定量蛋白质组学的方法有哪些
蛋白定量的方法
蛋白定量的方法
蛋白定量是指检测样本中蛋白质含量的一种方法,也可以称为“蛋白测定”或“蛋白质测定”。
蛋白定量方法主要分为生物化学法、免疫分析法、流式细胞仪分析法和电泳分析法四大类。
1、生物化学法:生物化学法是目前最常用的蛋白定量方法,主要通过测定蛋白质的酶促反应来实现,如可用葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等蛋白质的特异酶作为指标,测量不同样本中的酶活性差异来实现蛋白定量。
2、免疫分析法:免疫分析法主要分为免疫印迹法(Western blotting)、免疫沉淀法(Immunoprecipitation)和ELISA三种,它们均利用特异的抗体对特定的蛋白质进行测定,以此来实现蛋白的定量。
3、流式细胞仪分析法:流式细胞仪分析法是一种基于细胞的分析方法,主要利用特定的抗体标记特定蛋白质,通过细胞分析仪分析细胞中标记蛋白质的数量,从而实现蛋白定量。
4、电泳分析法:电泳分析法是一种快速、灵敏的蛋白定量方法,其原理是利用电泳将多种不同种类的蛋白质分
子按大小和性质电泳分离出来,然后通过试剂盒进行叠加反应,使相应的蛋白分子变得可见,从而可以实现蛋白的定量。
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学五种常用蛋白质组学定量分析方法对比。
百泰派克生物科技汇总介绍了五种常见定量蛋白质组学分析方法的优势和特点。
SWATH-MS数据可重复性研究。
SWATH在不同实验室间可重复性的研究。
这个研究统计了全世界11个不同的实验室中使用SWATH鉴定的数据重复度情况。
iTRAQ/TMT标签结构以及相对定量原理详解。
通过标记多组不同样品,iTRAQ和TMT能够同时比对正常组织样品和肿瘤组织样品的蛋白水平差异,以及精准检测肿瘤在发展的不同阶段的蛋白水平变化。
蛋白质定量技术及其在临床研究中的应用。
百泰派克采用高通量质谱平台提供蛋白质定量服务,包括定量蛋白质组学,蛋白质定量技术及其他蛋白质组学相关的服务。
百泰派克生物科技独立仪器分析平台,拥有多年蛋白质定量经验,竭诚为您服务。
蛋白组分析中dda和prm。
DDA和PRM是质谱不同的数据采集模式。
DDA主要用于非靶向蛋白质组学的研究,PRM则用于靶向蛋白质组学的研究。
百泰派克生物科技提供基于质谱的DDA、MRM/PRM和DIA蛋白质组学分析服务。
iTRAQ定量蛋白质组学。
iTRAQ蛋白质组学即iTRAQ定量蛋白质组学,是一种标记定量蛋白质组学,指利用iTRAQ标记技术和质谱技术对蛋白质组进行定量。
百泰派克生物科技提供基于质谱的iTRAQ定量蛋白质组学分析服务。
蛋白互作定量检测。
蛋白互作定量检测指对相互作用的蛋白质进行定量。
百泰派克生物科技提供基于质谱的SILAC与免疫共沉淀质谱联用的蛋白互作定量分析服务,可同时实现互作蛋白质组的定性和定量。
DIA蛋白质组学样品处理步骤。
DIA蛋白质组学指利用DIA技术(如SWATH)对样品中的蛋白质组进行检测分析。
百泰派克生物科技提供基于质谱的DIA蛋白质组学分析服务和蛋白质样品制备服务。
功能蛋白质组学。
功能蛋白质组学是蛋白质组学的一部分,其主要目的是研究蛋白质的功能和生命活动的分子机制。
百泰派克生物科技提供基于质谱的功能蛋白质组学分析服务。
蛋白质组学三大基本技术
蛋白质组学三大基本技术
1、质谱技术:质谱技术是蛋白质组学中最常用的和最基本的技术,它可以检测和识
别各种生物样品中的蛋白质和其他大分子有机物,从而可以提高研究的准确性,特别是在
研究动态蛋白信号转导及表观遗传因子的时候,质谱技术的应用更加广泛。
质谱技术包括
两种:基于气相法的高级数据库技术,和基于液相法的maldi技术。
质谱技术主要是利用
质谱仪来获取受体上蛋白质结构的数据,然后利用数据库搜索,来识别出蛋白质结构特征
及在受体上的结合状态。
2、SDS-PAGE技术:SDS-PAGE技术是一种蛋白电泳分析技术,它可以分离组成复合蛋
白的每个蛋白质组分,并对蛋白质的组成成分及其特有的分子量进行测定,是一种蛋白质
分类及检测的基础性技术。
SDS-PAGE技术利用聚丙烯酰胺亚胺(SDS)作为为分子内部量均
分剂,可将蛋白链折叠、聚集形成单个分子,然后进行电泳分离操作,在膜隔开一定距离,然后再对所获取到的蛋白分子特征进行识别,以得出它的结构和分子量的信息,进而得出
受体上分子的特征及其功能。
3、免疫淋巴细胞技术:免疫淋巴细胞技术是实验可能性较好、分离效果更好。
它以
电泳分离技术作为分离介质,从新鲜样品中分离出完整的肽盐化药物,可有效地检测及克
隆受体上的蛋白片段及肩膀,进而得出蛋白质组学上受体特征及其功能。
蛋白定量方法
