检测的细胞或组织样本固定在载玻片上。
最常用的固定剂包括甲醛和乙醇，固定时间可根据样本类型和大小来决定。
2. 渗透化处理：固定后的样本往往会产生较大的凝胶，渗透化处理是为了增加抗体的进入和细胞膜蛋白的释放。
渗透化处理一般使用皂类化合物如Tween-20、Triton X-100或SDS。
3.阻断非特异性结合：为了减少非特异性结合，需要进行阻断。
使用一种含有蛋白质（如牛血清白蛋白、胶原蛋白等）的缓冲液，将玻片上的固定样本浸泡数十分钟至数小时。
4.抗原恢复：一些蛋白质长时间固定后可能会导致其变性或掩盖其一些结构域，这种情况下需要进行抗原恢复。
抗原恢复有两种常见方法，热水浴和酶消化。
前者将玻片放在含有缓冲剂的热水中，后者则经过酶消化处理，例如使用胰酶。
5.抗体孵育：将特异性一抗加入到含有抗体绑定缓冲液中，然后将其滴加到玻片上，孵育在温和的条件下一段时间（通常为1小时至过夜）。
抗体结合到样本中的特定抗原上。
6.洗涤：洗涤步骤是为了去除非特异性结合的一抗和其他蛋白质。
使用含有适当洗涤缓冲剂（如磷酸盐缓冲液或PBS）的盛满容器，将玻片在其中轻轻漂洗数次。
8.再次洗涤：同样地，使用含有适当洗涤缓冲液的容器，将玻片在其中轻轻漂洗数次，去除非特异性结合的二抗。
9.信号放大：添加一种可视化或发光的底物使得免疫反应可见。
通常使用的方法有酶标记二抗、荧光染料标记的二抗或放射性标记的二抗。
10.显微镜观察：在光学显微镜下观察和记录实验结果。
使用显微镜观察样本，根据信号强度和位置对阳性和阴性结果进行评估。
这些步骤是一般免疫组化实验的基本步骤，但每个实验都有特定的条件和需求，可能需要对步骤进行修改和优化。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)是一种利用抗体与组织中的抗原特异性结合的技术。
它是一种重要的研究方法，可以用于检测和定位组织中的特定蛋白质和其他生化分子。
以下是免疫组织化学实验的一般操作步骤：1.样本处理：a.固定：将待检测的组织样本进行固定处理，以保持其形态结构并保留组织内的抗原。
b.切片：将固定的组织样本切成非常薄的切片（通常为3-5微米厚），并将其放置在载玻片上。
2.抗原解蓝（抗原恢复）：a.对于不同类型的组织样本，选择适当的抗原解蓝方法。
b.抗原解蓝可以通过加热、酶解或其他方法来恢复组织样本中的抗原。
3.阻断非特异性结合：a. 使用一种非特异性的蛋白质来阻断载玻片上未特异性结合的位点，例如牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)或小鼠免疫球蛋白(Mouse IgG)。
b.加入适当浓度的阻断剂，并孵育片玻片上的切片，以阻断非特异性结合位点。
4.主抗体孵育：a.加入含有特定抗原的主抗体溶液，其可以与组织样本中特定的抗原结合。
b.孵育片玻片上的切片，使主抗体与待检测的抗原结合。
5.洗涤：a.用缓冲液或PBS等洗涤溶液洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的主抗体。
6.二抗孵育：b.孵育片玻片上的切片，使辅助抗体与主抗体结合。
7.洗涤：a.再次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的辅助抗体。
8.信号放大：a.可根据需要，使用染色剂或底物来增强或显色识别待检测抗原的结合位置。
b.例如，使用荧光染料或酶底物，通过显微镜观察或光镜观察，可使抗原可视化。
9.洗涤：a.最后一次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的染色剂或底物。
10.封片：a.加入适当的封片剂，如富含丙酮的溶液，将载玻片上的切片封装起来，以保护切片和保存染色结果。
免疫组织化学是一种复杂的实验技术，需要仔细的操作和精确的控制条件才能得到准确的结果。
免疫组化步骤
1.石蜡切片, 60摄氏度烤片1小时.2.脱蜡: 依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精, 二甲苯浸泡10分钟, 酒精浸泡5分钟.3.抗原修复: 在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温. 或用高压锅煮沸3分钟后冷却至室温。
