斑马鱼胚胎整体原位杂交_6.22
鱼藤素对斑马鱼胚胎中细胞周期蛋白D1基因下调的作用：整胚原位杂交检测
海 洋 ，女 ，１ ９ ９ １ 年 生 ，山 西 省运 城 市人 ，汉 族 ，硕 士 ，主要 从 事 肿瘤 药 物作 用 机制 研 究。
斑 马鱼 ：鱼藤 羁 ；缅 跑两 期
基 金资助 ：
广 东省 自然科 学基金 Ｉ 摘 要
３ ｏ ２ Ｑ 叭４ ８ ６ ．课 题 名称 ：零 ｊ ｝ 角 斑 马鱼模 型研 究鱼鼹 素 的抗聃 瘤 作甬 靶 点
通讯作者：昊新荣，博士， 主任药师，博士生导师 ， 华南理工大学轻工与食品 学院，广 东省广州市 ５ １ ０ ６ ４ １ ；解放 军 广州军 区 广 州总 医院 药剂 科 ，广 东
省 广州 市 ５ １ ０ ０ １ ０
背 景 ： 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 早 期 ， 细 胞 分 裂 增 殖 快 速， 低 浓 度 的 鱼 藤 素 可以 延 缓 斑 马 鱼 胚 胎 发 育。
Ｄｅ ｇｕ ｅ ｌ ｉ ｎ ｄ ｏ ｗｎ － ｒ ｅ ｇ ｕ ｌ ａ ｔ ｅ ｓ ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｃ ｙ ｃ ｌ ｉ ｎ Ｄ１ ｇ ｅ ｎ ｅ ｉ ｎ ｚ ｅ ｂｒ ａ ｆ ｉ ｓ ｈ ｅ ｍｂ ｒ ｏ ｙ ｓ
ｔ ｈ ｒ ｏ ｕ ｇｈ ｔ ｈ ｅ ｗｈ ｏ ｌ ｅ ｍ ｏｕ ｎ ｔ／ ｎ ｓ ｉ ｔ ｕ ｈ ｙ ｂ ｒ ｉ ｄｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏｎ
鱼藤素对斑马鱼胚胎中细胞周期蛋白Ｄ １ 基因下调的 作用： 整胚原位杂交检测
海 洋’ ， 吴新荣’ ， （ ’ 华南理工大学轻工与食品学院，广东省广州 Ｉ 市 ５ １ ０ ６ ４ １ ； 解放军广州军区广州总医院药剂科 ，广东省广州市 ５ １ ０ ０ １ ０ ）
文 章 亮点 ： 斑马鱼胚胎发育早期，细胞分裂增殖迅速，有着与肿瘤细胞相似的特征。实验利用斑马鱼整体胚胎原位杂交 这 一技 术 ，研 究鱼藤 素对 ｃ ｙ ｃ ｌ ｉ ｎ Ｄ１ 基 因 的调控 表 达 ，从 而探 究鱼 藤 素调节 细 胞周 期信 号通 路 的相关 抗肿 瘤机 制 。实验 验证 了鱼 藤素 对 ｃ ｙ ｃ ｌ ｉ ｎ Ｄ １基 因的表 达下 调作 用 。 关键 词 ： 组织 构建 ：组 织Ｉ程 整 胚 啄位 杂 交 ：鱼藤 素；斑 马鱼 ：细跑 两期 蛋 白 Ｄ１ ：细 跑周 期 ：广 东雀 自然 科 学基金
2021正向遗传筛选斑马鱼肝脏、肠和胆囊发育缺陷突变体范文1
2021正向遗传筛选斑马鱼肝脏、肠和胆囊发育缺陷突变体范文 肝脏、胆囊、肠等是重要的消化器官，在食物消化、贮存、营养吸收、排泄和内分泌等方面都有着重要的作用[1].斑马鱼是常用的脊椎模式动物，它的消化器官组成结构和发育分子机制类似于哺乳动物[2].斑马鱼具有体外发育、胚胎透明、胚胎发育周期短、产卵量大等优点，突显其在遗传学研究上的优势，也使得斑马鱼成为目前唯一适合于大规模遗传筛选的脊椎模式动物[3].构建斑马鱼消化器官发育缺陷突变体有助于研究消化器官发育的分子机制，并可能用于人类相关先天性疾病的研究。
本课题通过在斑马鱼中进行无基因差别的正向遗传筛选，获得不同消化器官发育缺陷的突变体，为后续消化器官发育分子机制的研究奠定基础。
1材料与方法 1.1 材料 1. 1. 1 实验动物1突变体遗传诱变及传代。
1.1. 2 实验试剂多聚甲醛、氯化钾、磷酸氢二钠、氯化钠、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、氯化镁、柠檬酸、去离子甲酰胺（上海生工生物工程股份有限公司） ; PTU （ 1-phenyl-2-thiourea ）、 ENU （ N-ethyl-N-nitrosourea ）、 Tris（ pH 9. 5）、蛋白酶 K、BSA、NBT（ nitrotetrazolium bluechloride ）、BCIP （ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phos-phate）、肝素、tRNA（ Sigma） ; BES-H2O2-Ac 过氧化氢荧光染料（日本和光纯药工业株式会社） . 1.1. 3 实验器材斑马鱼养殖系统（北京爱生科技发展有限公司） ; 荧光体视显微镜（ Zeiss SteREO DiscoveryV20 ） ; 全自动荧光正置显微镜（ Zeiss AxiolmageZ2） ; 移液器（ Gilson 10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 mL） ; 恒温培养箱（ MemmentINE800） ; 盘旋混合仪（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司 KB-3-D） ;分子杂交箱（ UVP HL-2000 hybrilinker hybridizationOven / UV cross linker） ; pH 计及精密电子天平（ Mett-ler Toledo） ; 圆周式摇床（ GFL 3005 型） ; 24 孔细胞培养皿（ Costar） .1.2 方法 1.2. 1 胚胎收集及处理斑马鱼交配产生的受精卵收集于 0. 03% 的海盐水中，并于28℃恒温箱饲养。
(标准)斑马鱼胚胎原位杂交material&protocol
公司产品；
１ 显微注射用针，由Ｄｕｍｎ 公司 １ 毛细玻璃管拉制而成； ３ ． ｒｍｏｄ ０ 川
１． ４拉针仪 （ＥＡ Ｐ ） ＨＫ Ｐ ５ ，日本 ＨＫ 公 司产 品； Ｉ ＥＡ １． ５荧光解剖镜 （Ｘ－２ ，日本 ＯＹＰＳ ＳＺ １） ＬＭＵ 公司产 品； １． ６数码相机 （９５ ， 本 ＮＫＮ Ｅ９ ） Ｆ Ｉ ＩＯ 公司产品 ； 主要试剂、试剂盒 、酶 、载体和菌株
１ ．各种限制性内 切酶、 ４ＤＡ Ｔ－Ｎ 连接酶、 ｌ ｏ 片段均为Ｎｗ ｇａｄ ｌｂ 公司 Ｋｅ ｗ ｎ ｅ Ｅ ｌｎ Ｂｏａｓ ｎ ｉ
产 品；
２ ＰＲ 应试剂， ． 反 Ｃ 包括： ａ 酶、 应缓冲液、 ＮＰ Ｔｑ 反 ｄＴ 等均购 自 上海申 能博 彩生物公司： ３ 位杂交试剂：Ｓ６ ．原 Ｐ ＲＡ聚合 （ ５ 反应缓冲液和 ｌ ｍ Ｄ Ｎ 酶含 ｘ ０ Ｍ ０ Ｔ Ｔ溶液） Ｔ Ｒ 、 ７ Ｎ Ａ
Ｓ Ａ Ｔ ｇｎｃ ｏｄ 部分序列 ５ Ａ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｔ３ Ｍ Ｒ Ｏｉ ｕｌｔｅ ｌｏ ｅ ｉ ＇ Ａ Ｃ Ｇ Ｇ ＴＴ Ａ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ －’ － 作为５ ＇ 端
Ｐ Ｒ引物 ，进行 Ｐ Ｒ扩增 ｃ Ｎ Ｃ Ｃ Ｄ Ａ． Ｐ Ｒ反应 体系： Ｃ Ｆｒ－ｔｎ ｃ Ａ ｄ Ｎ ｉｔ ｒ ｓ Ｓａ Ｄ １１ ４ １Ｘ Ｒ ｅ ｂｆ ｒ ０ Ｃ ｕ Ｐ ５１ ４ ５ Ｘ Ｔ Ｍｉ Ｐ ｘ ０ Ｎ ｄ １１ ４
斑马鱼平滑肌特异性基 因 Ｓ ２ 的克隆 、表达和功能研究 Ｍ２ ａ
Ｌｎ，９７０ ｏｇ １９） Ｐ Ｒ产物克隆到 Ｔ ｅａ ｖ ｃｏ Ｃ － ｓｙ ｔｒ上，通过连接 、转化 、小量抽提 、限制性 内切酶 ｅ 酶切、电泳 鉴定出正确克 隆，具体步骤参考 《 子克 隆实验 指南 （ 分 第三版 ） ，并通 过测序 验证 其正确性 。大量抽提 Ｇ Ｔ －ｃ Ｎ Ｔ质粒 ，分 别采 用 限制性 内切 酶 Ｓｌ ＡＡ １ Ａ－ Ｄ ａ ｌ
p21基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达
p21基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达宋锦;姬牧远;吴西军;周艳华;舒莉萍;何志旭【摘要】目的：探究p21基因在斑马鱼早期发育过程中的表达。
方法：Trizol法提取野生型斑马鱼胚胎总RNA，RT-PCR法扩增p21基因片段，与pCS2﹢载体重组构建p21-pCS2﹢重组质粒，以T3 RNA 聚合酶制备地高辛标记的反义mRNA 探针，通过斑马鱼全胚胎原位杂交检测p21基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达。
结果：成功构建了p21-pCS2﹢重组质粒，并制备反义mRNA 探针；原位杂交结果显示野生型斑马鱼0.5~18 hpf的胚胎均未发现p21基因阳性杂交信号，24~36 hpf 胚胎可在脊索部位观察到阳性信号，48~72 hpf 胚胎可在头部胸腺附近观察到阳性信号，表达量均较低。
结论：成功制备了p21-pCS2﹢重组质粒及斑马鱼p21基因反义mRNA 探针，p21基因在野生型斑马鱼胚胎不同发育时相中表达水平不同。
%Objective:To explore the expression of p21 in zebrafish. Methods:Extract 0. 75 hpf~120 hpf wild-type Zebrafish embryos in multiple phase and total RNA by Trizol,amplificating p21 gene by RT-PCR,and constructing p21-pCS2﹢plasmid. Preparing antisense mRNA probe with T3 RNA pol-ymerase,using zebrafish whole-mount in situ hybridization to examine the p21 expression pattern in early embryo development. Results:Successfully constructed p21-pCS2﹢plasmid,preparing antisense mRNA probe;within situ hybridization,there is no expression of p21 in wild-type zebrafish at 0. 