脐带间充质干细胞的
脐带间充质干细胞制备操作规程
1.制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。
去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。
充分剪碎后平分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。
静置培养7天。
第8天根据生长情况，进行换液、传代。
2.换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。
用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。
3.传代：每瓶加0.25%胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液（2％FBS+a-MEM）10ml，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml 生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中。
1200rpm，离心6min，弃上清。
合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数。
根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2×104/ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养。
4.收获：每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。
1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。
加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。
弃上清，离心沉淀用2.5mlFBS悬浮，再缓慢加入2.5ml 冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。
冻存细胞数应控制在2~5×106/ml 范围内。
利用程序降温盒放置-80℃医用冰箱中过夜后转至液氮罐。
脐带间充质干细胞
脐带间充质干细胞新生儿脐带组织——脐带间充质干细胞脐带间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。
脐带间充质干细胞的特性：间充质干细胞是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞。
间充质干细胞具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。
脐带间充质干细胞的分化能力：间充质干细胞具有向多种类型细胞分化的能力，可以分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种细胞。
这种多向分化的能力给人类多种疾病的治疗提供了重要的原材料。
脐带间充质干细胞的取材：脐带间充质干细胞来源于新生儿脐带华通氏胶，取材方便，体外增殖能力强。
一根脐带提取的间充质干细胞的数量相当于成人5000毫升骨髓中的间充质干细胞数量，且质量优、活性高、更纯净，可多次使用，是理想的间充质干细胞来源。
脐带间充质干细胞的分离培养：1. 取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净后，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织。
2. 将所得组织充分剪碎至1 mm3大小，加入α-MEM培养液置于37℃，5%的CO2培养箱培养，培养液中含10% FBS，100U/ml 青霉素，100U/ml链霉素。
3. 脐带组织培养5-7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，4. 一周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。
间充质干细胞临床应用美国FDA已批准了近60项临床试验，主要包括以下几个方面：1）造血干细胞移植：增强造血功能；促使造血干细胞移植物的植入；治疗移植物抗宿主病。
2）组织损伤的修复：骨、软骨、关节损伤、心脏损伤；肝脏损伤；脊髓损伤和神经系统疾病。
3）自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、硬皮病、炎性肠炎等。
人脐带间充质干细胞操作规范
人脐带间充质干细胞操作规范一、人脐带间充质干细胞的分离和培养1.准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2，有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 XXX;2.在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精;3.将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1#培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血。
4.将脐带转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 XXX;5.将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿);6.用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿。
7.将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min。
8.弃上清液，将胶体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中;9.以0.5 ml/瓶的量将胶体构造块接种至T75培养瓶，每瓶插手4 ml脐带有血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/mlbFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀;10.第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动);11.培养14天左右，倒去上清培养液，加心理盐水(3 ml/瓶)洗濯，用0.25%胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及构造块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化;12.收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min;13.弃上清液，插手适当心理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除构造块，即得到P0代脐带间充质干细胞;614.细胞计数，按10/瓶接种，每瓶插手10 ml脐带无血清培养液UltraCULTURE + 2% XXX 1% Glutamine + 1% MEM NAA)，每3天换一次液。
