酶固定化新技术及新型酶载体

酶固定化新技术及新型酶载体

传统酶的固定化方法虽在一定程度上可以增强生物催化剂的稳定性，但增强幅度有待进一步提高，并且在此过程中，生物催化剂酶催化活力通常损失严重。运用当代高新技术和设计合成新型载体以及两者的有机结合是引人注目的研究动向。因此目前不断地有新的载体和技术引入每的固定化领域，如：无载体固定化、微波/超声辅助的固定化、阳光照射、离子液体，电辅助固定化等等，且固定化生物催化剂的应用也越来越广泛地应用于医疗、生物医药、环境保护、食品工业、化学工业、能源领域等。

1.酶固定化过程中的新载体

1.1介孔材料

孔道的结构和尺寸对酶活力及稳定性有着明显的影响，合适的孔道中酶固定化后其活力提高到游离酶的2倍，且三维及大孔道有利于固定化与催化过程中酶蛋白和底物、产物的传输，从而能提高酶的固定化和催化效果。

目前，大孔道、高比表面和孔容的新型介孔材料不断被引入酶固定化领域，因为大孔道、高比表面、高孔容的介孔材料中酶的负载量大（图3），且酶的负载能快速完成，负载量显著提高。

图3 孔道大的酶介孔材料的酶负载量大明显提高

1.2纳米管

碳纳米管( carbon nanotube，CNT)是由Iijima于1991年发现的一种新型纳米材料。它是由石墨片层卷曲而成的无缝纳米管[3]。将生物分子，如氨基酸、蛋白质、酶、DNA 等结合在碳纳米管表面或端口上，可提高它在水溶液中的溶解度，为实现碳纳米管的各种生物应用奠定基础[4]。纳米管的内表面能够与酶之间存在强烈的相互作用，从而使得管内酶蛋白结构稳定且保留相当的催化活力，并且用其制成电极能够有效实现底物氧化及电子的传递[5]。硅纳米管用于固定化酶时，能够保持酶的活性，并且提高酶的热稳定性及对PH的耐受性[6]。

1.3磁性高分子微球

磁性高分子微球是由无机磁性纳米粒子与有机高分子通过包埋法、单体聚合法合成的具有磁响应性和微球特性的粒子。通过共聚合和表面改性，磁性高分子微球表面可被赋予多种活性功能基团（如-OH、-COOH、-CHO等）。无机磁性纳米粒子应用较多的是Fe3O4，单体聚合法主要包括乳液聚合、无皂乳液聚合、微乳液聚合、种子乳液聚合。磁性微球有良好的表面效应和体积效应：比表面积较大，微球官能团密度较高，选择性吸附能力较强，吸附平衡时间较短；选择磁响应性，可以避免使用中粒子之间发生磁性团聚；物理化学性质稳定，具备一定的机械强度和化学稳定性，能耐受一定浓度的酸碱溶液和微生物的降解；表面本身具有或通过表面改性赋予多种活性的功能基团，这些功能基团可以连接生物活性物质[7]。

1.4离子液体

离子液体是一种新的绿色溶剂，在生物催化反应中具有以下特点:在离子液体中酶有良

好的选择性、稳定性和反应活性。离子液体可溶解极性大的反应物，产物易分离，酶和离子液体可重复使用。

离子液体是由有机正离子如烷基吡啶离子、季胺盐离子、烷基咪唑离子等和不同的负离子组成的低熔点的有机胺盐，如创科生物的[BMIM]PF6、[BMIM]BF4、[BMIM]OTf等，其

在室温或低温下是液体。离子液体和水、常用有机溶剂可以互溶，但和大多数醚、烷烃不溶，因此可以用醚、烷烃来萃取产物。并且可以通过改变正负离子及烷基碳的长短调节其极性和亲水性，故又被称为可设计溶剂。Erbeldinger小组首次报道在离子液体[BMIM][PF6]中用蛋白酶thermolysin成功催化合成了阿斯巴甜(Z-aspartame)(图式4)，开创了在离子液体中生物催化研究的新领域。

图式4 离子液体中蛋白酶thermolysin催化的合成阿斯巴甜的反应

2酶固定化的新技术、新方法

2.1微波/超声辅助固定化

微波是一种电磁波，波长为0.1~100 cm。微波加热的主要原理是介质材料的极性分子在微波高频电场的作用下反复快速取向转动而摩擦生热，是从物质内部开始，瞬时达到需要的温度。微波加热具有许多传统加热不具备的优点，包括：加热迅速、均匀，不需要热传导过程，内外同时加热，加热时间短；加热质量高，营养破坏少；节能高效；易于控制功能等超声波是指振动频率大于20 kHz以上的一种纵波，在介质中传播时，使介质发生物理的和化学的变化，从而产生一系列超声效应，包括热效应、机械效应、空化效应和化学效应[10]。研究认为，超声波对液体化学反应速度和产率的影响主要是超声波在液体介质中的空化作用，超声可使液体介质中形成微泡，其破裂伴随能量的释放，可以提高许多化学反应的速度。到目前为止，超声波技术对物质提取，高分子降解，酶解反应等都有很好的促进作用。其中超声波酶解反应具有高效、廉价、无污染，可提高酶促反应速度和有效成分的产率。

2.2无载体固定化

交联酶晶体（cross-linked enzyme crystals，CLECs）是指通过交联剂，如：戊二醛，将在水溶液中的酶晶体交联成一种稳定结构及性能的晶态物质，其既具有酶的高活性、高选择性、反应条件温和等特点，又具有固相催化剂的环境适应性强、易回收等优势，从而使其在有机合成中应有较广。CLECs是一种无需载体、既有纯蛋白的高度特异活性又对有机溶剂具有高度耐受性的生物催化剂。由于CLECs需要高纯度酶结晶，实验室难以实行，所以其发展受到很大限制。

交联酶聚集体(Cross-linked Enzyme Aggregates，CLEAs)技术是一种将蛋白质先沉淀后交联形成不溶性的、稳定的固定化酶，是通过基本纯化的、高浓度的蛋白质样品的共价交联来实现的。具有对酶的纯度要求不高、不需要结晶等复杂步骤、可可获得稳定性好、活性高、成本低、易于推广、空间效率高等特点，因此是一个很有发掘潜力的固定化方法。