5 hpf~18 hpf;positive signal in notochord was found in 24 hpf~36 hpf of the wild-type Zebrafish embry-os,and positive signal could be found near head and thymus,but indicating low expression. Conclu-sion:In this research,it has beensuccessfully constructed p21-pCS2﹢ plasmid,antisense mRNA probe preparation,and have a preliminary observation in the expression of p21 gene in Zebrafish em-bryos in different periods.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2016(041)007【总页数】5页(P765-769)【关键词】p21;斑马鱼;胚胎;发育;探针;质粒【作者】宋锦;姬牧远;吴西军;周艳华;舒莉萍;何志旭【作者单位】贵州医科大学免疫学教研室，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学干细胞与组织工程实验中心，贵州贵阳 550004;贵州医科大学干细胞与组织工程实验中心，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学附院儿科学教研室，贵州贵阳 550004;贵州医科大学干细胞与组织工程实验中心，贵州贵阳 550004;贵州医科大学干细胞与组织工程实验中心，贵州贵阳 550004;贵州医科大学免疫学教研室，贵州贵阳550004; 贵州医科大学干细胞与组织工程实验中心，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学实验动物中心，贵州贵阳 550004;贵州医科大学免疫学教研室，贵州贵阳550004; 贵州医科大学干细胞与组织工程实验中心，贵州贵阳 550004; 贵州医科大学附院儿科学教研室，贵州贵阳 550004【正文语种】中文【中图分类】R394.3p21 基因表达产物是细胞周期的一种抑制因子，是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子CKI 中细胞因子诱导的蛋白/激酶相互作用蛋白Cip/Kip (cytokine-inducibleprotein/kinase inhibition protein,Cip/Kip) 家族的一员。
斑马鱼原位杂交实验方案
斑马鱼全胚胎原位杂交技术Form Dr. Kevin第一节原位杂交技术的历史Joseph G. Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡献，并发明了原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）。
自Gall同他的研究生Mary Lou Paudue和Susan Gerbi在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生物学的巨大进步。
Kathleen H. Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。
ISH技术在斑马鱼中的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。
同年, Nusslein-Volhard 等将Cox 建立的RNA 原位杂交技术进行了改进, 用地高辛（digoxin）标记的RNA 在斑马鱼胚胎中检测基因表达。
2008 年, Bernard Thisse 等将该技术进一步优化, 使之更敏感, 也提高了基因表达检测的分辨率，我们在这里介绍的整胚原位杂交技术主要参照Thisse实验室2008年版本（Thisse, C. and Thisse, B., 2008, High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3 : 59 –69）。
第二节原位杂交技术的原理原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
斑马鱼的原位杂交技术
斑马鱼的原位杂交技术整理人邵明:将特定时期的斑马鱼胚胎在多聚甲醛中C4%4o固定过夜第一天：、洗1PBST2x5min、剥膜2、洗3PBST5min可选步骤蛋白酶处理前的胚胎不处理(: K: 24hpf, 24hpf-的胚胎蛋白酶处理分钟以后的胚胎处理半小时48hpf10ug/ml K15, 48hpf,然后洗PBST3x5min)、C5min4hyb- 65o孵育、C4h（可选步骤: 可将胚胎置于hyb+中-20oC长期储存）5hyb+ 65o孵育、加探针(探针孵育置于冰上65oC10min, 5min, 655oC-孵育过夜65oC先将然后使用).第二天：、回收探针, I2x30min1（探针可以重复使用10次以上）洗液孵育探针的温度、洗液孵育探针的温度2II 1x15min、洗液孵育探针的温度3III 2x30min、室温4MABT 3x5min、封闭液孵育室温5 4h、AP, 4oC (-20oC, 61:2500 Anti DIG-稀释于封闭液中孵育过夜稀释好的抗体保存于可重复使用3次以上。
)第三天、回收抗体1、2MABT 2x30min3、PBST 2x30min、平衡缓冲液左旋咪唑4+0.5mg/ml （60mg/ml左旋咪唑储液稀释120倍）孵育10min、显色液中孵育直到信号足够强为止。
5试剂配方固定液: 4% 多聚甲醛（paraformaldehyde）in 1XPBSWeigh 2 g PFA and dissolve it in 50 ml 1XPBS. (PFA is hard to dissolve.) Incubate the mixture at 65oC for around 2 hours. Shake the mixture during the incubation). After dissolved, the solution is stored at 4oC.10XPBS stock solution: mix 76 g NaCl, 9.9 g Na2HPO4, 3.6g NaH2PO4. Dissolve them in less than 1 liter nanopure water, adjust to pH7.0 and a final volume of 1 liter. Autoclave for 35 minutes to sterilize.130 mM NaCl = 10 X 0.13 X 58.44=76 g NaCl7 mM Na2HPO4 = 10 X 0.007 X 142 = 9.9 g Na2HPO43 mM NaH2PO4 = 10 X 0.003 X 120 = 3.6 g NaH2PO4Paraformaldehyde (PFA) (Mallinckrodt 2621).（注意所用的试剂有没有结晶水）Proteinase K (Sigma P-2308); Stock solution (10 mg/ml = 10 ug/ul): weigh 10 mg proteinase K and dissolve in 1 ml nanopure water. Aliquot 50 ul each and store at -20oC. Thaw at room temperature before usage. Long storage may appear to see white precipitate after thawing. V ortex the tube and make sure the precipitate be mixed evenly.20XSSCFor 1 liter: 1 X 3 mol = 3 X 58.44 =175.3 g NaCl1X 0.3 mol = 0.3 X 294.1 = 88.2 g Na3.Citrate.2H20adjust pH=7 using HCl. autoclave 35 minutes for sterilizeization.（注意所用的试剂有没有结晶水）Yeast RNA: dissolve 50 mg RNA in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oC肝素（Heparin） (Sigma H3393): dissolve 50 mg heparin in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oCMAB X 2 liters pH7.5100 mM Maleic acid (Sigma M-0375) = 23.2 g (2 X 0.1 X116.1)150 mM NaCl = 17.5g (2 X 0.15 X 58.44)add solid (? g) to adjust pH=7.5, autoclave for 35 minutes to sterlize.Blocking regent (1096 176, Boehringer Mannheim, now Roche?). 10% stock solution. Weigh 10 g blocking regent and dissolve it in 100 ml MAB, shaking and heating in a microwave oven for 1 minutes (?), autoclave for 25 minutes and then aliquot into 14 ml and store at -20oC.50mg/ml 酵母RNA：称取2g酵母RNA干粉（生工），加入40ml去离子水，超声振荡溶解，-20oC保存。
斑马鱼相关实验操作
斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育一、实验目的了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。
二、斑马鱼的生活和繁殖习性斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。
在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。
斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。
最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。
为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。