4.灭火内源性过氧化氢酶：在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min。
5.血清封闭：将载玻片置于PBS中5min，洗2次，马上加上山羊血清封闭液。
6.加一抗：如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。
加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。
MG7 使用浓度为2ug/ml左右; MG5使用浓度为3ug/ml左右(推荐1:100)；7.加二抗：PBS中洗3次，每次5min，加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。
8.加显色剂：PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。
镜下观察组织染色情况，适可而止。
9.复染：将显色后的片子用清水冲洗15分钟后，浸泡于苏木精中染色，一般为1-3分钟。
10.脱水：将复染后的片子置于水中冲洗5分钟后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。
每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
11.封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
抗体保存：分装后10-20ul/支存于-80摄氏度。
使用后剩余抗体存于4摄氏度不超过一周。
避免反复冻融。
免疫组化步骤及原理
免疫组化步骤及原理免疫组化是一种用于检测和定位特定细胞组织中特定分子的技术。
它可以帮助我们研究细胞的结构和功能，并在疾病诊断和治疗中发挥重要作用。
以下是免疫组化的步骤及其原理。
步骤一：标本固定免疫组化的第一步是将待检测组织样本固定在载玻片或其他固定载物上。
常用的固定剂包括福尔马林（formalin）和牛血清白蛋白（BSA）。
固定的目的是保持组织的形态结构并防止其腐解。
步骤二：脱水和去蜡接下来，固定的组织样本通常需要通过一系列酒精浓度逐渐脱水，然后使用组织蜡进行浸泡固化。
蜡浸泡的目的是保护组织细胞结构，并便于切片及后续的免疫标记。
步骤三：抗原暴露在进行免疫组化之前，需要通过抗原暴露步骤使组织样本中的目标分子或抗原暴露出来，便于其和抗体的结合。
这可以通过热处理（如加热松弛），酶解（如胰蛋白酶消化）或抗原修复剂（如热带缓冲液或消化酶）进行。
步骤四：非特异性结合位点的阻断为了阻断非特异性结合位点，需要在进行免疫反应之前进行非特异性抗体预处理。
这可以通过与蛋白质或动物血清结合的非免疫球蛋白（如Bovine Serum Albumin，BSA）或鱼胶（Fish Gelatin）来实现。
这样，可以降低背景信号并提高特异性。
步骤五：抗体结合在免疫组化过程中，使用特异性抗体与待检测的目标分子结合形成免疫复合物。
这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
单克隆抗体是由同一B细胞产生的一类抗体，具有高度特异性，并且可以与特定的抗原结合。
多克隆抗体则由多个B细胞产生，可以结合目标分子的多个表位。
步骤六：荧光或酶标记的二抗结合为了检测抗体和目标分子的结合，可以使用荧光染料或酶标记的二抗。
荧光染料（如FITC，Cy3，Cy5等）可以在荧光显微镜下观察到相应的光信号。
酶标记的二抗通常使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）来标记，这些酶可以催化或参与染色反应，并在光镜下呈现颜色。
步骤七：显色和观察显色的方法根据使用的标记物不同而有所不同。
免疫组化实验具体步骤及说明
免疫组化实验具体步骤及说明免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织部分或特定分子的表达、定位和定量的技术。
它基于抗原抗体相互作用的原理，通过特异性的抗体与目标分子结合形成复合物，再通过染色反应显示出目标分子的位置和数量。
IHC广泛应用于癌症诊断、疾病研究和药物开发等领域。
以下是免疫组化实验的具体步骤及说明：1.标本制备：首先，取得切片的组织标本，通常是经过固定和包埋的组织。