蛋白定量方法蛋白定量是生物学实验中常见的一项重要技术,准确的蛋白定量对于许多实验都至关重要。
在科研实验中,我们常常需要知道样品中蛋白的浓度,以便进行后续的实验操作。
因此,选择合适的蛋白定量方法对于实验结果的准确性和可靠性有着重要的影响。
目前常用的蛋白定量方法包括比色法、BCA法、Lowry法和荧光法等。
每种方法都有其特点和适用范围,下面将对这些方法进行简要介绍。
比色法是一种常用的蛋白定量方法,其原理是利用蛋白质与某些化学试剂作用后产生颜色反应,通过测量反应产生的颜色强度来确定蛋白质的浓度。
比色法操作简单,灵敏度高,适用于常规的蛋白质浓度测定。
BCA法是另一种常用的蛋白定量方法,其原理是利用蛋白质与BCA试剂在碱性条件下发生蓝色化合物的形成,通过测量产生的蓝色溶液的吸光度来确定蛋白质的浓度。
BCA法对于含有干扰物质的样品有较好的耐受性,适用于复杂样品的蛋白定量。
Lowry法是一种经典的蛋白定量方法,其原理是利用蛋白质与碱性铜离子和碱性蛋白质共存时产生的蓝色络合物来测定蛋白质的浓度。
Lowry法对于蛋白质浓度较高的样品有较好的灵敏度和稳定性。
荧光法是一种高灵敏度的蛋白定量方法,其原理是利用蛋白质与荧光染料结合后产生荧光信号来测定蛋白质的浓度。
荧光法对于蛋白质浓度较低的样品有较好的检测能力,适用于高灵敏度的蛋白定量。
在选择蛋白定量方法时,需要根据样品的特点以及实验的要求来进行选择。
在进行蛋白定量实验时,还需要注意操作的规范性和准确性,避免因操作不当而导致的误差。
另外,不同的蛋白定量方法在操作上也有一些细微的差别,需要根据具体的实验要求来进行选择。
总的来说,蛋白定量是生物学实验中非常重要的一项技术,选择合适的蛋白定量方法对于实验结果的准确性和可靠性至关重要。
希望本文对您在蛋白定量方法的选择和实验操作上能够提供一些帮助。
定量蛋白质组学分析方法
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谱
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第 3 1 卷
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2 蛋 白质 组非标 记 ( 1 a b e l f r e e ) 定 量方 法 的研 究
相 对 于传统 的标 记 定 量方 法 , 非标 记 定 量 方 法
不需要 在样 本分 析前 对蛋 白质/ 多 肽进 行标 记 , 避免 了样本 标记 处理 环 节 造 成 的可 能 的样 品损 失 , 在 检 测 肽段 的 数量 、 蛋 白质 的覆 盖 率 和 分 析通 量 方 面 具 有较 大优 势 , 且 不受 样 品来 源 和数 量 的限制 , 因而近
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蛋白质组学技术方法
(2)基于同位素标记亲和标签的定量蛋白质组学策略 Isotope-Coded Affinity Tags (ICAT)
ICAT为同位素编码的亲和标签,其试剂的羰基基团能够特异性地与半胱氨酸侧 链反应,使这些蛋白在分离时具有相同的特性,随后与质谱串联,根据质量的差异
03 进行区分并定量,可同时对蛋白质组进行鉴定和相对定量。
基质辅助激光解 吸电离飞行时间
质谱 SELDI-TOF-MS
双向电泳法 2-DE
荧光差异电泳 DIGE
稳定同位素标记 Stable isotope labeing
无标记定量法 Label-free
多反应检测技术 MRM
选择反应检测技 术
SRM
代谢标记 Metabolic labeling (SILAC、15N)
03 (1)双向电泳(2-DE)
非标法,采用凝胶法分离蛋白质,根据胶点灰度值和面积定量蛋白质。
凝胶需要每个样品有几个复制凝胶,不能直接重叠在一个凝胶。
优点:对分析组数无限制。
组 不足:1. 检测蛋白种类少。由于溶解性限制,难以检测到很多疏水的膜
学
技 结合蛋白、低丰度蛋白以及一些极酸极碱性的蛋白;
术
介 绍
蛋白质组学技术方法
目录
Content
1 蛋白质组学概念 2 定量蛋白质组学技术分类 3 定量蛋白质组学技术介绍
五
六
定
量
蛋
一
第
白
一
质
部 分
组
学
二
的
概
三
念
四
蛋白质组学
蛋白质组是指一个细胞、一个组织或一
01
种生物的基因组所表达的全部蛋白质的
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法蛋白质组学定量分析是对细胞或组织中的蛋白质进行定量分析的一种方法。
它是研究蛋白质组学的重要手段之一,可以揭示蛋白质的表达差异、功能变化以及相关的生物学过程和疾病机制。