斑马鱼具有下列特点：1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。
2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。
3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。
4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。
5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。
6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本结构。
因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。
三、实验器材和材料斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。
曝气水10L。
性成熟雌、雄性斑马鱼。
四、实验内容和程序实验前一天的准备：1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28℃（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。
2、曝气水将干净的自来水烧开后冷却，将气泵放入其中进行曝气，以为培养胚胎之用。
3、斑马鱼的选取和催产雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较小，而雌鱼腹部较大。
选鱼的时间在实验前一天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂食红虫，喂食后1小时才开始选鱼。
Le 斑马鱼nanos1基因在配子发生中的原位杂交研究
遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!"!#"#$%&!$&#$!’’$研究报告收稿日期!!’’#(((’"修回日期!!’’$’(!’基金项目!国家%)*计划!国家高技术研究发展计划项目"!编号#!’’(++!!!’"("和国家自然科学基金项目!编号#*’!"’)"$"资助%,-../01234567892:2;<18/9<=>0/?0<@:A /0B 8?7C 2D 79/=/?5E 2:2<0D 7<93F 2G 2=/.@291!;/H !’’(++!!!’"("$;<18/9<=;<1-0<=,D 829D 2I /-93<18/9/A 6789<!;/H *’!"’)"$"&作者简介!陈云贵!(&""’"$男$硕士研究生$研究方向#鱼类分子遗传学通讯作者!宋!平$J K @<8=#.89?:/9?.:"5<7//H D /@H D 9!"斑马鱼#$#%&’基因在配子发生中的原位杂交研究陈云贵(!宋!平(!吕道远(!周!伟(!桂建芳!!(H 武汉大学生命科学院发育生物学教育部重点实验室$武汉#*’’"!(!H中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室$武汉#*’’"!"摘!要!利用组织原位杂交技术$以地高辛标记的反义E ;+为探针$检测了斑马鱼!$/-+01*1+0"-/-02(基因在卵子发生及精子发生中的表达分布特点$初步探讨了该基因在斑马鱼配子发生中可能的功能)结果表明#在斑马鱼卵子发生中$-/-02(@E ;+均匀分布于卵原细胞和各时期卵母细胞的胞质中(在卵原细胞和#*$期卵母细胞中$-/-02(@E ;+的杂交信号十分强烈$而较晚期卵母细胞中信号明显减弱)在斑马鱼精子发生中$-/-02(@E ;+可在精原细胞和初级精母细胞中检测到)-/-02(@E ;+的阳性信号在精原细胞中极为强烈$在初级精母细胞中较为微弱$而精子细胞中没有阳性信号)结果初步表明$斑马鱼-/-02(基因对生殖干细胞K 卵原细胞和精原细胞的维持和正常功能可能起着重要作用)关键词!原位杂交(斑马鱼(-/-02((卵子发生(精子发生(生殖干细胞中图分类号!L &$*!!!文献标识码!+!!!文章编号!’!$*M &""!!!’’$"’#M ’$%&M 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6:"中的-/-02($-/-02!和-/-02*%"$%&$以及人类!!*E02/F+*-2"中的-/-02(%&&$并对其功能展开了广泛研究)果蝇的J/-02蛋白?G末端具有两个在进化上高度保守的锌指结构域$对于J/-02蛋白结合E;+活性及其功能是必需的%(’&)在果蝇中$因富集于受精卵末端的母源-/-02E;+翻译$产生一个从后到前逐渐降低的J/-02蛋白梯度%((!(*&)J/-02蛋白与K:E+6+0蛋白共同作用$抑制母源5:-45A/4L@E;+在胚胎后部的翻译$从而指导腹部发育%(#$($&)缺少-/-02基因仍可形成极细胞$但这些极细胞不能迁入胚胎性腺$不能分化为具有功能的生殖细胞%()$("&)在线虫与斑马鱼中$-/-02(基因同样不为原始生殖细胞!>O6:$.08@/038<=?20@D2==:"形成必需$但若缺少该基因的功能$>O6:也不能迁入胚胎性腺$过早地分化并死亡$说明-/-02(基因的功能在于指导>O6:正常迁移并且维持其生殖细胞命运%#$)&)在爪蟾中$H4/=K!E;+是生殖质组分$定位于成熟卵母细胞的植物极皮层$在卵子发生中不翻译)\D<1蛋白在体外能结合E;+$可能调控某些>O6:专一E;+的翻译%$$(%&)在小鼠中$-02(基因的合子在中枢神经系统中表达$不为正常发育所必需%"&)-02!基因敲除雄鼠精巢发育不良$精巢中完全缺失生殖细胞)-02*基因敲除小鼠>O6:的形成不受影响$但精*卵巢同样发育不良$完全缺失生殖细胞%%&)为了进一步探讨该基因在脊椎动物生殖细胞增殖和分化中的功能及其意义$本研究以斑马鱼的精巢和卵巢为材料$以F V O!地高辛"标记的-/-02基因的反义E;+为探针$通过组织切片原位杂交的方法$对该基因在斑马鱼卵子发生和精子发生过程中的表达及可能的功能进行了分析)(!材料和方法’@’!实验用鱼实验用斑马鱼购于武汉市武胜路花鸟虫鱼市场)’@A!重组质粒根据已发表的斑马鱼-/-02(基因的D F;+序列%)&$设计>6E引物$正向引物$]K O6CC C CC6C 6C C6C6K*]$反向引物$]K C6+66+C O CC O+C C C K *])以斑马鱼精巢D F;+为模板$扩增出一段#""4.的片段)将该片段克隆于.O J^K C载体!>0/K @2?<"中$作为合成E;+探针的模板)’@B!主要试剂与药品;C>,21$,>)+C"E;+./=5@20<:2均为^_V 公司产品)F V O K((K T C>和:722.<918K F V O K+>I<4 A0<?@291:为E/D72公司产品);_C+_6V>检测试剂盒为华美公司产品)’@C!实验方法(H#H(!质粒载体的转化!扩增与抽提按文献%(&&操作)(H#H!!质粒载体的酶切线性化在)’%Q的总反应体系中$带有目的基因核糖探针模板的重组质粒均为(%?)对于J2+#的酶切反应$含有#T J2+#!华美公司"(对于(F5#的酶切反应$含有#H$T(F5#!华美公司")酶切反应在*"‘保温#7后$异丙醇沉淀过夜)经"’a乙醇洗涤空气干燥后$溶于!’%Q F J>6K B!P$琼脂糖凝胶电泳检测其浓度)(H#H*!地高辛标记核糖探针的体外转录合成体外转录地高辛标记核糖探针按文献%!’&$并稍加修改进行)(H#H#!性腺组织切片的原位杂交!("冰冻切片的制备#在M!$‘$将性腺切片成(’!(!%@的切片$贴于载玻片上)!!"性腺组织切片的预杂交和原位杂交#在预杂交液!$’a甲酰胺的#b,,6"中*"‘预杂交($@89以上)滴加*’!#’%Q含$!(’9?探针的杂交液$盖上盖玻片)#!‘温盒杂交过夜)!*"杂交后漂洗#!b,,6和(b,,6各漂洗*次$每次(’@89)再用E;<:2+在*"‘消化未杂交E;+探针*’@89)再’H(b,,6漂洗#次$每次(’@89)!#"杂交信号的免疫检测!染色"#_-A A20 V!(’’@@/=+QC08:K B6=$.B"H$$($’@@/=+Q;<6="漂洗!次$每次(’@89)经抗体封闭液!_-A A20V c’H (a C081/9b K(’’c!a羊血清"浸泡*’@89)然后免!"#遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!’’$!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!疫结合#<918K F V O K+>按(d$’’稀释于稀释于封闭液中$滴加于切片上$湿盒中孵育!7)_-A A20V洗*次$每次(’@89)在_-A A20$!(’’@@/=+QC08:K B6=$ .B&H$$(’’@@/=+Q;<6=$$’@@/=+Q^?6=!"中浸泡(’@89)每片覆盖$’-Q显色液$湿盒中暗处显色’H$至#7)终止反应#用_-A A20&!(’@@/=+QC08:K B6=$.B%H’$(@@/=+QJ F C+"浸洗!次$每次$@89)最后系列乙醇’二甲苯脱水透明)中性树脂封片$显微镜检)!!实验结果A@’!斑马鱼卵子发生中#$#%&’9D E<的原位杂交检测结果斑马鱼-/-02(@E;+在卵原细胞和#*$*&*’期卵母细胞的胞质中均能检测到$但不存在于细胞核中!图($+")在卵原细胞和#*$期卵母细胞中$-/-02@E;+的杂交信号非常强烈$均匀地分布于整个胞质中!图($+*($F*($J")随着卵母细胞的生长发育及卵黄的积累$&*’期卵母细胞胞质中-/-02(@E;+的杂交信号明显减弱$但仍然是均匀地分布于整个胞质中!图($+*($J")A@A!斑马鱼精子发生中#$#%&’9D E<的原位杂交检测结果斑马鱼-/-02(@E;+的杂交信号可在精原细胞和初级精母细胞中检测到!图!+*!F")在精原细胞中$-/-02(@E;+的阳性信号极为强烈$初级精母细胞中信号较为微弱$而精子细胞中没有阳性信号!图!F")图’!斑马鱼#$#%&’基因在卵子发生中的原位杂交分析+#-/-02(基因反义链探针杂交结果(_#-/-02(基因反义链探针杂交结果(6#-/-02(E;+杂交信号在卵原细胞和#期卵母细胞中很强烈$均匀地分布于胞质中(F#-/-02(E;+杂交信号在&期卵母细胞中明显减弱(J#-/-02(基因正义链探针杂交结果(I#成熟卵巢B J染色P?