然后，将组织切片取下玻片，用去离子水处理。
最后，将切片分别置于乙醇溶液中进行脱水，再用苯酚或其他抗氧化剂处理，以保护切片的蛋白质结构。
2.去蜡：将切片置于细胞清洗液中，用搅拌器在室温下搅拌，去除蜡层。
然后，分别使用乙醇降级脱水和再次用去离子水处理，以去除残留的蜡。
3.抗原检出：使用特定的抗体来检测目标分子。
首先，在切片中添加抗原修复溶液，进行退火和抗原修复，以恢复抗原的免疫原性。
然后，用PBS洗涤切片，去除剩余的抗原修复液，并将切片与蛋白质阻断剂孵育，以防止非特异性结合。
最后，将切片与特异性的初级抗体孵育，以形成抗原-抗体复合物。
4.特异性结合检测：添加特异性的二级抗体，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗鼠IgG，与初级抗体特异性结合。
此外，还可以使用荧光标记的二级抗体，以便通过显微镜直接检测目标蛋白质的荧光信号。
完成二级抗体与抗原复合物的结合后，用PBS洗涤切片。
5.信号放大与检测：对于HRP标记的二级抗体，使用辣根过氧化物酶底物，如DAB（二氨基苯类胺）或TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）。
这些底物在酶作用下会形成可见的棕色沉积物。
对于荧光标记的二级抗体，在显微镜下直接检测荧光信号。
6.染色和显微镜观察：将切片用PBS洗涤，然后用余晖蓝染色溶液浸泡，以增强显微镜下观察的对比度。
最后，用水轻轻冲洗切片，除去多余的染色剂。
用显微镜观察切片，评估目标蛋白质的表达和定位。
免疫组化流程
免疫组化流程免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种通过检测组织中特定抗原蛋白的存在和定位的技术。
它在病理诊断、研究和药物开发中起着重要作用。
免疫组化流程主要包括标本处理、抗原修复、抗体染色和结果分析等步骤。
首先，标本处理是免疫组化流程中的第一步。
组织标本通常是从病理切片或细胞培养物中获取的。
标本需要经过固定、脱水、透明化等处理，以保持组织的形态结构和抗原的完整性。
固定可以使用福尔马林或其他化学试剂，脱水则是将组织中的水分逐渐置换为透明剂，如醇和二甲苯。
透明化后，标本被包埋在蜡块中，使其能够被切片。
接下来是抗原修复步骤。
在标本处理过程中，抗原可能会因为固定和包埋的影响而发生变性或者掩盖。
因此，需要通过加热或酶处理等方法来修复抗原。
常用的抗原修复方法包括热诱导抗原修复（heat-induced epitope retrieval, HIER）和酶诱导抗原修复（enzyme-induced epitope retrieval, EIER）。
这些方法可以使抗原重新暴露，提高抗体的结合效率。
随后是抗体染色步骤。
选择合适的一抗和二抗是关键。
一抗是指直接与目标抗原结合的抗体，而二抗则是与一抗结合的抗体。
在染色过程中，一抗首先与标本中的抗原结合，然后通过二抗与标记物（如酶、荧光物质）结合，形成可见的染色产物。
常用的标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。
染色后，标本需要经过反染、脱水、透明化等步骤，最终被封片封存。
最后是结果分析步骤。
通过显微镜观察染色后的标本，评估抗原的表达情况和定位。
根据染色的强度、范围和细胞定位等信息，对标本进行定性和定量分析。
结果分析还需要结合临床和病理信息，最终得出诊断或研究结论。
总的来说，免疫组化流程是一个复杂而精细的过程，需要严格控制各个步骤，确保结果的准确性和可靠性。
只有在规范的操作下，免疫组化技术才能发挥其在疾病诊断和研究中的重要作用。
超详细的免疫组化步骤
超详细的免疫组化步骤免疫组化是一种在细胞或组织中检测和定位特定蛋白质或抗原的常用方法。
它结合了抗体的特异性识别和化学染色的敏感性，可用于研究疾病机制、病理诊断以及新药的有效性评估。
下面将详细介绍典型的免疫组化步骤。
1.材料准备收集所需的材料，包括标本（细胞或组织切片）、抗体、试剂、缓冲液等。
确保材料的新鲜性和质量。
2.样本制备将组织或细胞样本固定在载玻片上，常用的固定剂包括福尔马林、乙醇、乙酸等。
固定时间和方式根据实验需求而定。
3.抗原修复将固定的样本进行抗原修复，以恢复被固定过程中可能损失的抗原活性。