目前,蛋白质组学定量分析的方法主要包括质谱定量法和定量免疫学方法。
质谱定量法是蛋白质组学定量分析的主要方法之一。
它基于质谱技术和同位素标记原理,使用质谱仪对样品中的蛋白质进行定量分析。
目前常用的质谱定量方法包括多重反应监测(MRM)、定量蛋白质鉴定(iTRAQ)和标记蛋白质鉴定(TMT)等。
多重反应监测(MRM)是一种常用的质谱定量分析方法。
它利用质谱仪中的三重四极杆(triple quadrupole)进行分析。
首先,确定待测蛋白质的肽段序列,然后合成同位素标记的肽段标准品作为内标。
接下来,使用质谱仪对待测蛋白质和内标进行质谱分析,测量待测蛋白质和内标的特定肽段的质荷比和峰面积。
最后,通过内标的峰面积和待测蛋白质的峰面积进行定量计算,得到待测蛋白质的表达量。
定量蛋白质鉴定(iTRAQ)是一种基于同位素标记的质谱定量方法。
在iTRAQ 实验中,待测组织或细胞培养基中的蛋白质经过胰蛋白酶消化后,将消化产物用不同的同位素标记。
这些标记反应产物有不同的质量,通过质谱分析可以得到有关各组分的数量比。
通过比较标记反应产物的相对丰度,可以定量分析待测蛋白质的表达差异。
标记蛋白质鉴定(TMT)是一种与iTRAQ类似的同位素标记质谱定量方法。
TMT 实验中,多个待测样品用不同的同位素标记,然后将这些样品混合在一起通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行分析。
通过质谱分析可以得到不同样品中蛋白质的相对表达量和差异表达蛋白质的鉴定。
定量免疫学方法也是蛋白质组学定量分析的重要方法之一。
相比于质谱定量法,定量免疫学方法具有高灵敏度、高特异性和高通量等优点。
常用的定量免疫学方法包括酶联免疫吸附实验(ELISA)、西方印迹(Western blotting)和流式细胞术(flow cytometry)等。
蛋白质组学定量研究常见方法-PPT课件
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1:双向电泳
基于2D-PAGE 的经典定量分 析方法。 1、样品准备 和定量:抽提 对照组和各种 不同实验组的 蛋白质。 2、蛋白质分 离:蛋白质经 过2D-PAGE分离 后染色(银染、 考染等)。 3、蛋白质的 定性与定量分 析:通过与对 照组相Image Master 7.0分 析出实验组中 差异点,质谱 鉴定差异点蛋 白质,同时应用 软件分析出其 表达量的变化。
4:化学标记法—ICAT
ICAT法的缺点: (1)它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 (2)ICAT分子量相对较大(约500Da),与蛋白质连接后可能会造成分子 的空间位阻 (3)ICAT分子量相对较大(约500Da),由于在MS分析中标签仍保留在每 个肽上,使得在碰撞诱导解吸(CID)条件下,很容易被片段化,那么标签特 异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化, (4) ICAT分子量相对较大(约500Da),这对小肽而言是一个较大的修饰 物,会增加数据库搜索的复杂性 (5)标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合,这可能会造 成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 (6)与原子结合的硫醚键化学稳定性较低,可能会自发发生β -消除反应 使部分标签断裂。
蛋白质组学定量研究常见方法
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蛋白质组学定量研究常见方法
1:常规双向电泳 2:DIGE 3:15N等同位素标记 4:ICAT 5:iTRAQ 6:SILAC
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蛋白质组学第10期定量方法介绍