脐带间充质干细胞制备原理
脐带间充质干细胞制备原理一、概述脐带间充质干细胞（Wharton's jelly mesenchymal stem cells，WJ-MSCs）是一种来源于新生儿脐带的干细胞。
与其他来源的干细胞相比，WJ-MSCs具有易于获取、无伦理争议、低免疫原性和多向分化潜能等优点，因此在临床应用中具有广泛的前景。
本文将就WJ-MSCs制备原理进行详细介绍。
二、脐带间充质干细胞的来源脐带是连接胎盘和新生儿的管道，其中包含了丰富的干细胞资源。
在脐带中，除了血液造血干细胞外，还存在着一种特殊类型的干细胞——脐带间充质干细胞。
这种干细胞主要存在于脐带Wharton's jelly （WJ）中，与周围组织隔离。
三、WJ-MSCs制备方法1. 脐带获取制备WJ-MSCs首先需要获取新生儿脐带组织。
通常情况下，在新生儿出生后不久即可进行采集。
采集过程中需要注意消毒和无菌操作。
2. 分离WJ组织将采集到的脐带组织进行分离，去除血管和外层膜等部分，得到WJ组织。
WJ组织是一种透明的胶状物质，通常呈现出白色或浅黄色。
3. 制备单细胞悬液将WJ组织切成小块，并加入胶原酶等消化酶进行消化。
消化后，用PBS等缓冲液洗涤多次，最后制备成单细胞悬液。
4. 培养和扩增将制备好的单细胞悬液接种在干细胞培养基中，并放置于37℃、5% CO2的培养箱内进行培养和扩增。
在培养过程中需要定期更换培养基，并对干细胞进行观察和评估。
5. 鉴定和纯化经过一段时间的培养，可以通过流式细胞术等方法对干细胞进行鉴定和纯化。
通常情况下，WJ-MSCs表达CD73、CD90、CD105等特征性标志物，并且不表达CD34、CD45等血液细胞特征性标志物。
6. 冻存经过纯化和鉴定后，WJ-MSCs可以进行冻存。
在冻存过程中需要使用特殊的冻存液，并在低温下保存。
四、WJ-MSCs的应用前景WJ-MSCs具有广泛的应用前景。
目前已经有多项临床试验显示，WJ-MSCs可以用于治疗多种疾病，如心血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病等。
脐带间充质干细胞培养方法
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection.2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, /sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days.（二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged.(三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。
脐带间充质干细胞
脐带间充质干细胞扩增培养方法
采用无血清培养基（可含10%受者灭活血清）将 细胞调成悬液，按2×10^4/cm^2接种于培养 瓶， 37℃、5%的CO2条件下培养4d后全量换液， 吸弃非贴壁细胞。每3d换液，细胞覆盖瓶底80% 时，0.25%胰蛋白酶-1mmol/L EDTA消化，按1： 3传代。培养3周左右，胰酶消化细胞，细胞悬液 2000r/min离心5min，弃上清后加入生理盐水混匀， 2000r/min离心5min，重复2次。
脐带间充质干细胞培养结果
新分离的脐带单个核细胞呈纺锤形
原代培养6h后有大量细胞贴壁，贴 壁细胞呈梭形、多角形
培养7天细胞呈长梭形，细胞平行或 漩涡状排列。培养10天细胞可达 80%融合。传代后的细胞形态无明显 改变，排列更加整齐。
脐带间充质干细胞在临床上的应用
1.能具有较强的免疫调节作用，可用于治疗 红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病，降 低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提 高细胞或器官移植的成功率。
酶消化法
培养方法
组织块贴壁法
酶消化法
• 去除血管，将脐带组织剪成1~3cm大小组织块， 用无血清培养基洗2次，将组织浸泡在0.1%胶原 酶中，37℃消化4~6小时。加入生理盐水（消化 液体积的2倍），2000r/min离心5min，弃上清， 加入2.5%胰蛋白酶，37℃处理30min，加入生理 盐水（消化液体积的2倍），100目滤网过滤，滤 液2000r/min离心5min，弃上清。重复两次。细胞 计数，将细胞调成一定浓度用于培养。
组织块贴壁法
• 取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净后，用剪刀镊 子剔去血管，剥出里面的华通氏胶，将所得组织 充分剪碎至1 mm^3大小，加入α-MEM培养液置 于37℃，5%的CO2培养箱培养，培养液中含10% FBS，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。脐带组 织培养5-7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬 出，形态呈细小的梭形，一周后，细胞开始迅速 增殖，形成大小不等的细胞集落。
脐带间充质干细胞PPT
分离与培养技术
01
02
03
酶消化法
使用特定的酶如胶原酶、 胰酶等分解脐带组织，释 放出间充质干细胞。
组织块贴壁法
将脐带组织切割成小块， 贴壁培养，让间充质干细 胞从组织块中爬出并扩增。
流式细胞术分离法
利用间充质干细胞的表面 标记物，通过特定的抗体 进行免疫分离。
诱导分化与基因编辑
再生医学
组织工程
脐带间充质干细胞具有多向分化潜能，可诱导分化为多种组 织细胞，如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。在组织工程领 域，可用于构建人工组织器官，为器官移植提供新的来源。
损伤修复与再生
脐带间充质干细胞可分泌多种生长因子和细胞因子，具有促 进损伤组织修复和再生的能力。在损伤修复领域，可用于治 疗烧伤、创伤等，促进受损组织的再生与修复。
技术挑战与解决方案
技术挑战
脐带间充质干细胞的分离、培养和分化等技术在实践中仍面临一些技术难题，如低分离效率、低细胞活率等。
解决方案
加强基础研究，深入了解脐带间充质干细胞的生物学特性和调控机制；采用先进的分离和培养技术，提高细胞的 分离效率和活率；加强国际合作，共享技术和资源，推动干细胞技术的进步。
05
脐带间充质干细胞的挑战与解 决方案
伦理挑战与解决方案
伦理挑战
脐带间充质干细胞的研究和应用涉及到伦理问题，如胚胎和胎儿的权益、人类基因编辑 等。
解决方案
建立严格的伦理审查机制，确保研究符合伦理标准；加强公众教育和科普，提高公众对 干细胞研究的认知和理解；尊重和保护受试者的权益，确保研究过程的公正和透明。