常见的抗原修复方法包括热解固定、酶解和酸解等。
4.渗透化用洗涤缓冲液（如Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液）对样本进行渗透化处理，以增加抗体对检测目标的进入。
这可以通过在洗涤缓冲液中加入表面活性剂（如Tween-20）来实现。
5.阻断非特异性结合使用阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）、鱼胶蛋白或干奶粉，封闭未特异性结合位点，以减少背景信号。
6.抗体孵育加入一定浓度的特异性一抗（一抗），并在恰当的温度和时间下进行孵育，使抗体与目标抗原发生特异性结合。
此过程可通过在一抗溶液中加入低浓度的特异性二抗来增强信号。
7.洗涤使用洗涤缓冲液洗涤孵育后的样本，以去除未结合的抗体和其他非特异性反应物。
大约3-5次洗涤，每次持续几分钟。
8.抗原-抗体结合信号的检测根据一抗特异性结合后产生的信号进行检测。
常用的方法有酶标记法（如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的二抗）或荧光标记法（如荧光素二亚胺酸（FITC）或荧光素异硫氰酸酯（TRITC）标记的二抗）。
9.信号放大根据检测方法的要求，使用合适的信号放大试剂增强信号的灵敏度。
常见的方法有酶偶联信号放大（如使用酶标记的亲和二抗和酶底物）或荧光信号放大（如使用荧光放大试剂）。
10.染色在信号放大后使用染色试剂进行染色，以显示和定位目标抗原。
染色试剂的选择取决于检测方法，如DAPI（细胞核染色）、H&E（常规染色）、DAB（酶标记方法）等。
免疫组化原理及步骤
免疫组化原理及步骤免疫组化是一种常用于研究细胞和组织中蛋白质的定位、表达及定量的方法。
其原理基于抗原与抗体之间的特异性结合。
在进行免疫组化实验时，通常需经历如下步骤：1. 取样与制片：从待研究的组织或细胞中取得样本，并将其固定在载玻片或切片上，以便后续的实验处理。
2. 抗原恢复：某些样本经过固定处理后，可能会造成抗原的损失或掩盖。
因此，为了使抗原能更好地被抗体识别，常需要进行抗原恢复的步骤。
一般而言，常用的抗原恢复方法包括加热处理、酶解或化学处理等。
3. 阻断非特异性结合：为了避免非特异性的结合，需使用一些非特异性抗体或蛋白质（如牛血清白蛋白、胶原蛋白等）来阻断待测抗体结合样本中的非特异性位点。
4. 抗体标记与孵育：选择特异性与待测抗原结合的一抗体，并将其标记上可视化信号或发光染料等。
在将该标记抗体和样本一同孵育的过程中，待测抗原会与一抗体发生特异性结合。
5. 洗涤：通过洗涤步骤，去除与抗体无关的非特异性结合物，以减少背景信号的干扰。
6. 可视化和显色：对于免疫组化实验，最终需要将特异性结合的抗原或抗体定位，并使其可视化。
这可以通过结合染色剂、酶标记或荧光标记等方法实现。
7. 评价与分析：最后，通过显微镜观察和图像分析等手段，对标记结果进行定性或定量的评价与分析。
可以使用计算机软件进行图像处理和定量分析以获取更准确的数据。
总之，免疫组化的原理在于利用抗原与抗体的特异性结合来对蛋白质进行检测与定位。
在实验过程中，需要进行样本取样与制片、抗原恢复、非特异性结合阻断、抗体标记与孵育、洗涤、可视化和显色、评价与分析等一系列步骤。
这些步骤均为确保实验结果的准确性和可靠性所必需的。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤1.血样制备：-采集血液样本，离心分离血浆或血清。
-用PBS洗涤血浆或血清，去除杂质。
2.组织固定：-采集待检组织样本，用缓冲福迪液进行固定。
常用的福迪液包括4%的甲醛和10%的中性缓冲福迪液。
-将组织固定在玻片上，通常通过石蜡包埋来保护组织样本。
3.切片：-使用旋转式或电动切片机将固定的组织切割成5-10μm厚的切片。
-将切片放置在带有去福迪剂密封的玻片上，然后进行脱脂和重水处理。
4.抗原恢复：-将切片浸泡在适当的抗原恢复缓冲液中，以恢复切片中的抗原结构。
-常用的抗原恢复方法包括热敏感抗原恢复、酶消化抗原恢复和酸碱抗原恢复等。
5.阻断非特异性结合位点：-使用适当浓度的蛋白抑制剂（如牛血清蛋白）在切片上进行阻断，防止非特异性结合。
-将切片在室温下孵育一段时间，以使蛋白抑制剂有效阻断非特异性结合。