蛋白质组学第10期定量方法介绍•蛋白质组学第1期-认识基础概念•蛋白质组学第2期-认识蛋白质组学原始数据•蛋白质组学第3期-蛋白质组学的三大元素•蛋白质组学第4期文章搜库过程复现•蛋白质组学第5期搜库软件之MaxQuant 再介绍•蛋白质组学第6期搜库软件之MaxQuant 结果数据介绍•蛋白质组学第7期复现文章数据- 预处理之Perseus 的使用•蛋白质组学第8期文章复现之数据处理•蛋白质组学第9期文章数据分析之差异蛋白筛选和功能分析•知识回顾定量蛋白质组学一、无标定量(相对定量)1.概念2.原理参考文献3.理论基础方法一方法二4.流程5.特点二、有标定量1.概念2.原理3.种类4. ITRAQ1)参考文献2)原理3)ITRAQ4)实验流程5)峰谱结果6)特点5、SILAC1)基本原理和流程2)参考文献3)优势知识回顾我们先来回顾以下蛋白质组学bottom up的流程先将蛋白用胰酶酶,酶切肽段上质谱检测,搜库软件搜库,数据分析img定量蛋白质组学对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究,识别功能模块和路径,监控疾病的生物标志物,这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量参考文献(Quantitative mass spectrometry in proteomics : acritical review)img文章展现了:代谢标记、化学标记、合成标准肽、无标定量(lable free),虽然文章时间较早,但是对于不同方法的比较描述很清楚一、无标定量(相对定量)1.概念无标记定量法是一种质谱分析方法,目的是测定两个或两个以上生物样品中蛋白质的相对含量,不使用含有稳定同位素的化合物蛋白质。
2.原理参考文献基于质谱的定量蛋白质组学策略和方法研究进展. 中国科学 : 生命科学 , 2015.3.理论基础方法一基于离子流色谱峰(extracted ion current, XIC)的定量算法(MaxQuant)img在保留时间(retention time, RT)轴上, 根据肽段母离子的质荷比提取不同保留时间下的相应同位素峰簇的信号强度, 重构 XIC, 并利用XIC 的面积或信号加和等指标作为肽段的定量结果.(Maxquant) 方法二谱图计数(Spectral Counting)方法。
蛋白质组学定量研究常见方法
蛋白质组学定量研究常见方法蛋白质组学定量研究是通过测定蛋白质样本中蛋白质的相对或绝对含量来了解生物系统中蛋白质表达的变化。
在蛋白质组学定量研究中,有很多常见的方法,包括质谱法、免疫学法、色谱法和光谱法等。
以下将对其中几种常见方法进行介绍。
1.质谱法质谱法是蛋白质组学定量研究中应用最广泛的方法之一、质谱法可以利用质量比较准确测定蛋白质的绝对或相对含量。
常见的质谱方法包括二维凝胶电泳质谱法(2D-DIGE)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)和同位素标记质谱法(SILAC),通过这些方法,可以高效准确地测定蛋白质的绝对或相对表达水平。
2.免疫学法免疫学法是一种广泛使用的定量蛋白质组学方法,其基本原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合,并通过与荧光或酶标记结合进行测定。
常见的免疫学方法包括Western blot、ELISA、流式细胞术和蛋白质芯片技术等。
这些方法具有高灵敏度和高特异性,可以快速准确地测定蛋白质的表达水平。
3.色谱法色谱法是一种常见的蛋白质组学定量方法,通过色谱柱的分离和去除杂质,从而获得纯净的蛋白质。
色谱法可以分为离子交换色谱、逆向相色谱、尺寸排除色谱和亲和层析等。
通过这些技术,可以高效准确地测定蛋白质的含量和纯度。
4.光谱法光谱法是一种快速准确测定蛋白质含量的方法。
在紫外-可见吸收光谱法中,通过测定蛋白质在特定波长下的吸光度,可以间接测定其含量。
此外,还有荧光光谱法和圆二色光谱法等。
这些光谱法可以快速定量蛋白质的含量,并了解蛋白质的构型和结构。
除了上述方法外,还有一些辅助分析方法,如蛋白质互作法(如蛋白质关联网分析)、功能学法(如蛋白质酶活测定)和结构分析法(如X射线晶体学)等,可以进一步了解蛋白质的功能和结构。
总结起来,蛋白质组学定量研究常见方法包括质谱法、免疫学法、色谱法和光谱法等。
这些方法在蛋白质组学研究中发挥重要作用,可以用于研究蛋白质的表达变化、功能与结构。
随着技术的不断发展,蛋白质组学定量研究方法也在不断更新和完善。
蛋白质定量的五种方法
蛋白质定量得五种方法方法一双缩脲法测定蛋白质浓度[目得]掌握双缩脲法测定蛋白质浓度得原理与标准曲线得绘制、 [原理]双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物,称为双缩脲反应,蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH—)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物、在一定范围内,其颜色得深浅与蛋白质浓度成正比。
因此,可以利用比色法测定蛋白质浓度。
双缩脲法就是测定蛋白质浓度得常用方法之一。
