壳聚糖—聚乳酸阿霉素胶团的制备及含量测定

壳聚糖—聚乳酸阿霉素胶团的制备及含量测定目的合成并考察壳寡糖-聚乳酸嫁接物及其胶团的理化性质，荧光测定阿霉素胶团的载药量。

方法采用纤维素酶对壳聚糖进行降解，制备低分子量壳聚糖、壳寡糖。

以碳二亚胺为交联偶合剂合成壳寡糖-聚乳酸聚合物，超声分散法制备嫁接物胶团；微粒粒度及表面电位仪测定其粒径和表面电位；以阿霉素为模型药物，考察胶团对药物的增溶能力、药物包封率、载药量。

结果在壳寡糖-聚乳酸嫁接物中，壳寡糖分子量为20000、聚乳酸分子量为5000的嫁接物平均粒径最小，药物包封率最高；聚乳酸分子量为5000壳寡糖-聚乳酸嫁接物载药胶团载药量较高。

结论壳寡糖-聚乳酸聚合物胶团是一种良好的抗肿瘤药物载体，本方法可用于阿霉素胶团中阿霉素的含量测定标签：阿霉素；聚合物胶团；药物载体在药剂学领域中，具有病灶组织、细胞靶向控释给药系统[1]可提高药物的稳定性以及药物的生物利用度，是当前的热点研究之一；通过药物载体材料的被动靶向与在此基础上的主动靶向配体修饰技术，可实现药物的靶向治疗，在最大限度提高药物本身疗效的同时，减少因药物分子在体内的非靶向分布所造成的毒副作用。

聚合物胶团[2]作为一种药物传输系统，可以控制药物在生物体内的释放；可穿过血脑屏障、网状内皮组织系统，达到被动靶向的目的；聚合物胶团骨架对药物的保护和屏蔽作用，可在一定程度上避免药物的分解，保持药物的稳定性，降低药物的毒性；与脂质体相比，聚合物胶团的载药量较高；聚合物材料的多样性，使得以聚合物为载体的药物制剂亦多样化，能满足各种使用需求。

壳聚糖[3]是一类由氨基葡萄糖组成的阳离子聚合物，具有很好的生物相容性、低毒性和可生物降解性，广泛应用于药物载体材料的研究。

但由于壳聚糖的高分子量，高粘性以及在生理pH条件下不溶等这些缺点，增加了壳聚糖微粒和纳米粒的制备难度，以及限制了疏水改性壳聚糖胶团的应用。

聚乳酸（PLA）是一种无毒，可生物降解的聚合物[4-5]，具有很好的生物相容性，是美国食品和药物管理局（FDA）认可的一类生物医用材料。

作为疏水材料可与亲水性的材料合成的嵌段共聚物。

本研究通过壳寡糖的氨基与聚乳酸的羧基之间的偶合反应合成壳寡糖-聚乳酸嫁接物，并以超声分散法制备壳寡糖-聚乳酸嫁接物胶团；研究不同分子量壳寡糖和不同分子量的聚乳酸的壳寡糖-聚乳酸嫁接物胶团的粒径、粒径分布、表面Zeta电位、临界胶团浓度等理化性质；以亲脂性抗肿瘤药物阿霉素为模型药物，考察嫁接物胶团的药物增容能力、药物包封率、载药量。

1 资料与方法1.1仪器电子天平（JA2003，上海楚定分析仪器有限公司），超滤离心管（Microcon YM-10，MWCO 10，000，Millipore Co.，USA），透析袋（MWCO 3500da，Spectrum Laboratories，Laguna Hills，CA），高效液相色谱仪（Agilent1260，USA），微粒粒度与表面电位测定仪（3000HS，Malvern Co.，UK），荧光分光光度计（F-4600，HITACHI Co.，Japan），冷冻干燥机（FD-1D-50，北京博医康实验仪器有限公司），低速离心机（BK-TDZ4-WS，济南鑫贝西生物技术有限公司），超声波细胞粉碎机（JY98-ⅢDN，宁波新芝科器研究所）1.2材料壳聚糖（分子量450 KDa，95 %脱乙酰度，浙江玉环海洋生物化学有限公司），纤维素酶（CP Power，中国科技开发研究院浙江分院），碳二亚胺（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC，Sigma Chem.Co，St.Louis，MO USA），芘（Aldrich Chem.Co.，USA），端羧基聚乳酸（分子量5000，10000；山东省医疗器械研究所），盐酸阿霉素（Adriamycin.HCl，Adr，浙江海正药业股份有限公司），其它溶剂或试剂均为分析纯。