6.抗体染色：-添加特定的初级抗体到切片上，与待检测的特定抗原结合。
-孵育切片，使初级抗体与抗原结合。
-将切片用PBS或缓冲盐水洗涤去除未结合的抗体。
7.信号放大：-添加合适的二级抗体到切片上，与初级抗体结合。
二级抗体可标记有荧光染料、酶或金粒等。
-孵育切片，使二级抗体与初级抗体结合。
-将切片用PBS或缓冲盐水洗涤去除未结合的二级抗体。
8.检测与成像：-根据二级抗体标记的方式，使用合适的检测方法进行信号放大。
-如果使用荧光标记的二级抗体，可以利用荧光显微镜观察和拍摄图像。
-如果使用酶标记的二级抗体，可以使用底物和显色试剂进行检测和成像。
9.结果分析：-观察并分析免疫组化染色结果，评估抗原的定位和表达情况。
-可以使用计算机图像分析系统进行定量分析和比较。
10.结论和报告：-根据实验结果，得出结论并撰写实验报告。
-将实验结果与已知文献资料进行对比和解释，讨论可能的研究价值和应用前景。
注意事项：-实验过程中需严格遵守无菌操作规范，以避免交叉污染和误差。
-选用合适的正对照和阴性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化试验步骤
免疫组化试验步骤步骤一：固定组织样本首先，需要对组织样本进行固定以保持其形态结构和蛋白质的活性。
最常用的固定剂是10%的缓冲福尔马林（formaldehyde）。
将组织取样放入福尔马林中浸泡固定，时间一般为12-24小时。
固定后，将组织样本转移至70%的乙酸溶液中进行脱水处理并包埋在蜡中。
步骤二：切片将包埋的组织样本切割成薄片，厚度通常为4-6微米。
切片后，将其分布于载玻片上，然后将载玻片放在37摄氏度的烘箱中加热一段时间，使切片附着于载玻片上。
步骤三：抗原修复切片的抗原活性可能会因为固定和处理过程而受损。
因此，需要进行抗原修复以恢复其免疫原性。
常用的抗原修复方法有热处理和酶处理。
热处理是将载玻片放入加热的缓冲盐溶液中，加热时间和温度需要根据实验要求和组织样本的厚度进行优化。
酶处理则是使用特定的酶（如蛋白酶K）来消化抗原固定在组织中的结构。
步骤四：非特异性抗体阻断为了降低非特异性抗体的背景信号，需要对切片进行非特异性抗体阻断。
这可以通过在切片上涂覆一定浓度的非特异性抗体（如血清蛋白、乳清或牛血清白蛋白）来实现。
阻断后，切片在37摄氏度的湿箱中孵育一段时间。
步骤五：特异性抗体反应在进行免疫组化试验中，特异性抗体是关键的试剂。
特异性抗体与特定抗原结合，然后通过相应的检测方法进行信号放大和可视化。
特异性抗体的选择需要根据实验的目的和研究对象来确定。
常见的特异性抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
特异性抗体与切片孵育一定时间，然后移除并以PBS洗涤。
步骤六：二级抗体/标记物特异性抗体与抗原结合后，需要使用二级抗体或标记物来进一步放大信号并使其可视化。
二级抗体可以是针对特异性抗体的抗血清，也可以是标记有荧光染料、酶或金颗粒等的抗体。
与特异性抗体孵育后，切片再次用PBS洗涤。
步骤七：信号放大和可视化为了使抗原或抗体的信号更加明显和可视化，需要进行信号放大和可视化的处理。
这通常可以通过使用酶联免疫吸附（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）或免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）等方法来实现。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于病理学和生物医学研究中，用于检测和定量分析组织或细胞中特定抗原的方法。
它通过将标记有特定抗体的染色剂与细胞或组织中的相应抗原结合，从而实现对抗原的定位和可视化。
以下是免疫组化操作的详细步骤：准备组织样本：1.选择需要研究的组织样本，可以是固定的组织块、冰冻切片或细胞涂片。
2.如果是固定的组织块，使用福尔马林等适当的固定剂进行固定，并进行脱水和包埋。
3.如果是冰冻切片，将组织冷冻在液氮中，使用微型切片机切割薄片。
4.如果是细胞涂片，将细胞均匀涂布在载玻片上。
脱脂和再脱水：1. 对于固定的组织块和细胞涂片，使用低渗透性石蜡溶液（如xylene）进行脱脂，一般需要多次处理。