#卵原细胞(#*$*&*’表示各时期卵母细胞(O e#生发泡)+#放大倍数为(’’(_*J*I#放大倍数为(’’(6*F#放大倍数为#’’) F27@’!6")"=)2%#%3;"51$32&-#$#%&’"/01"&&2%#+*12#7%%7"#"&2&5,2#&2)*-,512+2;$)2%# 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:12@D2=="的功能和存活而并非调控其形成%!$&)最近的研究发现$;<9/:蛋白在果蝇幼虫卵巢的>O6:及成虫卵巢中的生殖干细胞中高表达$在分裂增殖中的胞囊细胞也有表达(并证实$;<9/:蛋白在卵子发生中通过阻止生殖干细胞过早分化$来维持其干%"#遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!’’$!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!细胞自我更新的属性$而不为生殖干细胞之后的卵子发生事件所需%!)&)在斑马鱼中$母源-/-02(E;+也是生殖质组分$在早期胚胎中的表达模式与另一生殖质组分’’’</2/E;+一致$即在>O6:中特异表达)反义吗啡啉实验证明$斑马鱼>O6:的形成并不需要-/-02(基因$但它是>O6:正常迁移*存活及发育必需的%)&)在线虫和小鼠中的研究结果与之一致%#$%&)但至今未见对-/-02基因在鱼类配子发生中的表达和功能研究的报道)本研究结果显示$在斑马鱼卵子发生中$-/-02(@E;+在卵原细胞及#*$期卵母细胞中表达极高(在&*’期卵母细胞中也能检测到其存在(-/-02(@E;+在各时期卵母细胞中都是均匀分布的!图($_*6*F")-/-02( @E;+在卵原细胞中的高表达提示$-/-02(基因在斑马鱼卵巢中可能起着与其在果蝇中相同的作用$即维持生殖干细胞’卵原细胞的自我更新和正常功能)在爪蟾中$-/-02同源物H4/=G!E;+在#期卵母细胞中定位于线粒体云!@81/D7/9308<=D=/-3"%!"&)在卵子发生中$H4/=G!E;+连同生殖质一起迁移至成熟卵母细胞的植物极皮层%(%$!%&$但它在卵子发生中并不翻译%(%&$提示其对卵子发生可能并无直接作用$而是作为母源物质储存在卵母细胞中$在未来胚胎>O6:的发育中起着作用)斑马鱼-/-02(@E;+在#*$期卵母细胞中也有较高表达$较晚期的卵母细胞中也能检测到!图($6*F")斑马鱼卵母细胞中的-/-02(E;+可能同样仅仅作为母源物质$留作调控胚胎>O6:迁移与发育之用$而对卵原细胞之后的卵子发生可能并无调控作用)是否果真如此$还有待研究)精子发生也是一个典型的干细胞系统$-/-02基因在该过程中同样有着重要作用)在-02基因突变雄蝇精巢中$精子束极少甚至没有$在精巢前部积累了比野生型多得多的初级精母细胞$表明这类细胞的分化延迟或受阻(同时-02基因突变雄蝇大多表现出致育缺陷$说明-02基因突变雄蝇的精子发生确实受到影响%!$&)在小鼠中$-02!基因主要在雄性生殖细胞中表达$-02*基因在迁移中的>O6:中表达)-02!基因敲除雄鼠和-02*基因敲除雄鼠的精巢发育不良$重量只有野生型的(+*$#周龄精巢中完全没有生殖细胞%%&)在人类成体组织中$-02(基因只在精巢中表达(在成熟精巢中$ -02(基因在生殖干细胞’精原细胞中表达最高$减数分裂中的初级精母细胞中也有表达$但在减数分裂后的生殖细胞中不表达%&&)本研究结果表明$在斑马鱼精子发生中$-/-02(基因在精原细胞中表达极高$在初级精母细胞中表达较低$在次级精母细胞*精子细胞及精子中不表达!图!$+*F")据此推测$-/-02(基因不仅对于维持生殖干细胞’精原细胞的存活与功能有重要作用$并且在随后的减数分裂中也可能起着调控作用)总之$斑马鱼-/-02(基因在生殖干细胞’卵原细胞和精原细胞中有极为活跃的表达$表明该基因应该对于生殖干细胞的维持与功能有着重要作用)在斑马鱼中$-/-02(基因如何维持生殖干细胞并维持的自我更新与功能还有待继续研究)参考文献#D"3"1"#="&$!%(&!U<9?6$Q27@<99E H;<9/:8:172=/D<=8X23./:1208/032120@8K 9<9189F0/:/.78=<H?*66$(&&($))#)*"!)#"3%!&!>8=/9^$U28:4=<1F+H+9<9/:7/@/=/?89=22D7H$*<*60F G E*-=$(&&"$(!#$(""(!("%’3%*&!^/D78X-[8f$,<9/B$f/4<5<:78,$;8:78@85<K I-g8:<Y<$6$ I-g8:<Y<C H J Z.02::8/9<932G/=-18/9<05D/9:20G<18/9/A9<9/:K 02=<123?292:89B530<H$*<M*-*2"<06$!’’’$!(’$$&(!)’!3 %#&!,-40<@<98<@$f$,253/-ZO H9/:K(<939/:K!$1Y/?292:02=<1K 231/F0/:/.78=<9<9/:$02?-=<12.08@/038<=?20@D2==32G2=/.K @291<93:-0G8G<=89?/*-015/A D+=+2*6*./-23$*<*60F E*-=$ (&&&$(!)$#%)(!#%"(3%$&!Q-8:^/:h-20<$6<05=I/008:1<==$N8S7/-$^<05Q/-f89?H+ @E;+=/D<=8X231/172G2?21<=D/012Z/A H*-0F:2//D512:29K D/32:<.0/1289Y817<-/-02G=8[2X89D 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*-=/6)+060.>$!’’’$!("$!!(!!!&"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""3欢迎订阅%动物学杂志&!!,动物学杂志-是由中国科学院动物研究所*中国动物学会主办的科技期刊$亦是中国自然科学核心期刊)主要报道动物学领域的最新研究成果$介绍有创见的新思想*新学说*新技术*新方法)报道范围既有宏观生态研究$又有微观实验技术)报道层次既有科学前沿性*资料性的$也有技术性*知识性的)稿件内容涉及范围广$实用性强$主要栏目有#研究报告*珍稀濒危动物*技术与方法*研究简报和快讯*科技动态等等)读者对象为动物科学领域的研究*教学*技术*管理人员及广大业余爱好者)根据中国科技信息所信息研究中心!’’#年发表的数据$,动物学杂志-各项统计指标有了很大的提高$除了被国内各大数据库收录外$已分别被国外著名数据库英国,动物学记录-*美国,化学文摘-*俄罗斯,文摘杂志-收录),动物学杂志-双月刊$()开$((!页$每册定价!$元$全年($’元$国内外公开发行)国内邮发代号#!M #!!(国外发行代号!6/32;/H "#_^$%)全国各地邮局均可订阅)如未能在当地邮局订到$可与编辑部直接联系)本刊对在校学生及个人订户"折优惠!直接与编辑部联系订阅")地址#北京市北四环西路!$号,动物学杂志-编辑部!!邮编#(’’’%’(电话#!’(’")!$%(#"$(J K @<8=#g /-09<="8/X H <D H D 9)网址#4803H D 789<g /-09<=H 921H D 9)欢迎投稿*欢迎订阅*欢迎刊登广告)’"#遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!’’$!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!。
斑马鱼胚胎整体原位杂交的protocol
固定收集野生型斑马鱼的卵，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20℃ 保存，待用。
（两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去处色素。
现在正在使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成）。
原位杂交第一天重水化和固定1）吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分钟。
2）换成30％甲醇的PBST溶液，放置5分钟3）换成PBST溶液，换两次，每次放置5分钟4）用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟5）用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。
蛋白酶处理与后固定1）用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。
5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。
发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。
2）用PBST溶液轻洗，在PBST中纺织5分钟。
3）用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。
4）用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。
预杂交1）每个管中加上大约500ulHYB－，55℃水浴5分钟，避免振荡。
2）用等体积的HYB＋取代HYB－。
3）55℃水浴预杂交4 小时以上。
杂交1）去除预杂交的HYB＋，加上100ulHYB＋，加上探针，使探针浓度为1ng/ul..2）55℃ 温浴过夜。
杂交与预杂交的温度可以是55到60℃不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。
原位杂交第二天吸去探针1）将探针回收，放于－20℃保存2）用50%甲酰胺/2×SSCT溶液，55℃ 洗两次，洗两次，每次1毫升。
3）2×SSC1ml，55℃ 洗15分钟，每次1毫升。
4）0.2×SSC1ml，55℃ 洗两次，每次放置30分钟，每次1毫升。
侦测1）用MABT洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。
斑马鱼原位杂交实验方案
斑马鱼全胚胎原位杂交技术Form Dr. Kevin第一节原位杂交技术的历史Joseph G. Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡献，并发明了原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）。
