放射免疫分析法

放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法。

于1960年由美国学者Yalow和Berson创立，并首先用于糖尿病患者血浆胰岛素含量的测定。

这是医学和生物学领域中方法学的一项重大突破，开辟了医学检测史上的一个新纪元。

它使得那些原先认为是无法测定的极微量而又具有重要生物学意义的物质得以精确定量，从而为进一步揭开生命奥秘打开了一条新的道路，使人们有可能在分子水平上重新认识某些生命现象的生化生理基础。

此后30年，内分泌学科的飞速进展充分证明了这一超微量分析技术的巨大推动力。

1977年，这项技术的发明者荣获诺贝尔生物医学奖。

随后这一崭新的技术迅速渗透到医学科学的其他领域，如病毒学、药理学、血液学、免疫学、法医学、肿瘤学等，以及与医学生物学相关的学科，如农业科学、生态学及环境科学等。

放射免疫分析的物质，由激素扩大到几乎一切生物活性物质。

我国放射免疫分析研究起步于1962年，并迅速发展与普及，对我国生物医学的进展起了很大的促进作用。

放射免疫分析由于敏感度高、特异性强、精密度高、并可测定小分子量和大分子量物质，所以在检验医学中应用极为广泛，常用于测定各种激素（如甲状腺激素、性激素、胰岛素等）、微量蛋白质、肿瘤标志物（如AFP、CEA、CA—125、CA—199等）和药物（如苯巴比妥、氯丙嗪、庆大霉素等）等。

各种检测项目均有试剂盒供应，而且仪器设备并不昂贵，所以在国内被广泛采用。

但由于核素的放射性对人体有一定的危害性，必须加以防护，核素实验室的建设须经防疫部门的监督，操作人员须经过特殊训练。

另外，由于核素有半衰期，试剂盒的货存期较短，因而放射免疫分析在应用中有诸多不便之处。

特别是近年来其他标记免疫分析技术如酶免疫分析、发光免疫分析等在技术上有飞跃的进展，高级仪器的自动化程度已可与生化自动分析仪相媲美，因此从长远前景看，放射免疫分析有被取代的趋势。

但在目前，从所需的设备和检测的费用上，放射免疫分析还有一定的优越性，还将在一定时期内被医学检验实验室所采用。

一、放射免疫分析的基本试剂（一）标准品标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准品的量用来表示被涮物质的量，故标准品与被测物质应当化学结构一致并具有相同免疫活性。

标准品作为定量的基准。

应要求高度纯化。

标准品除含量应具有准确性外，还应具备稳定性，即在合理的贮存条件下保持原来的特性。

按实验要求，将标准品用缓冲液配成含不同剂量的标准溶液，用于制作标准曲线。

（二）标记物标记抗原应具备：①比放射性高，以保证方法的灵敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较长时间使用，这对来之不易的抗原尤其重要；④标记简便、易防护。

要准确测量B与F的放射性，必须有足够的放射性强度。

所选用的标记抗原的量，在使用125I时达5000～15000cpm。

（三）抗体应选择特异性高、亲和力强及滴度好的抗体，用于放射免疫测定。

根据稀释曲线，选择适当的稀释度，一般以结合率为50%作为抗血清的稀释度。

（四）B与F分离剂以2%加膜活性炭溶液为例，2%加膜活性炭溶液的配制：活性炭2g（杭州木材厂生产，森工牌732型）右旋糖酐T200.2g加0.1mol/L PB 至100ml电磁搅拌1h，然后置于变通冰箱冰箱待用。

（五）缓冲液放射免疫分析技术所用的缓冲液有多种，要通过实验选用抗体和抗原结合最高的缓冲液。

目前最常用的缓冲液有下列几种：①磷酸盐缓冲液；②醋酸盐缓冲液；③巴比妥缓冲液；④Tris –HCl缓冲液；⑤硼酸缓冲淮。

其中以磷酸盐缓冲液应用最多。

在缓冲液中，除必须有弱酸及弱酸的盐成分外，还应根据不同检测项目加入下列物质：（１）保护蛋白：常用的有牛血清白蛋白或白明胶，浓度为0.1%～0.2%，用以降低试管对抗原的非特异性吸附。

（２）防腐剂：多采用0.1%叠氮钠、0.01%柳硫汞、溶菌酶或抗菌素。

（３）酶抑制剂：如测定心钠素等肽类激素时，要加入适量的抑肽酶，用以抑制血浆内源性水解酶对待测物的降解；又如测定cAMP、cGMP时，需加入EDTA·2Na，抑制磷酸二酯酶的活性。

（４）阻断剂：在测定甲状腺激素或测定某些甾体激素时，必须加阻断剂，使和蛋白质相结合的激素，变为游离型。

常用的阻断剂有8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水杨酸钠、三氯醋酸钠等。

（５）载体蛋白：采用二抗作B与F分离剂时，要向反应液中加入适量与第一抗体同种动物的正常血清。

在测定不含有血浆蛋白的样品时，用PEG沉淀剂分离B、F，必须加适量γ球蛋白或正常人混合血清。

在神经肽的RIA时，常用PELH缓冲液，（按1000ml,pH7.6）：0．1mol/l PB980.0ml0.3mol/L EDTA·2Na10.0ml0.2%洗必泰溶液10.0ml溶菌酶 1.0g二、加样程序由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同，而出现两种加样程序，分述如下：（一）平衡饱和加样程序1、基本原理所谓平衡饱和，是指抗原和抗体反应达到再不结合，也不解离的平衡状态，称为饱和状态，即平衡饱和。