1.3方法1.3.1壳寡糖的制备称取壳聚糖25g倒入烧杯，加750ml水和9.4ml盐酸，在55℃下搅拌溶胀2h后，加入1.25g壳聚糖酶，控制搅拌速度、反应温度和时间制备不同分子量的低分子量壳聚糖（壳寡糖）。

待反应结束后，加入5 %活性炭，80℃条件下搅拌30min，使酶失活，冷却至室温后，4000r·min-1离心10min，分离活性炭，上清液用微孔滤膜处理完全除去活性炭后，喷雾干燥，即得壳寡糖，密封低温保存备用。

1.3.2壳寡糖分子量测定本研究采用凝胶渗透色谱法（GPC）测定壳寡糖的分子量。

凝胶渗透色谱条件：色譜柱：TSK-gel G3000 SW；流动相：0.1 M 醋酸钠（用醋酸调pH至6.0）；柱温：25 ℃；检测器温度：35 ℃；进样量：10μl；流速：0.8 ml·min-1。

以分子量为0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.0 Kda的葡聚糖标样制备标准曲线，用该标准曲线计算壳寡糖分子量。

1.3.3壳寡糖-聚乳酸嫁接物（CSO-PLA）的合成取0.1g壳寡糖，精密称定，加2ml纯水溶解，水浴恒温在80℃。

另称取适量聚乳酸溶于20mlDMF中。

将上述两溶液混合后，80℃恒温。

称取EDC适量溶于适量纯水中，以一定的时间间隔在80℃的壳寡糖聚乳酸混合溶液中加入定量的EDC水溶液。

以开始加入EDC 水溶液的时间作为嫁接反应的开始时间，在400r·min-1的磁力搅拌条件下反应6h。

反应结束，反应液经冷却后，将反应液置于透析袋中（MWCO 3500 Da，Spectrum Laboratories，Laguna Hills，CA）透析48h，以除去水溶性副产物，然后将透析液冷冻干燥。

通过控制反应物的分子量及投料比，制备各种不同壳寡糖分子量和聚乳酸分子量的的壳寡糖-聚乳酸嫁接物，备用。

1.3.4嫁接物胶团的制备取10mg嫁接物精密称定，溶解于5ml蒸馏水，探头超声20次（400w，工作2s停3s），用蒸馏水定容至10ml，得到1mg·ml-1的胶团溶液。

1.3.5嫁接物胶团的理化性质评价1.3.5.1嫁接物胶团粒径与表面电位测定制备嫁接物浓度为1mg·ml-1的嫁接物胶团溶液（方法同2.4），以微粒粒度与表面电位测定仪分别测定嫁接物胶团的粒径与表面电位。

1.3.5.2 嫁接物胶团对阿霉素的增溶能力的考察分别配制浓度为1 mg·ml-1的嫁接物胶团溶液20ml置释放管中，加入5mg左右的药物，在37℃、振荡频率为60 r·min-1条件下进行。

分别在1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、72h 取样。

离心除去未增溶的药物（10000 r·min-1，10 min），取上清液0.2ml，加入0.8ml甲醇，以甲醇：水=4：1（v：v）溶液稀释至适当浓度测定其荧光强度，测定嫁接物胶团的增溶能力。

1.3.6阿霉素载药胶团的制备取阿霉素5mg溶于10mlDMSO中。

取10mg 嫁接物，精密称定，加入10ml蒸馏水，探头超声20次（400W，工作2s停3s），用蒸馏水定容至10ml，得1 mg·ml-1的嫁接物胶团溶液。

移取嫁接物胶团溶液5ml，加入5ml阿霉素DMSO溶液，置于透析袋（MWCO 3500 Da，Spectrum Laboratories，Laguna Hills，CA）中，外相为1L纯水，在磁力搅拌条件下透析6h。