自Gall同他的研究生Mary Lou Paudue和Susan Gerbi在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生物学的巨大进步。
Kathleen H. Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。
ISH技术在斑马鱼中的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。
同年, Nusslein-Volhard 等将Cox 建立的RNA 原位杂交技术进行了改进, 用地高辛（digoxin）标记的RNA 在斑马鱼胚胎中检测基因表达。
2008 年, Bernard Thisse 等将该技术进一步优化, 使之更敏感, 也提高了基因表达检测的分辨率，我们在这里介绍的整胚原位杂交技术主要参照Thisse实验室2008年版本（Thisse, C. and Thisse, B., 2008, High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3 : 59 –69）。
第二节原位杂交技术的原理原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
斑马鱼整体原位杂交protocal
整体原位杂交（WISH）（此实验需要全程在摇床上进行）1）胚胎准备，需确定胚胎地具体时间。
2）固定：将收取胚胎用4％PFA室温固定2h（或者4℃过夜）3）PBST漂洗胚胎，2次，5min/次4）分别用50％、100％甲醇溶液胚胎脱水，各1次，5min/次5）更换新鲜100％甲醇，并将胚胎储存在－20℃固定2小时(或过夜)6）复水：分别用甲醇：PBST为3：1，1：1，1：3溶液漂洗胚胎，各1次，5min/次7）用PBST漂洗胚胎2次，5min/次。
8）增加胚胎的通透性：proteinase K（10μg/ml，用PBST稀释）处理胚胎，24hpf胚胎5min，胚胎8min，3dpf胚胎15min，5dpf胚胎27min。
处理过后用，PBST漂洗，然后4％后固定，室温30-40min。
9）用PBST漂洗胚胎2次，5 min/次，同时HB 60℃预热10）预杂交：吸除PBST，加入HB，60℃，5min；更换新鲜HB溶液，60℃，3-4小时，68℃ 10分钟。
11）加探针：取出探针，取出迅速置于冰上；回收HB溶液，加入探针，60℃，过夜12）回收探针（可以重复使用3-5次），储存在－20℃，将50％甲酰胺/2×SSCT及0.2×SSCT 68℃预热，漂洗2次，20min/次13）分别用2×SSCT和0.2×SSCT溶液在68℃漂洗胚胎，各2次，20min/次14）PBST漂洗胚胎，2次，5min/次。
15）封闭：现配2％羊羔血清（PBST稀释）用做封闭，室温至少1h16）抗体：用2％羊羔血清稀释抗体（anti-dig-AP），1：5000，4℃，过夜（或1：2000,RT,2h）17）回收抗体（可以重复3次），用PBST室温下漂洗胚胎，2次，10min/次18）用buffer9.5T溶液孵育胚胎，2次，10min/次，目的是提供碱性条件19）加入NBT/BCIP染液，染色适当时间（20-60min），待信号显现，加PBST终止反应，3次，10min/次20）用4％PFA固定胚胎，室温固定1h后，PBST漂洗2次，10min/次21）将胚胎储存在70％甘油中，4℃保存，备用。
斑马鱼整体原位杂交的技术改良
摘 要 ： 斑马鱼整体原位杂交技术广泛应用于基因表达谱、 基因间相互关系和突变体筛选等方面 ， 是研究斑马
鱼 发育相关基 因功能 的重 要技 术 。本 文 从杂 交 探针 的制备 、 度 的选 择 和洗 脱 以及胚 胎 的脱 色 、 白酶 Ｋ消 浓 蛋
化、 底物 显色等方 面进行 了摸 索 、 进及 简 化 ， 得 了背 景低 、 色 清 晰 、 改 获 着 特异 性 高 的实 验结 果 ， 预示 了简单 实
Ｆ ＡＮ ｎ － ｅ Ｈｏ ｇ ｙ ，ＰＥ ＮＧ Ｚ ｏ ｇ ｌ ，Ｘ Ｅ Ｈｕ － ｉ ｇ，Ｙ Ａ Ｗｕ ｚ ｏ ｈ ｎ —ｕ Ｉ ａｐ ｎ Ｕ Ｎ —ｈ ｕ，ＷＡ ｕ — ｕ ＮＧ Ｙ ｅ ｑ ｎ， ＤＥ ＮＧ ｒ ｎ，ＷＡ ｏ ｇ ｑ ，Ｍ Ｏ Ｘｉｏ ｙ ｎ ｕ ＮＧ Ｙ ｎ － ｉ ａ — ａ ｇ，Ｌ ｏ ｇ— ｉｇ ， Ｉ Ｙ ｎ ｑｎ Ｘｉ —ｈ ｈ ｕｓ ａ
斑马鱼(Danio rerio)胚胎免疫反应:补体基因在早期胚胎以及LPS刺激胚胎中的表达
斑马鱼(Danio rerio)胚胎免疫反应：补体基因在早期胚胎以及LPS刺激胚胎中的表达李宗耀;杨雨佳;张士璀;汲广东【摘要】以模式生物斑马鱼(Danio rerio)为研究对象,使用原位杂交及实时荧光定量PCR方法,对斑马鱼补体基因(C3,C4,C9,Bf1,Bf2,Bf3)及其调节因子(RCA2.1,RCA2.2)在早期胚胎中的时空表达模式及LPS刺激后表达量的变化进行了研究.结果表明,上述基因在胚胎早期(卵裂期至体节期)均为泛表达,从受精后24h至幼鱼阶段特异性表达于肝脏及消化道等器官.对胚胎显微注射LPS后,C3、C9、Bf1、Bf2、Bf3基因在早期胚胎中表达上调,RCA2.1基因表达下调,这与斑马鱼成鱼受到革兰氏阴性菌感染后补体分子(C3,C9,B因子等)的反应类似,表明其参与补体激活途径、溶膜途径及补体调节,提示斑马鱼可在胚胎发育早期构建补体系统,参与急性期反应等免疫反应.【期刊名称】《海洋与湖沼》【年(卷),期】2015(046)006【总页数】7页(P1444-1450)【关键词】补体;斑马鱼;胚胎;LPS;表达模式【作者】李宗耀;杨雨佳;张士璀;汲广东【作者单位】中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛 266003;中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛 266003;中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛 266003;中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛266003【正文语种】中文【中图分类】Q786斑马鱼(Danio rerio)是脊椎动物的模式生物,与大多数鱼类相似,均为体外受精并发育。
在胚胎发育过程中,鱼卵暴露于水中,同水中大量的病原微生物直接接触。
这就引出一个问题,鱼类胚胎在发育过程中是如何保护自身免受外源微生物入侵的？鱼类的特异性免疫于脊椎动物中发育程度较低,免疫球蛋白种类和数量均有限,已有的研究表明,与鱼类特异性免疫相关的基因(Rag2,AID,TCRAC,IgLC-1,mIg,sIg,IgZ和DAB)直到胚胎受精后8天才对LPS诱导有强烈反应(Li et al,2011),说明在胚胎发育早期,特异性免疫尚未成熟,非特异性免疫尤其是补体系统在胚胎发育中的构建对其抵御外界病原体的入侵具有重要的意义。
斑马鱼相关实验操作
斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育一、实验目的了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。
二、斑马鱼的生活和繁殖习性斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。
在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。
斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。
最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。
为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。
斑马鱼具有下列特点：1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。
2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。
3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。
4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。
5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。
6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本结构。
因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。
三、实验器材和材料斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。
曝气水10L。
性成熟雌、雄性斑马鱼。
四、实验内容和程序实验前一天的准备：1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28℃（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。
2、曝气水将干净的自来水烧开后冷却，将气泵放入其中进行曝气，以为培养胚胎之用。
3、斑马鱼的选取和催产雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较小，而雌鱼腹部较大。
选鱼的时间在实验前一天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂食红虫，喂食后1小时才开始选鱼。
整胚原位杂交
组织学与病理学技术实验报告实验名称：使用整胚原位杂交方法定位观察斑马鱼胚her4 基因的表达使用整胚原位杂交方法定位观察斑马鱼胚胎her4 基因的表达一、实验目的：1）通过本实验掌握原位杂交的基本原理及方法。
2）观察her4基因在斑马鱼胚胎的表达位置。
二、实验原理：原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。
字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。
原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。
这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。