操作简便、迅速、受蛋白质种类性质得影响较小,但灵敏度较差,而且特异性不高。
除—CONH-有此反应外,-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。
[操作]取中试管7支,按下表操作。
各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。
用540nm比色,以空白管调零点,读取各管光密度值。
[计算](一)在座标纸上以光密度为纵座标,以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。
(二)从标准曲线中查出待测血清样本得蛋白质浓度(g/L),并求出人血清样本得蛋白质浓度、(三)再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者,求出人血清样本得蛋白质浓度(g/L)。
[器材]中试管7支,l毫升刻度吸管3支,10毫升刻度吸管1支,水浴箱,721型分光光度计、坐标纸。
[试剂](-)6N NaOH:称取240g氢氧化钠溶于1000ml水中。
(二)双缩脲试剂:称取CuS04·5H2O 3。
0克,酒石酸钾9。
0 克与碘化钾5.0克,分别溶解后混匀,加6N NaOH l00ml,最后加水至1000ml,贮于棕色瓶中,避光,可长期保存、如有暗红色沉淀出现,即不能使用。
(三)0.9%NaCl。
(四)蛋白质标准液(10mg/m1),称取干燥得牛血清蛋白100、0mg,以少量生理盐水溶解后倒入l0ml容量瓶中,淋洗称量瓶数次,一并倒入容量瓶中,最后加生理盐水至刻度线,或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量,然后稀释成l0mg /m1作为蛋白质标准液。
蛋白质的定量分析方法
蛋白质的定量分析方法1.蛋白质的常规检测方法1.1凯氏定氮法一种最经典的蛋白质检测方法。
原理:样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫酸铵。
然后加碱蒸馏放出氨,氨用过量的硼酸吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。
优点:范围广泛、测定结果准确、重现性好。
缺点:操作复杂费时、试剂消耗量大。
1.2双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。
原理:双缩脲是三分子的脲经180℃左右加热,放出一份子氨后得到的产物,在强碱性溶液中,双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物(肽链中的氮原子和铜离子配价结合),称为双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅和蛋白质浓度成正比,因此可用来测定蛋白质含量。
优点:较快速、干扰物质少、不同蛋白质产生的颜色深浅相近。
缺点:灵敏度差、三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。
1.3Folin酚试剂法原理:与双缩法大体相同,利用蛋白质中的肽键和铜离子结合产生双缩脲反应。
同时也由于Folin酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。
在一定条件下,蓝色深度与蛋白的量成正比,由此可测定蛋白质的含量。
优点:灵敏度高、对水溶性的蛋白质含量的测定很有效。
缺点:费时,要精确控制操作时间;Folin酚试剂的配制比较繁琐,且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂(二硫代苏糖醇、巯基乙醇)、EDTA和尿素均会干扰反应。
1.4紫外吸收法原理:蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm处具有紫外吸收,其吸光度与蛋白质含量成正比。
此外,蛋白质溶液在280nm处的吸光值与肽键含量成正比。
利用一定波长下蛋白质溶液的吸光值与蛋白质含量的正比关系可以测定蛋白质含量。
优点:简便、灵敏、快速、不消耗样品,测定后能回收。
缺点:测定蛋白质含量的精确度差、专一性差;干扰物质多,若样品中含有嘌呤、嘧啶等能吸收紫外光的物质会出现较大的干扰。
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法主要有两种:定性分析和定量分析。
1. 定性分析:常用的定性分析方法有蛋白质质谱技术,如蛋白质液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。
