解析中和法在微生物限度检查中的应用

解析中和法在微生物限度检查中的应用

摘要：在做药物的微生物限度方法学验证时,一般首先采用常规法、稀释法验证,当药物有一定抑菌性的时候,经常采用薄膜过滤法。中和法的使用,在中国药典中由于没有给出具体的方法,而且受到中和剂的选择、中和剂的使用量等因素的影响,不如薄膜过滤法更容易被采用。但在实际工作中, 薄膜过滤法不仅操作繁琐而且易染菌,中和法因其自身的优势，也常常被使用，本文作者以3种药物为例,详细说明如何采用中和法进行微生物限度方法学验证，希望能够对大家有所帮助。

关键词：中和法；微生物限度检查；应用

前言：

中和法即在所用的稀释剂和培养基中加入一定量的中和剂和灭活剂,使其抑菌力得到消除的方法,在《中国药典》2010年版中,凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品可以选用此方法。胡文红等［1］采用0.1mol/LMnSO4溶液作为中和剂来进行氟喹诺酮类药物的无菌及微生物限度检查。张光华等［2］用3%聚山梨酯80%和0.3%蛋黄卵磷脂作为中和剂来进行化学药的微生物限度检查,可明显降低药品的抑菌性。孙伟等［3］用β-环糊精作为中和剂来消除喹诺酮类抗生素药品抑菌活性,解决该类药品微生物限度检查方法建立困难问题。在中华人民共和国国家标准GB/T24404-2009(即ISO21149:2006)化妆品中需氧嗜温性细菌的检测和记数法［4］中,详细列出了针对防腐剂抑菌活性的中和剂和漂洗剂,较《中国药典》2010年版二部［5］中关于中和剂的选择列表更为详细和全面。

1、材料

1.1样品

①葡萄糖酸氯己定软膏：规格：0.2%；②盐酸多塞平乳膏：规格：10g：0.5g；

③盐酸二甲双胍控释片：规格：0.5g。

1.2试验菌株培养基及试剂

本文所使用菌株均来源于中国药品生物制品检定所,培养基均来源于中国药品生物制品检定所,试剂均来源于国药集团化学集团试剂有限公司。

2、方法参考《中国药典》2010年版二部附录ⅪＪ。

3、结果

3.1葡萄糖酸氯己定软膏

葡萄糖酸氯己定是一种广谱的抑菌剂和杀菌剂,对革兰氏阴性菌,革兰氏阳性

菌及真菌均具有较强的抑制和杀菌作用。在微生物限度检查时,常规法和培养基稀释都无法完全消除其抑菌作用,需选用一定的中和剂消除葡萄糖酸氯己定的抑菌作用才能进行检验。研究人员制备的D/E中和培养基可有效的中和多种有抑菌成分物质的抑菌作用。研究人员采用一定的中和剂对葡萄糖酸锌氯己定乳膏的抑菌作用进行中和,可以满足微生物限度检查回收率的要求。由于本品为软膏剂,因此我们选择了聚山梨酯80和油酸山梨坦作为乳化剂和中和剂来对葡萄糖酸氯己定进行中和,通过对微生物限度检查法的验证,建立其微生物限度检查法。

3.1.1供试品制备

取供试品10g置无菌锥形瓶中,加10g聚山梨酯80和5g油酸山梨坦,缓慢搅拌,并加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,制成1:10供试液。

3.1.2回收率结果

见表1。由表1可见,稀释剂对照组回收率均大于70%,3批样品的试验组回收率均大于70%,符合《中国药典》2010年版二部附录ⅪＪ的要求,因此可以按此方法进行微生物限度检查。

3.1.3控制菌检查

本品对金黄色葡萄球菌仍具有较强的抑制作用,因此采用培养基稀释法进行金黄色葡萄球菌检查,结果见表2。由表2可见,1:10供试液10ml加入到400ml 营养肉汤培养基中,增菌后依法检查,验证试验符合规定。

3.2盐酸多塞平乳膏

盐酸多塞平具有阻断H1和H2受体的作用,同时也是胆碱能受体和肾上腺素受体拮抗剂,用于慢性单纯性苔癣,局限性瘙痒症,恶急性、慢性湿疹及异位性皮炎引起的瘙痒。

3.2.1供试品制备

取本品10g,加10g吐温80,缓慢搅拌加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,制成1:10供试液。

3.2.2回收率结果

本品按常规法进行检验,细菌的回收率达不到70%,特别对金黄色葡萄球菌抑菌能力更强,本品为乳膏剂,加入聚山梨酯80后,溶解更完全,因此加入10%聚山梨

酯80即作为乳化剂同时作为中和剂,回收率试验结果见表3。

由表3可见,3批样品的试验组回收率均大于70%,符合药典要求,因此可按此方法进行微生物限度检查。

3.3盐酸二甲双胍控释片

盐酸二甲双胍控释片用于治疗2型糖尿病和高胰岛素血症,其结构为1,1-二甲基双胍盐酸盐。3.3.1供试品制备

①常规法；②培养基稀释法：0.2ml/皿；③中和法1:加入含0.3%卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液；④中和法2：加入含0.7%卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml；⑤中和法3：加入10g聚山梨酯80；⑥中和法4：加入含3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液；

⑦中和法5：加入含3%聚山梨酯80、0.3%卵磷脂及0.1%盐酸组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

3.3.2回收率结果

按上述7种方法对样品进行微生物限度验证试验,供试品对照组均无菌生长,回收率结果见表4。

由表4可见,本品的抑菌能力较强,常规法5种菌株均未见生长,培养基稀释法的细菌抑制能力仍较强。本品为双胍类,在《中国药典》2010年版二部附录ⅪＪ中和法中,双胍类药品的中和剂为卵磷脂,因此我们考虑用0.3%和0.7%两个浓度的卵磷脂作为中和剂进行中和；同时考虑到聚山梨酯80的中和作用较强,因此也考察了10%聚山梨酯80的中和作用；在美国药典和欧洲药典普遍采用3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂联合使用,以及3%聚山梨酯80、0.3%卵磷脂和0.1%盐酸组氨酸联合使用,我们也同时进行了考察。结果中和法1~3,5种菌株的回收率均未达到要求,中和法4的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率达不到要求,只有中和法5回收率均可达到要求,因此选择此方法进行微生物限度检查。

4、讨论

4.1聚山梨酯80为O/W型乳化剂,油酸山梨坦为反型乳化剂(W/O型),它们在与药物混合后,可将其包裹在内部,因此降低了与菌体的接触,因此可对药物的抑菌能力得到中和。

4.2对于乳膏剂和软膏剂,在溶解的时候可加入一定量的聚山梨酯80,不仅促进样品的溶解,而且对样品的中和效果较好,聚山梨酯80对于季胺类化合物、酚