整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。
整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。
我们这儿所介绍的一种原位杂交的方法是通过后者，以地高辛标记探针，然后用酶联抗体的方法进行检测。
三、实验试剂及仪器1、实验试剂：系统水、4%聚甲醛、PBS溶液、甲醇（70%、50％、30％）、蛋白酶K的PBST溶液（在管中原有的约1mlPBST中加入1 μl 10mg|ml的蛋白酶K，终浓度10 μg|ml）、H2O2（3%H2O2；0.5M NaOH）、PBST溶液、HYB 溶液、RNA探针、50%甲酰胺、2×SSCT溶液、0.2×SSCT溶液、MABT、阻断溶液、羔羊清:MABT=1:9的溶液、AP底物染色缓冲液。
整体原位杂交法初步研究MMP11b在斑马鱼胚胎发育过程中的表达
已经 形 成 ， 于观 察 和 操 作 ， 年 来 作 为 整 体 模 式 动 物 已 易 近 引 起 了广 泛 的 关 注 Ｊ 。 目前 ， ｏｎ Ｙ ｏｇ和 Ｚ ａｇ等 报 道 ＭＭ ９和 ＭＭ ２在 斑 马 鱼 ｈｎ Ｐ Ｐ 早 期 胚 胎 发 育 中 有 重 要 作 用 － ，Ｍ １ ｓ ］ ＭＰ ３在 斑 马 鱼 胚 胎 发 育 过 程 中也 有 相 关 的 文 献 报 道 。 Ｍ １ ｂ能 降 解 细 胞 ＭＰ ｌ 外 基 质 ， 肿 瘤 的 血 管生 成 中起 促 进 作 用 ， 是 有 关 ＭＭＰ １ 在 但 １ｂ 在 斑 马 鱼胚 胎 发 育 中的 表 达还 没 有 人 报 道 ， 文 通 过 斑 马 鱼 本 整体 原 位 杂 交 法 初 步 发 现 ＭＭＰ １ １ｂ在 斑 马 鱼 早 期 胚 胎 中表 达 时期 和部 位 ， 以后 深 入 研 究 Ｍ １ｂ基 因 功 能 和 血 管 新 为 ＭＰ １
第 ２ 第 ３期 ７卷 ２１ ０ ０年 ６月
生 物 学 杂 志
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基 质 金 属 蛋 白酶 （ ａ ｉ ｍ ｔｌｐｏ ｉａｅ Ｍ ｔｘ ｅ ｌ ｒｔ ｎｓ，ＭＭ ） 一 个 ｒ ａｏ ｅ Ｐ是 大家 族 ， 因其 需 要 锌 等 金 属 离 子 作 为 辅 助 因 子 而 得 名 。基 质
金属 蛋 白酶来 源 于 多 种 类 型 的 细 胞 ， 可 以 清 除胶 原 分 子 、 它
关 键 词 ： 马 鱼 ； 质 金 属 蛋 白 酶 １ｂ 原 位 杂 交 斑 基 ｌ；
GAS41基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱
GAS41基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱周芳亮;胡翔;吴文韬;杨子剑;李莉;向双林;韩梅;丁小凤【摘要】为了深入研究GAS41在胚胎发育中的作用机理,应用生物信息学软件分析了斑马鱼GAS41基因的序列特征；采用RT-PCR、整体原位杂交和整体免疫组织化学方法检测其在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱.结果显示斑马鱼GAS41蛋白与人类、小鼠、大鼠同源蛋白都有91.2％的同源性,具有高度的保守性.RT-PCR结果表明GAS41在检测的成体组织中均有表达,表达丰度相当.而GAS41在胚胎受精后一直持续表达,其中受精4h后表达量升高.整体原位杂交和免疫化学结果显示GAS41特异性表达于胚胎头部,尤其是中脑、间脑(眼部)、小脑和后脑表达明显.这些都提示GAS41是一个高度保守基因,在斑马鱼中枢神经系统发育过程中可能起重要作用,同时也为GAS41在胚胎发育调控中的作用机制提供实验基础.%To further research the function and mechanism of GAS41 in embryonic development, the characteristic of zebrafish GAS41 gene sequence was analyzed by bioinformatics softwares, and the temporal and spatial expression profiling of zebrafish GAS41 in the embryonic development was detected by RT-PCR、whole-mount in situ hybridization and whole-mount immunostaining. The results showed zebrafish GAS41 protein, with highly conservative features, shares a 91. 2% sequence identity to homologues of human, mouse and rat GAS41. RT-PCR revealed GAS41 expression was detected in all of adult tissues with the same abundance, and GAS41 continued to express after fertilization, its expression was increased in 4 hours post fertilization. The whole-mount in. Situ hybridization and whole-mount immunostaining showed GAS41 specifically expressed in theembryonic head region, especially in the midbrain, interbrain (eyes) , cerebellum and hindbrain. These data suggest that GAS41 is a highly conserved gene and might play an important role in zebrafish central nerve system development, which also provides a solid experimental foundation for the research of the regulatory mechanism of GAS41 in embryonic development.【期刊名称】《湖南师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2012(035)001【总页数】5页(P66-70)【关键词】斑马鱼;GAS41基因;表达谱;头部特异表达【作者】周芳亮;胡翔;吴文韬;杨子剑;李莉;向双林;韩梅;丁小凤【作者单位】湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室,中国长沙410081;湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室,中国长沙410081;湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室,中国长沙410081;湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室,中国长沙410081;湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室,中国长沙410081;湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室,中国长沙410081;湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室,中国长沙410081;湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室,中国长沙410081【正文语种】中文【中图分类】Q78基因扩增是人类肿瘤中基因过量表达的一个主要原因，其中在人类神经胶质细胞中大量的基因扩增是促进其肿瘤产生的一个决定性因素．神经胶质细胞瘤序列41(GAS41)最初是从星型细胞瘤的4个发展阶段中均扩增到的一段高拷贝的DNA 序列，它与转录因子AF-9和ENL结构高度同源[1]．后来研究发现GAS41是一个必需基因，泛素化表达于人类组织细胞核中，其中人脑表达量最高[2-3]．而且GAS41基因在鸡的前淋巴细胞系DT40中定点敲除后，细胞中的RNA合成大量降低，细胞随后死亡．由此可见，GAS41是一个重要的管家基因，决定细胞的生长与存活[4]．此外，GAS41与人类急性白血病融合蛋白MLL/AF10相互作用，参与人类血液恶性转化[5]．GAS41与通用转录因子复合体成员TFIIF相互作用，和特异的转录因子AP-2beta也相互作用促进RNA转录从而参与基因的转录调控[6-7]．最近发现GAS41与磷酸酶PP2Cbeta相互作用，促进了肿瘤抑制基因P53的去磷酸化，进而抑制肿瘤抑制基因P53信号通道[8-9]．因此，GAS41在细胞增殖与肿瘤发生发展中起重要的转录调控作用．GAS41在胚胎发育中的功能却少有报道，作者选用新型模式生物斑马鱼作为研究对象，它具有体型小、体外受精、生长迅速、产卵量大和胚胎透明等有利特点[10]，便于观察和操作，以此来分析GAS41在胚胎发育中的时空表达谱．本研究发现GAS41是一个高度保守的基因，泛素化表达于斑马鱼成体组织中，特异性表达于胚胎头部．这为进一步研究GAS41在胚胎发育中的功能奠定了基础，同时为揭示GAS41在胚胎发育调控中的机理提供实验依据．1 材料和方法1.1 材料斑马鱼购自武汉中国科学院水生生物研究所，总RNA抽提试剂盒和RT-PCR反转录试剂盒购于QIAGEN，exTaq DNA聚合酶，SP6和T7 RNA聚合酶均为TAKARA产品，限制性内切酶和连接酶购自NEB公司，地高辛标记试剂盒购自Roche，pGEM-T Easy载体为Promega产品，DNA相对分子质量标准购自Fermentas公司，PCR引物合成和DNA测序均在上海生工生物工程有限公司完成，质粒小量提取试剂盒和胶回收试剂盒购自长沙安比奥公司．兔抗GAS41抗体购于Sigma公司，Alexa 488羊抗兔荧光二抗购于Molecular Probes公司．其他常规试剂均购于上海生工生物工程有限公司．