离心除去未增溶的药物（4000 r·min-1，10 min），得到嫁接物载药胶团溶液。

1.3.7嫁接物载药胶团粒径与表面电位测定取嫁接物载药胶团溶液适量，以微粒粒度与表面电位测定仪分别测定嫁接物载药胶团的粒径与表面电位。

1.3.8嫁接物载药胶团的药物包封率、载药量。

1.3.8.1 阿霉素的含量测定采用荧光分光光度法测定阿霉素的含量。

采用逐步稀释法制备药物在纯水、甲醇：水=4：1（v：v）和pH=7.4的PBS 三种溶剂中的标准曲线。

激发波长为471 nm，发射波长为558 nm。

激发狭宽和发射狭宽设置为5 nm。

1.3.8.2嫁接物载药胶团的药物包封率、载药量测定采用超滤离心法考察嫁接物载药胶团的药物包封率。

取0.5mg·ml-1的载药胶团溶液0.2ml，加入0.8ml 甲醇，破坏胶团后，以甲醇：水=4：1（v：v）溶液稀释至适当浓度，用荧光分光光度法测定药物总浓度（Co）。

另移取载药胶团溶液0.2 ml，置0.4 ml超滤离心管中（Microcon YM-10，MWCO 10，000，Millipore Co.，USA），10，000 r·min-1的速度离心10min，以纯水稀释至适当浓度，用荧光分光光度法测定滤液中游离药物浓度（C）。

按（2.1）式和（2.2）式分别计算药物包封率和载药量。

药物浓度Co和C的单位为μg·ml-1。

包封率（%）=（Co-C）/ Co ×100% （2.1）载药量（%）=（Co-C）/（500+Co-C）×100% （2.2）2 结果2.1壳聚糖的水解本研究采用纤维素酶对壳聚糖进行降解制备得到的壳寡糖的重均分子量分别为8000、14000、20000 Da。

2.2壳寡糖-聚乳酸嫁接物的制备本研究通过使用不同分子量的壳寡糖（重均分子量8000、14000、20000Da）与不同分子量的聚乳酸（分子量为5000，10000），以壳寡糖上的氨基与聚乳酸的羧基之间的偶合反应，制备了投料比不同的不同壳寡糖分子量和聚乳酸的壳寡糖-聚乳酸嫁接物。

反应物的分子量，产量和产率及溶解性见表1。

2.3 壳寡糖-聚乳酸嫁接物胶团的理化性质2.3.1嫁接物胶团粒径与表面电位测定由2.2，选择水溶性好的四种嫁接物。

取10 mg CSO-PLA嫁接物，精密称定，溶解于5ml蒸馏水，探头超声20次（400W，工作2s停3s），定容至10ml，得到1 mg·ml-1的胶团溶液。

2.3.2嫁接物胶团对阿霉素碱基的增溶能力的考察阿霉素碱基在PBS中的溶解度约为3μg·ml-1。

为考察壳寡糖-聚乳酸嫁接物的药物负载能力，本研究采用共孵育法测定了药物在CSO（14000）-PLA（10000）嫁接物中的溶解度。

其结果为36.6μg·ml-1，为在PBS中溶解度的12倍。

2.4 CSO-PLA载药胶团的粒径与表面电位本研究采用0.5mg·ml-1的嫁接物胶团溶度，进行阿霉素碱基的载药实验。

以嫁接物胶团的粒径与表面电位以及嫁接物载药胶团的粒径与表面电位结果见表2。

2.5 CSO-PLA载药胶团的药物包封率以及体外释放2.5.1 阿霉素的含量测定本实验采用荧光分光光度法测定阿霉素的浓度，将荧光强度I与阿霉素的浓度C（ng·ml-1）进行回归，采用逐步稀释法得到药物在纯水、甲醇：水=4：1（v：v）和pH=7.4的PBS中荧光强度I对阿霉素的浓度C 的标准曲线，三条标准曲线分别为Y=0.3307X+0.2749，R2=0.9996（阿霉素范围10～5000 ng·ml-1）、Y=0.5138X+34.506，R2=0.9993（阿霉素范围10～5000 ng·ml-1）和Y=0.0.3722X+10.779，R2=0.9996（阿霉素范围10～1000 ng·ml-1）有很好的线性相关性。