这些方法能够对样品中的蛋白质进行分离、鉴定和定性分析,可以确定蛋白质的氨基酸序列和特定的修饰情况。
2. 定量分析:常用的定量分析方法有标记蛋白质定量和非标记蛋白质定量。
标记蛋白质定量方法包括同位素标记法和化学标记法。
同位素标记法主要包括稳定同位素标记法(如氘代谱标法)和放射性同位素标记法(如放射性同位素测量法)。
化学标记法主要包括功能分子标记法(如荧光标记法和生物素标记法)和反应性标记法(如对硝基苯甲酸标记法和丙煮醛标记法)。
非标记蛋白质定量方法常用的有相对定量法和绝对定量法。
相对定量法主要通过蛋白质相关的性质,在样品中不同蛋白质的含量所具有的差别来进行定量。
常用的相对定量方法有比较蛋白质的荧光标记法、差减荧光凝胶法和差异凝胶电泳法等。
绝对定量法主要使用内标法,通过加入已知浓度的内标蛋白质来计算目标蛋白质的浓度。
常用的绝对定量方法有多重反应监测法(MRM)和定量蛋白质标准曲线法等。
生物信息学中的蛋白质组学技术
生物信息学中的蛋白质组学技术随着生物学和计算机科学的快速发展,将蛋白质组学技术与生物信息学相结合已经成为了研究蛋白质在生物系统中作用和展现的重要手段。
蛋白质组学技术是近年来兴起的一种高通量技术,能够在不同紧急和不同条件下快速鉴定蛋白质并进行分析。
本文将介绍生物信息学中的蛋白质组学技术的基本原理、常用方法和应用。
蛋白质组学技术的基本原理在生物信息学中,蛋白质组学技术是一种定量蛋白质和代谢产物分析的方法。
通过分析生物体中蛋白质的组成和分布,可以解决蛋白质相互作用、代谢通路、信号转导等复杂的分子机制问题。
蛋白质组学技术基于蛋白质在生物体中的表达、功能和亚细胞分布等特性,采用多种生化分离和质谱技术对蛋白质进行鉴定和定量分析。
蛋白质组学技术常用的方法1. 二维凝胶电泳技术(2-DE)二维凝胶电泳技术是一种常用的分离和定量蛋白质的方法。
它将蛋白质分子按照电荷和分子量两个维度进行分离,从而得到一个二维蛋白质电泳图谱。
这种方法可以分离出几千个蛋白质,是高分辨率蛋白质分析方法之一。
同时,二维凝胶电泳技术也被广泛应用于酶活性的检测和定量。
由于其对样品量要求较高和谱图分析的复杂性,二维凝胶电泳技术的应用范围受到一定限制。
2. 质谱技术质谱技术是一种利用质谱仪进行蛋白质鉴定的方法。
这种方法依赖蛋白质分子的离子化和碎片化,将碎片化的蛋白质进行质谱分析,进而得到各种化学参数。
质谱技术的优势在于可以分析极小量的蛋白质,并对蛋白质分子的序列和结构进行分析。
同时,质谱技术在准确度、灵敏度和多样性等方面优于其他适用于该领域的分析技术。
3. 蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质定量和分析技术。
通过将具有不同功能的蛋白质分子或其片段加到芯片上,可以同时检测数千个蛋白质或蛋白质相互作用。
蛋白质芯片技术可用于测定蛋白质表达量、活性、功能和相互作用,以及蛋白质与其他分子的交互作用。
这种技术的优势在于其快速性、简便性和灵敏度,足以满足复杂生物样品的多维蛋白质表达、诊断和治疗等需求。
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学定量蛋白质组学hplc2-液色迷人蛋白质组学研究的核心内容是蛋白质的动态变化和动态行为,即蛋白质的动态表达、动态定位、动态修饰和动态相互作用等,最终的研究目的是以大规模的尺度研究细胞内蛋白质的功能,这种研究要走向成熟必然要脱离对蛋白质的简单鉴定,实现对蛋白质的表达水平及其存在形式变化的检测。
因此,定量技术应该说是整个蛋白质组学的精华部分。
而这种定量通常不必是检测蛋白质在细胞内的绝对含量,而只需对其相对含量进行定量即可。
目前,蛋白质组研究中应用的比较成熟和可信的定量策略和方法主要有两种。
一种是基于传统双向凝胶电泳及染色基础上的定量,另外一种是基于质谱检测技术的定量。
1、基于双向凝胶电泳及其染色的蛋白质组学定量技术建立在传统的双向凝胶电泳和染色基础上的定量方法,通过比较不同胶上蛋白质点的染色强度来进行相对定量。
现有的染色方法包括银染、考马斯亮蓝染色,还有最新的荧光燃料。
染色在显示蛋白质的存在的同时,还提供了其表达水平的信息。
传统的双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)技术由O’Farrell和Klose等人于1975年建立。
第一向为等电聚焦(Isoelectrofocusing,IEF),使蛋白质根据等电点不同进行分离,第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),即将等电聚焦后的胶条放在SDS-PAGE上再根据蛋白质分子量不同进行电泳分离。