1.2 斑马鱼GAS41基因序列分析从GenBank中查到斑马鱼GAS41(YEATS4)基因的CDS序列(登录号：BC076436)，GAS41蛋白在不同物种中的序列比对在DNAStar软件Meglign程序上进行，GAS41基因的进化树用CLUSTAL X软件分析．1.3 RT-PCR按照总RNA抽提试剂盒说明书分别提取斑马鱼胚胎发育中各时间点和成体斑马鱼各组织的总RNA．然后用RT-PCR方法扩增GAS41 cDNA序列(PCR扩增长度为180 bp)．GAS41的RT-PCR引物序列见表1．PCR的反应条件为：预变性94 ℃ 3 min,变性94 ℃ 30 s,退火60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,共28个循环，最后72 ℃延伸5 min．扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统下观察GAS41基因的表达情况．同时扩增β-actin作为内参对照．表1 引物序列Primer namePrimer sequence (5'-3')Size/bpGAS41-FCCGGAATTCCGATGTTTAAGAAGATGGCTGAAGAS41-R1AGACATGTCCTCATTTCTGTAA180GAS41-R2AC GCGTCGACTCAGTGCTCCTTCATCTGG681β-actin-FGCGCGGCTACAGCTTCAβ-actin-RCTTAATGTCACGCACGATTTCC551.4 反义RNA探针制备载体构建：采用RT-PCR方法以48 hpf时期斑马鱼胚胎的总RNA为模板扩增GAS41全长cDNA序列(扩增长度为681 bp)．引物序列如表1． PCR的反应条件为：预变性94 ℃ 3 min,变性94 ℃ 1 min,退火56 ℃ 1 min,延伸72 ℃ 1 min,共28个循环，最后72 ℃延伸5 min．将PCR产物插入pGEM-T Easy载体中，重组质粒进行EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶鉴定和测序分析．探针制备：重组质粒分别用NcoⅠ和NdeⅠ酶切线性化，经SP6和T7 RNA聚合酶和地高辛标记试剂盒体外转录获得地高辛标记的反义RNA探针和正义RNA探针．1.5 整体原位杂交采用40 g/L的多聚甲醛将各个时期的胚胎于4 ℃固定过夜，甲醇梯度脱水，并置于-20 ℃的甲醇中备用．原位杂交主要步骤为：将胚胎梯度复水，用蛋白酶K处理18 hpf时期以后的胚胎，用1×PBST清洗胚胎，于65 ℃杂交炉中将胚胎进行预杂交4 h,然后分别加入反义RNA探针和正义对照RNA探针，于65 ℃杂交炉中杂交过夜．杂交第2天回收探针,以SSCT梯度清洗胚胎,加入anti-Dig-AP抗体与反义RNA探针4 ℃结合过夜．杂交第3天回收抗体并用1×PBST溶液清洗胚胎，然后加入BCIP/NBT(Roche)染液显色,显色完全后用1×PBST溶液冲洗，在显微镜下观察并进行拍照记录结果．1.6 整体免疫组织化学采用40 g/L的多聚甲醛将不同发育时期的胚胎于4 ℃固定过夜，将胚胎置于含有10%羊血清的1×PB ST中封闭1 h,加入GAS41多克隆抗体(一抗稀释比例1∶200)4 ℃孵育过夜，1×PBST中洗涤30 min×3次．加入Alexa 488羊抗兔荧光二抗(二抗稀释比例1∶100)于4 ℃孵育10 h, 1×PBST中洗涤15 min×3次．最后于荧光显微镜(Zeiss Axioskop 2)下分析荧光信号．1.7 Western印迹杂交图1 斑马鱼和部分物种GAS41蛋白的同源性(A和B)与进化树(C)分析将不同发育时期的胚胎加入真核细胞裂解液[50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.2), 150 mmol/L NaCl, 体积分数为1%的Triton X-100, 10 g/L sodium deoxycholate, 1 g/L SDS] 含蛋白酶抑制剂，提取胚胎总蛋白．加入SDS上样缓冲液，105 ℃金属浴5 min, 将蛋白质作12%的SDS-PAGE，转移至PVDF膜．以10 g/L的脱脂奶粉室温封闭1 h,兔抗GAS41多克隆抗体为一抗,稀释为1∶500；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG为二抗，稀释为质量分数1∶1 000．用DAB 进行发色显迹．2 结果与分析2.1 斑马鱼GAS41基因序列的分析使用DNAStar软件中的MegAlign程序进行GAS41基因在不同物种中氨基酸同源序列比对分析．结果显示，斑马鱼GAS41蛋白与人类(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculu)和大鼠(Rattus)的氨基酸序列同源性都为91.2%．不同物种GAS41蛋白同源氨基酸序列在N端tf2f结构域为保守区域，而在C端激活结构域有一定程度的变异[3]．人类、小鼠和大鼠中的GAS41氨基酸序列同源性高达98.7%～99.6%(图1A,B)．这提示GAS41蛋白质具有高度保守性．使用CLUSTAL X系统软件进行GAS41在不同物种中的同源序列分析并构建进化树(图1C)．从图中可以看出人类的同源序列与小鼠的GAS41序列亲缘关系最近，其次为大鼠,与斑马鱼GAS41关系稍远．图2 GAS41在斑马鱼成体组织(A)和胚胎发育不同时期(B)表达情况的RT-PCR分析2.2 GAS41基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱2.2.1 RT-PCR分析为了研究GAS41基因在斑马鱼中的作用，作者通过RT-PCR方法检测了GAS41在成体斑马鱼器官组织中的表达．图2A显示GAS41在斑马鱼9种主要的器官组织中均有特异性的扩增条带，其条带信号强度没有显著差异．同时作者分析了GAS41基因在斑马鱼胚胎发育不同时期的表达．GAS41基因在胚胎受精后持续表达，从4 h开始表达量升高，一直到72 h表达量基本不变(图2B)．2.2.2 整体原位杂交分析 pGEM-T Easy-GAS41重组质粒用NcoⅠ酶切经SP6 RNA聚合酶体外转录获得反义RNA探针，用NdeⅠ酶切经T7 RNA聚合酶转录获得正义RNA探针．RNA探针经20 g/L的琼脂糖凝胶电泳(图3B)，泳道M为DNA marker，泳道1为反义RNA探针，泳道2为正义RNA探针．探针大小约为681 bp,与预期大小相符．因RNA的复杂构型合成的探针在普通凝胶电泳下均跑出2个清晰的条带．箭头指示GAS41的表达区域：m：中脑；i：间脑；c：小脑；h：后脑．比例尺：200 μm．M: DNA marker；1: 反义探针；2:正义探针图3 GAS41基因在斑马鱼胚胎发育中的整体原位杂交表达谱(A)和GAS41探针电泳图(B)与正义RNA探针相比，反义RNA探针在前期的实验中证实可特异性结合GAS41．用反义RNA探针分别与不同发育时期的斑马鱼胚胎杂交，图3A结果表明，GAS41在斑马鱼胚胎发育中均可检测到GAS41基因转录，但表达部位不同．GAS41在受精后2 h和4 h普遍性表达，8 h时集中出现在胚胎的一侧，斑马鱼体节期18 h开始后GAS41特异性表达于胚胎头部，尤其是中脑、间脑、小脑和后脑表达明显，并且GAS41在这些部位的特异性表达一直持续至受精后48 h，专一性表达于脑部中枢神经系统．2.2.3 整体免疫组织化学为了进一步证实GAS41在斑马鱼头部的表达，作者采用GAS41抗体和绿色荧光标记的第二抗体通过胚胎整体免疫组织化学方法检测GAS41蛋白质在胚胎发育中的表达情况．在荧光显微镜下观察到受精后24，36和48 h胚胎中明显的绿色荧光(图4A)．信号集中出现在胚胎的头部，尤其是间脑(眼部)和中脑部位高表达．同时检测了GAS41抗体的特异性，图4B为Western印迹分析斑马鱼不同时期GAS41蛋白质的表达，GAS41的多克隆抗体检测到了GAS41(25 000)，与预期蛋白大小相符，条带单一，抗体特异性非常好，也显示GAS41蛋白在斑马鱼胚胎受精后24～48 h均有表达，且表达水平相当．箭头指示GAS41的表达区域．比例尺：200 μm. M: protein marker图4GAS41基因在斑马鱼胚胎不同时期表达情况的整体免疫组织化学(A)和Western印迹(B)分析3 讨论GAS41是最早在神经胶质细胞瘤细胞系中通过显微切割调节cDNA捕获技术分离到的人类肿瘤中高度扩增的基因[1]．GAS41处于染色体12q13-15区域，共227个氨基酸．GAS41的N端包括tf2f结构域，该结构域普遍存在于YEATS家族转录因子AF9和ENL中，参与基因转录与染色质重排[3，7]．而在GAS41的C端60个氨基酸中包括大量的酸性氨基酸(27%)，是一种带负电荷的酸性α螺旋结构，这是真核转录因子激活结构域的典型特点，也是蛋白质与蛋白质相互作用的区域[3]．GAS41通过C端激活结构域与MLL融合蛋白AF10相互作用参与癌症的发生发展过程[5]．而且GAS41在鸡前淋巴细胞中定点敲除后细胞死亡，GAS41的表达干扰后子宫颈癌HeLa细胞的生长阻滞[4，11]．由此可见GAS41在基因转录调控、细胞增殖和恶性肿瘤中发挥了重要的作用[4-5，8]．但GAS41在胚胎发育中的研究并未有报道．生物信息学软件分析斑马鱼GAS41蛋白质序列与部分物种中GAS41同源性达91.2%，该基因表现出较高的进化保守性，这也说明GAS41基因的重要性．本研究以斑马鱼为模式动物对GAS41的时空表达谱进行分析，GAS41泛素化表达于成体组织(脑、心脏、肝脏、肾、肌肉、小肠、卵巢、睾丸、眼睛)中，而GAS41在斑马鱼胚胎发育中特异性表达于胚胎头部，尤其是中脑、间脑(眼部)、小脑和后脑表达明显．这与此前的Northern印记杂交显示GAS41在人脑组织中表达量最高是一致的[2-3]，这说明GAS41在不同物种中表达的专一性．GAS41在胚胎体节期特异地表达于头部的中枢神经系统，这些表明GAS41除了维持成体组织正常生理功能外，在中枢神经系统的发育、成熟等过程也扮演了重要的作用．通过显微注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸使GAS41表达下调，从而分析GAS41对斑马鱼中枢神经系统发育表型及相关信号传导通道的影响，由此揭示GAS41调控中枢神经系统发生的机制，这些问题仍在深入研究．总之，本研究结果为进一步分析GAS41在斑马鱼胚胎发育中的功能奠定了基础，并且为以后深入研究GAS41在哺乳动物发育调控中的作用机理提供了有利的线索．参考文献：[1] FISCHER U, HECKEL D, MICHEL A, et al. 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斑马鱼胚胎整体原位杂交(Whole-mount in situ hybridizations in zebrafish embryos)北京大学遗传与发育生物学实验室整理者：肖安版本：V6.22 Build 2006-8-17说明：小号宋体文字为操作提示，其中下划线标记者为以下数步均需注意的内容；小号楷体文字为影响结果的重要步骤提示，注意控制记录其操作处理的条件和时间，以在重复实验探索最适条件时进行适当调整。