所以，有人称此为饱和分析法。

这意味着抗原或被测抗原、标记抗原、抗体三者一起温育。

2、加样程序一般先加标准物或被测样品，再加抗血清，最后加标记物。

这样的顺序是让标准物或被测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制能力。

在小分子半抗原的放射免疫分析中，标记抗原和未标记抗原与抗体结合的亲合力常常是不相同的，前者比后者的亲合力高。

因此，上述加样程序就更有必要，所以一般都采用先加标准物或样品和抗血清，后加标记物。

这样测定也比较稳定。

在大分子蛋白质抗原的放射免疫分析中，如果是双抗体分离法，抗原和标记抗原与抗体三者加样，可不分先后，有的是标准物、标记物、抗血清的加样顺序，但一般习惯还是标准物或血样、抗血清、标记物、然后混匀温育24～48h，再加双抗体，继续温育24h，使免疫反应达到平衡。

对一些多肽激素的放射免疫分析，应用双抗体分离法，其流程比较长，这样的顺序同样可不分先后。

以大鼠垂体、下丘脑β-内啡肽RIA测定程序为例：（１）加样（单位μl；总反应体积500μl）标准曲线样品TNSBBo5Pg10Pg50Pg100Pg500Pg1ng垂体下丘脑管号1234567891011β-EP标准液///100100100100100100//样品/////////1100β-EP抗血清//100100100100100100100100100125-β-EP溶液100100100100100100100100100100100缓冲液/400300200200200200200200299200（２）孵育：4℃，24h（３）分离B与F：每管加入2%加膜活性炭溶液300μl，摇匀，立即离心，去上清，测沉淀（F）的CPM数。

（二）顺序饱和加样程序1、基本原理先将标准物或血样品与抗血清混匀，免疫反应6～24h，使抗原与抗体充分结合，甚至达到平衡，然后再加入标记抗原，与抗体反应12～24h，最后分离B与F，这称为顺序饱和分析法。

应用顺序饱和加样，可以提高测定方法的灵敏度。

Utiger在做人促甲状腺激素（TSH）放射免疫分析时，将标记物延至第2天加入，发现其灵敏度增加两倍。

如果缩短最后的温育时间，仍可取得满意的结果。

所以一般认为，在顺序饱和加样中，第1次温育时间可以长，而第2次温育时间要短，这样可以提高灵敏度。

但也有相反的意见，认为顺序饱和加样，是使用过量抗体，会使灵敏度受到一定影响。

如果使用抗体不过量，温育时间缩短，在抗原和抗体结合未达到平衡饱和时就加入标记物，这样既不影响加灵敏度，反而比较稳定，甚至可提高灵敏度。

2、加样程序以人血浆精氨酸加压素RIA测定程序为例（直接测定）。

（１）加样（单位μl；总反应体积600μl）标准曲线血浆T NSB Bo1Pg5Pg10Pg50Pg100Pg500Pg管号12345678910A VP标准液///100100100100100100/样品/////////300无肽血浆/300300300300300300300300/A VP抗血清//100100100100100100100100缓冲液/200100//////100在4。

C下孵育12～24h125I-A VP100100100100100100100100100100（２）孵育：4℃，24h。

（３）分离B与F。

无肽血浆，用于血浆的直接测定。

其制备方法为：在电磁搅拌下，抽取2%加膜活性炭溶液5ml，共两管，离心、去上清。

血浆5ml，倒入上述活性炭管中，加盖，充分振荡10min，离心，上清倒入上述另一活性炭管中，振荡10min，再离心，取上清，即无肽血浆。

血浆中的生物活性物质被活性炭吸附而去除。

（三）计数、绘制标准曲线与测定样品含量以活性炭分离B与F，沉淀计数是F的cpm。

T—F—NSB，得B的cpm数。

计算标准管与样品管结合（B）的cpm数及与零标准管结合（B0）的比（B/B0×100%）。

用半对数纸，以标准管的B/B0为纵座标，以各标准管含量为横座标，绘制标准曲线。

根据样品的结合率（B/B0×100%），从标准曲线中找出被测样品抗原的含量，再换算成每毫升血浆含某抗原的量，或每毫克（组织湿重）含某抗原的量。

三、放射免疫分析的质量控制（一）质量控制的目的和内容放射免疫分析的质量控制实际上就是控制测定误差，监督测定结果。

它包括两方面的内容：一方面对测定结果做精确分析；另一方面鉴定常规测定方法，对那些测定结果不好的方法加以改进，并建立新的测定方法。

质量控制分四个方面：1、在一个测定方法内产生的误差。

2、在同一实验室内不同方法之间产生的误差。

3、用同一测定方法，在各实验室之间产生的误差。

4、采用不同方法，在各实验室之间产生的误差。

后两种情况属于外部质量控制。

（二）放射免疫分析中造成测量误差的因素误差包括系统误差和随机误差。

系统误差发生在测量过程中由于仪器不准、试剂不纯、标准品不稳定等原因，使测定结果呈倾向性偏大或偏小，这种误差应力求避免。

随机误差是测量过程中各种偶然因素造成的，没有固定的倾向性，这类误差是不可避免的，必要时做统计学处理。

造成误差的可能来源有以下几个方面：1、各种仪器：设备的准确性、稳定性、效率以及被污染等情况带来的误差。

如：①由于放射性测量仪器的稳定性、效率、样品试管的材料和均匀性及被测物的放射性强度等原因。

②由于样品的自吸收，本底校正，测定时间，可能的污染等原因。

③在试验室中所有的移液管、微量取样器以及天平的刻度、校准和使用方法等原因。

④由于反应试管、移液管以及测定用试管等表面清洁度和所引起的不同吸附等原因都可以对测定结果带来误差。

2、试剂的纯度、质量和稳定性的影响也是造成误差的重要因素。