由于具有高分辨率的特点,双向凝胶电泳在蛋白质组学的研究当中始终占据着重要的地位。
现在的双向凝胶电泳技术第一向利用固相pH梯度(Immobilized pH Gradient,IPG)等电聚焦技术,具有上样量大、分辨率高、重复性好等优点,并且可以提供蛋白质的等电点(pI)和分子量(MW)数值信息,有助于蛋白质的鉴定,而且双向凝胶电泳胶上常见的isoform多是蛋白质翻译后修饰的结果,对于这些蛋白质点的分析有助于了解对蛋白质功能影响重大的翻译后修饰。
定量蛋白质组学研究技术
定量蛋白质组学研究技术质谱法是一种使用质谱仪来分析蛋白质的方法。
它可以通过测量蛋白质分子的质量和电荷比例,来确定蛋白质的存在和数量。
质谱法有多种不同的变体,包括质谱法,液相色谱质谱法(LC-MS),以及多反应监测质谱法(MRM)。
这些方法结合了高效液相色谱(HPLC)和质谱仪,可以实现高通量的蛋白质分析,同时还可以检测蛋白质的修饰和亚细胞定位。
标记法是一种通过引入标记分子来量化蛋白质的方法。
常用的标记分子包括放射性同位素、生物素、荧光染料和金纳米颗粒等。
这些标记分子可以与蛋白质特定的官能基结合,并通过测量其信号强度来定量蛋白质的存在和数量。
标记法适用于大规模的蛋白质组学研究,可以同时测量大量的样品。
免疫法是一种使用抗体来定量蛋白质的方法。
这种方法通过引入与特定蛋白质结合的抗体,然后使用荧光或酶作为信号分子,来测量蛋白质的数量。
免疫法可以用于分析特定蛋白质或蛋白质家族的表达和定量。
同时,由于抗体具有高度的特异性,免疫法还可以用于检测蛋白质的修饰和亚细胞定位。
除了上述常用的方法,还有一些新兴的定量蛋白质组学研究技术。
例如,双重标记代谢组学(DIA)是一种结合了质谱法和标记法的新方法,可以同时测量整个蛋白质组的表达和修饰。
单细胞蛋白质组学是一种用于分析单个细胞蛋白质组的技术,可以揭示细胞间的异质性和复杂性。
总之,定量蛋白质组学研究技术是一种重要的工具,可以帮助我们更深入地了解生物体内蛋白质的存在和功能。
这种技术可以通过多种方法实现,包括质谱法、标记法和免疫法等。
随着技术的发展,新的定量蛋白质组学研究技术也在不断涌现,将为蛋白质组学研究带来更多的机会和挑战。
定量蛋白质组学分析方法及应用
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简述定量蛋白质组学技术
定量蛋白质组(quantitative proteomics)是把一个基因组所表达的全部蛋白或者是一个复杂体系所有的全部蛋白进行鉴定和定量的方法。
蛋白质组丰度的动态变化对各种生命过程都有重要影响。
例如在许多疾病的发生和发展进程中,常常伴随着某些蛋白质的表达异常。
发展至今,传统的基于双向电泳的2D和2D-DIGE技术正在逐渐被基于NanoLC-MS/MS的液质联用技术取代;后者需要的样品量更少(25ug蛋白),灵敏度更高(ng级),通量也更高(一次分析可以鉴定和定量超过5000种蛋白)。
定量蛋白质组学常见技术如iTRAQ/TMT、Label Free、三类定量方法,百泰派克均可为您提供服务。
在这里我们给大家简要介绍一下这三种定量蛋白质组学方法:iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技术分别由美国AB Sciex公司和Thermo Fisher公司研发的多肽体外标记定量技术。
该技术采用多个(2-10)稳定同位素标签,特异性标记多肽的氨基基团进行串联质谱分析,能够同时比较多达10种不同样本中蛋白质的相对含量,可用于研究不同病理条件下或者不同发育阶段的组织样品中蛋白质表达水平的差异。
分析原理iTRAQ/TMT标签包括三部分,如下图:1. 报告基团(reporter group):指示蛋白样品丰度水平。
2. 平衡基团(balance group):平衡报告基团的质量差,使等重标签重量一致,保证标记的同一肽段m/z相同。
3. 肽反应基团(amine-specific reactive group):能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接,从而标记上肽段。
来自不同样品的同一肽段经试剂标记后具有相同的质量数,并在一级质谱检测(MS1)中表现为同一个质谱峰。
当此质谱峰被选定进行碎裂后,在二级质谱检测(MS2)中,不同的报告基团被释放,它们各自的质谱峰的信号强弱,代表着来源于不同样品的该肽段及其所对应的蛋白的表达量的高低。
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定量蛋白质组学的方法有哪些?