在整个实验中应当注意：(1) 由于环境中存在大量RNA酶，RNA在常温下极易降解。
因此，涉及RNA的操作，在探针去除之前，以及探针的合成与纯化过程，必须严格防止污染。
操作需要要戴乳胶手套进行，使用专用枪头、离心管、电泳槽等，尽量缩短RNA 在常温或37℃放置时间，电泳使用高电压短时间的程序，每次必须更换新电泳液。
实验间隙中RNA放置在-20℃，过夜或更长时间保存在-80℃。
(2)如同时对多管进行吸去溶液和加入溶液工作，应当按照同样的顺序依次操作，以保证其处理时间基本一致。
避免漏加溶液。
(3)注意所加溶液与胚胎温度的差异，应当先预热再使用。
一般溶液加入量为1mL左右，管平放以使胚胎分散与溶液充分接触，但探针杂交一步溶液过少可竖直放置。
(4)吸取胚胎的枪头应剪去尖端以扩大开口。
吸时动作要轻。
任何时候都要防止丢失胚胎，可在换前一管溶液时将后一管竖直放置让胚胎沉降一会以免吸走。
(5)注意保护标签，并且易混淆标签必须设法分辨(如6和9)。
第一天以下操作需戴乳胶手套。
1 水溶液体系重新处理 (Rehydration)。
1.1吸去恢复到室温的胚胎中的甲醇(MeOH)，用70%, 50%, 30%的 MeOH的PBST溶液依次处理5分钟。
梯度稀释的目的是防止胚胎收缩，可适当多添加几个浓度梯度。
稀释时间宁长勿短。
特别注意保护标签，MeOH为有机溶剂，易腐蚀油性笔书写的标签。
1.2 PBST处理5分钟，两次。
2 蛋白酶消化和随后的固定(Proteinase digestion and post fixation)。
2.1用蛋白酶K的PBST溶液(在管中原有的约1mLPBST中加入1uL10mg/mL的蛋白酶K，终浓度消化的目的是使探针更容易进入组织中。
应根据胚胎质量、以前原位杂交结果适当增减时间。
注意双氧水脱色的胚胎受损害较大，蛋白酶K处理时间应大大短于培育时加入PTU阻止色素生长的胚胎。
理论上换新的酶和新胚胎都应该重试处理时间。
以下操作室温进行，注意溶液预热。
2.2消化时间到后，先尽快用PBST暂时漂洗，然后PBST洗5分钟，一到两次。
在PBST洗后或下一步多聚甲醛固定后可以按照探针将胚胎分管和混合，注意同一管中的胚胎发育时期不宜相隔过近，以免最后观察结果时难以分辨。
但若相隔过远，后面的染色时间可能会有很大差异，并且处于发育较早期的胚胎破裂时卵黄可能污染发育较晚期的胚胎。
每一时期每一探针需15枚左右(发育早期的胚胎在实验中容易损坏，宜多取一些)。
若做正负对照，正对照用已明确的Marker基因探针(反义RNA链)，或者对胚胎进行双染。
负对照使用正义RNA链，或者不加探针(如粗略筛选时)。
注意及时写上新的标签编号并记录下每个编号对应的各胚胎时期。
2.3 4%多聚甲醛(paraformaldehyde, para)固定20分钟。
提前解冻，每次实验都尽量用一管新的多聚甲醛，避免RNase污染。
未使用完部分可用于固定胚胎。
用于原位杂交的胚胎都使用多聚甲醛固定。
甲醛苦味酸混合液固定胚胎虽然能更好的保持形态，但将破坏胚胎抗原性，导致零结果。
2.4 PBST洗5分钟，两次。
以上两步用PBST洗涤也可改为PBT，后者含有小牛血清，对胚胎保护更好。
以下65℃的操作步骤在水浴箱(water bath)或杂交炉(hybridization oven)中进行，注意溶液预热。
3 预杂交(Prehybridization)。
加入500uL HYB，65℃预杂交至少4小时。
4 杂交(Hybridization)。
4.1 RNA探针(RNA probe)以3ng/uL浓度溶于HYB，72℃温育5分钟，再冰上放置以破坏形成的可能妨碍杂交的二级结构。
4.2吸去胚胎管中的HYB，加入约含至少300ng 探针的溶液。
实际探针浓度应反复调整至合适。
通常加入体积为200uL，不得少于100uL，否则胚胎难以充分接触溶液。
4.3 65℃温育过夜或大约12小时。
杂交温度一定不得超过72℃，否则探针被破坏。
温度越低，杂交程度越好，但背景可能越深。
这是影响最终结果最重要的决定因素之一。
杂交时间不宜超过太多，否则背景容易过深。
第二天5 去除探针(Probe Removal)。
5.1吸去探针溶液并重新保存于-20℃。
一般而言探针可重复使用十次左右，能重复使用次数取决于探针质量。
使用越频繁，得到的信号越弱。
探针的HYB 溶液中在-80℃下至少可保存一年。
以下步骤不用戴乳胶手套操作。
以下操作步骤仍在65℃进行，注意溶液预热。
5.2甲酰胺(formamide)溶于SSCT的溶液(最终浓度甲酰胺50%，SSCT 2*)洗30分钟，两次。
5.3 2*SSCT洗25分钟。
5.4 0.2*SSCT洗30分钟，两次。
通常在试验时洗涤到此为止，若背景过深可继续一至多步洗涤，如0.1*SSCT65℃或室温洗涤15分钟，再0.05*SSCT 室温洗涤15分钟。
洗涤的目的是洗去残留未特异性结合的探针，留下特异性结合的探针，较高温度(65℃)或较稀浓度SSCT洗涤可洗得更干净，在降低背景同时也容易使杂交上的探针被洗脱，这是影响最终结果的最重要因素之一。
时间要严格控制。
实际需要反复探索适合于不同探针、不同时期胚胎的具体条件和时间。
第一次试验可只到0.2*SSCT洗涤。
从去除探针开始的步骤需要特别保护胚胎，因为胚胎此时非常透明(处于发育较晚期的尤其如此，可能是卵黄较少的缘故)。
吸取溶液时先将管竖直，待胚胎沉到管底后再吸溶液，并注意枪头中有没有吸走胚胎。
以下步骤(6-7)为针对双染的第一步或针对荧光素标记探针Fast Red染色。
若不做此步可直接跳至8。
8 地高辛抗体检测(Anti-Dig Detection)8.1慢摇下用MABT洗5分钟，两次。
8.2慢摇下用阻断溶液(blocking solution，参见现配溶液)阻断一小时。
此步可以在解剖镜下将损坏的胚胎清除。
若为双染，第二次阻断可略去。
8.3加入新用阻断溶液3000倍稀释的地高辛抗体(digitin antibody, anti-dig)，每管至少加入800uL，4℃下摇动过夜。
注意用于稀释抗体的溶液4℃预冷，避免抗体降解。
抗体不一定是单抗，有可能与胚胎中原有的其它抗原结合，导致背景过深。
在对实验结果精度要求较高的情况下，可将抗体与待原位杂交时期的胚胎或胚胎的丙酮保存粉末混合处理(参见现配溶液)，或者加入适当的阻断试剂。
第四天以下步骤最好使用另一摇床或停止加热的杂交炉，从4℃中取出的摇床要等内部凝结的水汽蒸发完后才能再次使用，以保护电路。
第四天同。
9 碱性磷酸酶底物染色(AP Substrate Stain)9.1加入到1%热处理羔羊血清(heat treated lamb serum)的MABT溶液中，室温洗25分钟。
9.2 MABT洗25分钟，三次。
9.3检测缓冲液(Detection Buffer，参见现配溶液)洗5分钟，二次。
胚胎转移到24孔板。
在转移之前可再挑一次损坏的胚胎。
24孔板孔内不能有灰尘，解剖镜下检查并用脱脂棉蘸乙醇擦干净，用检测缓冲液冲洗两次，一般使用一两次即抛弃。
各孔盖上标好探针名。
9.4加入至少300uL AP底物染色缓冲液(参见现配溶液)，室温温育，金属箔片包裹避光。
每30分钟检查一次染色情况。
万一需要过夜不便检查，4℃保存第二天再室温放置并检查。
尽量避免如此以防染色过度。
若染色液变色，说明已光照失效，应适当补充染色液。
温度低可以减缓酶促反应速度，而温度高染色快，但会使背景加深。
9.5当目标着色出现后，用PBS洗5分钟，两次，以停止反应。
此处PBS和杂交前使用的PBS分开，不加吐温以免干扰。
若同一孔中的不同时期胚胎染色情况不一致，可以分开分别终止。
10 照相(Photograph)10.1 4%多聚甲醛PBS溶液固定，保存于4℃。
地高辛探针杂交胚胎长期保存可依次用30%, 50%, 70%MeOH的PBS溶液处理后转移到MeOH中，4℃或-20℃保存；并不时检查更换变色的MeOH。
管的侧面和盖上注明胚胎品系、时期、探针、日期。
MeOH可溶解碱性磷酸酶非特异性着色和部分特异性着色，因此保存的胚胎颜色将逐渐变浅；而Fast Red着色在MeOH中将全部脱落，只能保存于多聚甲醛。
10.2照相前将胚胎用用30%, 50%, 70%甘油的PBS溶液处理后转移到甘油中，照相后再梯度转移回4%多聚甲醛或MeOH中。
不需保留可丢弃。
现配溶液(仅需稀释或混合者略)溶液名后附加的T表示吐温(tween)，用前加入，浓度约为0.1%。
吐温的作用是使胚胎不易粘附在枪头内壁上。
由于吐温量少且较粘稠，吸取的时候要多等一会让其上升至枪头内，加入后在溶液中吹吸几次。
(1)丙酮粉末处理抗体溶液每管800uL抗体溶液：取充分混匀的质量百分比约1%的丙酮鱼粉悬浊液11uL，4000rcf离心2分钟，去除上清。
加入500uLPBT洗涤，4000rcf离心2分钟，去除上清。
离心速度和时间须适当调整，既要保证沉淀上清分离，又要避免沉淀结合过于紧密无法重悬。
加入80uLPBT，震荡成悬浊液。
加入羔羊血清至2%终浓度(1.6uL)。
加入1/300的抗体，即得10*抗体溶液。
使用前用阻断溶液稀释至1*，即1/3000抗体溶液。
(2)阻断溶液(blocking solution)每1mL 10%热处理羔羊血清或100uL血清原液；2mL 10%阻断试剂(blocking reagent)；用MABT补至10mL。
1%热处理羔羊血清的MABT溶液类似，仅不加阻断试剂；可共用同一容器。
两种溶液若剩余均须丢弃，防止血清变质。
(3)检测缓冲液(detection buffer)又称AP缓冲液(AP Buffer)每50mL溶液：100mM NaCl(1mL 5M)；50mM MgCl2(2.5mL 1M)；100mM 三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl(5mL 1M，pH9.5)；0.1% Tween-20；1mM 左旋咪唑(levamisole)(50uL 1M)。
左旋咪唑的作用是抑制胚胎组织内源性碱性磷酸酶，若不加左旋咪唑，可以增强信号，不过同时背景也会增强。
而若最终结果染色过浅，可能是左旋咪唑抑制了抗体结合碱性磷酸酶，应调整浓度。