2.使用梯度酒精浓度（例如100%，90%，80%和70%）进行再脱水处理，每个浓度的浸泡时间一般为5-10分钟。
抗原修复：1.固定的组织块可使用热诱导抗原修复（如加热高压反应釜中）或酶诱导抗原修复（如2%的蛋白酶）进行抗原修复。
2.冰冻切片和细胞涂片不需要抗原修复。
阻断非特异性结合位点：1.使用一种非特异性抗体，如牛血清蛋白、小鼠和兔血清、杂交小鼠兔血清混合物等，进行阻断非特异性结合位点，减少假阳性反应。
一抗和二抗处理：1.加入特异性一抗，该抗体将结合目标抗原。
一抗的浓度根据实验要求和文献建议进行选择。
2.在室温下，对样本进行适当时间的孵育，以便一抗与抗原结合。
4.加入标记有荧光素或酶素的二抗，如荧光素-同种同型抗体或酶标记的抗小鼠或抗兔免疫球蛋白。
5.孵育样本适当时间，以便二抗与一抗结合。
洗涤：1.使用缓冲液对样本进行洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。
2.洗涤的时间和次数根据实验要求和抗体的特性进行调整。
可视化和显色：1.对于荧光标记的二抗，使用荧光显微镜观察并拍摄图像。
2.对于酶标记的二抗，使用适当的显色物质，如DAB（3,3'-二氨基苯啶）或VIP（维泊酶）等，进行显色反应。
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免疫组化步骤
1、烤片：放于60℃烘箱内，20-25min；
2、脱蜡：二甲苯I、II、III，3次，5min/次；
注：从烘箱中拿出迅速放入二甲苯中，防止蜡凝；
3、复水：100%酒精---100%酒精---95%酒精---90%酒精---80%酒精
---70%酒精---50%酒精，5min/次；
4、ddH2O洗2次，5min/次；
5、抗原修复：柠檬酸盐抗原修复液1x（迈新MVS-0100），125℃，
5min；
注：1x修复液：198ml ddH2O + 2ml抗原修复液100x,混匀；
抗原修复高压锅的使用：确定垫圈和导热片的放入，加入700ml ddH2O，放入铁架固定切片盒，注意不要压到导热片，盖
上锅盖检查排气嘴是否可以自由旋转，锅盖上的“close”对准
白点，“open”所指处与边缘无缝隙，设置程序，开始；结束后
等到排气口的红色指示消失即可打开锅盖；
6、修复结束后冷却至室温（30min），1xPBS洗2次，5min/次；
7、去除 H202酶：3%H202，15min；注意遮光；
注：用1xPBS稀释30% H202至3% H202（如5ml 30% H202+45ml PBS ）
8、PBS 2次，PBST 1次，5min/次；
9、封闭（blocking）：先将片子擦干，注意保持组织部分的湿润，
再用专用记号笔沿距离组织3mm处画圈，然后加入封闭液，室
温1h，湿盒；封闭液不要过多，以免溢出；
注：封闭液：1xPBS，0.3%Triton X-100，10% goat serum（如：870ulPBS+30ul 10% Triton X-100+100ul 10% goat
封闭液）；
10、孵一抗：用封闭液稀释一抗，不同的抗体稀释的倍数不同，4℃，
过夜（有的抗体是室温1h），湿盒。
对照组加不含抗体的封闭
液；注：拿到4℃冰箱时动作延缓慢，小心不要使一抗跑出圈
外；加一抗前可以重新画圈，以免一抗外流；
常用抗体的稀释比例：GFAP--1:200，Ki67--1:200，
CD31--1:20~1:40，Flag--1:200，Nestin--1:200，
III-Tubulin--1:1000
11、室温，30min；（从冰箱拿出时动作也要缓慢）
12、PBST洗3次，5min/次；
注：PBST：1L 1xPBS+10ml 10%Triton X-1000 ;
13、①加荧光标记的二抗（封闭液稀释抗体1:1000），1h，室温，
湿盒；②加HRP标记的二抗（封闭液稀释抗体1:10000），室温
30min; 注：加二抗前可以重新画圈，以防二抗外流；
14、PBST洗3次，5min/次；
15、若①复染：DAPI染色，避光，5min；若②TSA放大3~10min,PBST
洗3次，5min/次，再复染DAPI；
注：DAPI：50uM DAPI用1xPBS稀释1000倍
16、封片：直接向组织滴加抗荧光淬灭剂，注意不要产生气泡，盖
盖玻片时也要注意不要产生气泡，避光4~5min后即可拍片。