1 背景和意义
从生命活动的直接执行者——蛋白质的角度研究生命现象和规律(特别是疾病防治和病理研究)已成为研究生命科学的主要手段。
而这些研究往往离不开对细胞、组织或器官中含有蛋白质种类和表达量的研究。
对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究,识别功能模块和路径,监控疾病的生物标志物,这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量。
生物质谱技术的出现和不断成熟为蛋白质差异表达分析提供了更可靠、动态范围更广的研究手段。
基于质谱技术,科学家们不断开发出新的定量蛋白质组学方法,来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。
2 方法学介绍
目前较主流的定量蛋白质组学方法有5种,分别是Label-free、iTRAQ、SILAC、MRM(MRM HR)、和SW ATH。
简述如下:
2.1 Label-free
Label-free定量,即非标记的定量蛋白质组学,不需要对比较样本做特定标记处理,只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化,通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。
Label-free操作简单,可以做任意样本的总蛋白质差异定量,但对实验操作的稳定性、重复性要求较高,准确性也较标记定量差。
因此,Label-free技术适合于大样本量的定量比较,以及对无法用标记定量实现的实验设计。
2.2 iTRAQ
iTRAQ定量是目前定量蛋白质组学应用很广泛的技术,该技术的核心原理是多肽标记和定量,将多肽的含量转化为114、115、116和117同位素的含量(或113、114、115、116、117、118、119和121的8标记),从而简化了定量的复杂性,最终通过多肽定量值回归到蛋白的定量值,从而最终测定出不同样本之间蛋白质的差异。
iTRAQ定量不依赖样本,可检测出较低丰度蛋白,胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等,且定量准确,可同时对8个样本进行分析,并可同时得出鉴定和定量的结果,特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析。
金开瑞质谱平台应用iTRAQ定量技术,可鉴定多达6000种蛋白(以人HepG2为例),重复样品间的蛋白表达量相关性可达到0.95以上。
2.3 SILAC
SILAC定量的基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(中性或重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸,细胞经5-6个倍增周期后,稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。
不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合,经分离、纯化后进行质谱鉴定,根据一级质谱图中两个同位素型肽段的面积比较进行相对定量,属于体内代谢标记法。
SILAC属于体内标记技术,更接近样品真实状态,标记效率高达100%,且标记效果稳
定,不仅适合于进行全细胞蛋白分析,还适合于膜蛋白的鉴定和定量,每个样本只需要几十微克的蛋白量。
SILAC定量适用于活体培养细胞的分析,对多个样品或同一样品不同条件下全细胞蛋白或亚细胞蛋白进行差异比较。
2.4 MRM和MRM HR
MRM是一种基于已知信息或假定信息设定质谱检测规则,对符合规则的离子进行信号记录,去除大量不符合规则离子信号的干扰,从而得到质谱信息的一种数据获取方式,属于目标蛋白质组。
其关键在于首先要能够检测到具有特异性的母离子,然后只将选定的特异性母离子进行碰撞诱导,最后去除其他子离子的干扰,只对选定的特异子离子进行质谱信号的采集。
金开瑞依据前人的工作在AB SCIEX的5600-plus 仪器上开发出了MRM HR技术,因为MRM HR采纳了高精度的数据,因此选择Transition更加可信,定量更加准确。
MRM HR技术通过两级离子选择,排除大量干扰离子,使质谱的化学背景降低,目标检测物的信噪比显著提高,从而实现检测的高灵敏度,并具有重现性好、准确度高等特点,特别适合于已知蛋白质序列的蛋白质表达量差异验证,可以检测较低丰度的蛋白,但一次MRM实验只能检测到20个左右的目标蛋白。
2.5 SW ATH
SWATH是瑞士苏黎世联邦理工学院的Ruedi Aebersold 博士及其团队与AB-SCIEX于2012年联合推出的一项全新的质谱采集模式技术,是MS/MS ALL技术的一种扩展。
与传统的shot-gun技术相比,SW ATH采集模式能够将扫描区间内所有的肽段母离子经过超高速扫描并进行二级碎裂,从而获得完整的肽段信息,是一种真正全景式的、高通量的质谱技术。
金开瑞现有的Triple-TOF 5600-plus质谱系统,使SWATH定量具有较高的准确度和动态范围,可检测到蛋白质的丰度差异极大,跨越4个数量级。
应用SWATH采集模式,一次实验即可获得完整的定量与定性结果,无需进行方法优化。
它可以采集样品中所有化合物的信息,可以对所有化合物进行追溯、查询和分析。
定量方法采用高分辨模式,可以消除干扰,提高选择性,且定量能力可与三重四级杆质谱相媲美,灵敏度和动态范围与SRM分析水平相当。
针对亚细胞结构、细菌、真菌、细胞分泌物等样本,SWATH定量的效果非常好。
3 结语
学是对一个细胞或组织所表达的蛋白质进行的系统分析,分析技术包括分离蛋白质和肽的分离科学、识别和定量分析物的分析科学和数据管理和分析的,是其关键性分析工具。
该技术现在已经被作为普遍的发现工具来动态检测一个细胞或组织对外来或内部干扰反应,即定量蛋白质组学。
针对不同的样本,不同的实验分析目的,可选择不同的定量分析技术。