社会影响与普及程度
疾病治疗
脐带间充质干细胞在多种疾病的 治疗中展现出巨大潜力，有望为
人脐带间.充质干细胞最适宜培养条件研究
Ｄｅ ｐａ ｒ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｈｕ ｍａ ｎ Ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｐ １ ０ ｇ ｙ， Ｎｉ ｎ ｇ ｂ ｏ Ｃｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｈｅ ａ ｌ ｔ ｈ Ｓ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｎｉ ｎ ｇ ｂ ｏ ３ １ ５１ ０ ４
表面表达 Ｍ Ｓ Ｃ ｓ 相关抗原 Ｃ Ｄ ２ ９ ，但不表达造血细胞相关抗原 Ｃ Ｄ ３ ４ ，表明此种 自脐带 中分离得到并诱 导扩增的成纤 维样细胞 为间充 质干细 胞。结论 ：优化 Ｕ Ｃ Ｍ Ｓ Ｃ ｓ 的培养条件 ，成功地建立稳定 的培养方法 ，可 提高 Ｕ Ｃ Ｍ Ｓ Ｃ ｓ 培养成功率 ，为 Ｕ Ｃ Ｍ Ｓ Ｃ ｓ 的实 验研究 和ｌ 床应用 打下
学 术 探 讨
Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｉ ｃ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ
中 国 民 族 民 间 医 药
Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ ｊ ｏ ｕ ｍａ ｌ ｏ ｆ ｅ ｔ ｈ ｎ ｏ ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ａ ｎ ｄ ｅ ｔ ｈ ｎ ｏ ｐ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｙ ・３ １・
胎儿脐带 ６份 ，分离培养 Ｕ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ ，观察 比较不 同的新鲜程度 、不同分离方法在相同的培养条件下对 Ｕ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ 培养的影响 ，并 对优化条件下 培养的 Ｕ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ 进行扩增 ，评估其贴壁 细胞形成集落数 。对 培养得 到的细胞进行 表面抗原标 志检测及其鉴定 。结果 ：从足月胎儿 新鲜脐带 中采用组织块贴壁的方法 ，在 ５ ％血 清浓度 的 Ｉ ＭＤ Ｍ 培养 基 中，分离 培养 得到 的 Ｕ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ 成 功机 率最 高，且生成 集 落数 最多 为 （ ５ ． ３± ０ ． ２ ８ ） ×１ ０ ／ ０ ． ５ ｃ ｍ脐带组织 ，与双酶法 比较存在明显差异 （ Ｐ＜ ０ ． ０ ０ １ ） ；而胶原 酶法接 种后未见 明显贴壁细胞 。培养 得到 的 Ｕ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ 细胞
脐带间充质干细胞综述转
脐带间充质干细胞概述医学实验班70080103王雪彤脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构，其外被羊膜，内含2条脐动华尔通氏脉、1条脐静脉，在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织胶(WhartonpsJelly),从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(HUMSCs)。
1人脐带间充质干细胞(HUMSCs)的形貌分析：倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞贴壁生长，为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长，低密度时较扁平,密度增加趋于融合时细胞变细长。
扫描电镜下观察呈长条状纤维样，细胞膜表面不光滑，有小结节状物，细胞无明显突起，细胞间无网络状连接。
透射电镜观察核大，不规则，核仁明显，常染色质多，异染色质少，胞浆少。
胞质内细胞器较少，以粗面内质网和线粒体为主，内有大量游离核糖体，部分细胞可见内质网月中胀。
植块法培养获得的人脐带间充质干细胞(X200)例如三代细胞的形态学特征一一人体脐带间充质干细胞离体培养后，培养至第三代。
第三代人脐带间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，见图1,2;并形成毗邻细胞之间的网状连接，见图3;细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，见图4。
2人脐带间充质干细胞(HUMSCs)的生物学特性：HUMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞，是别于两者之间的一类新的多能问充质细胞，它们之间既有联系又有差异。
根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会(theMesenchymalandTissueStemCellCommitteeoftheInternation2alSocietyforCellul arTherapy)制定的最低标准,脐带间充质干细胞(MSCs)需满足以下条件：1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长；2)MSCs表达CD105,CD73和CD90,不表达CD45,CD34,CD14或CD11b,CD79a或CD19和HLA2DR;3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定概述脐带血间充质干细胞（Wharton’s jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一类来源于脐带的干细胞。
WJ-MSCs具有较强的增殖能力、多向分化潜能、免疫调节功能等，是目前研究领域中备受关注的干细胞类型之一。
在该文档中，我们将介绍如何从脐带血样中分离出WJ-MSCs，并进行相关的细胞培养和鉴定。
分离过程脐带血样获取首先需要从人体获得脐带血样。
脐带血样一般可以在婴儿出生后通过脐带穿刺等方式获取。
获取脐带血样需要得到母亲的同意，并通过相关机构进行规范化处理。
分离WJ-MSCs脐带血样获取后，需要将其中的WJ-MSCs进行分离。
具体分离步骤如下： 1.将脐带血样转移至离心管中； 2. 加入相同体积的PBS，并轻轻混合； 3. 通过低速离心分离脐带血样中的血细胞等成分； 4. 取下沉后的WJ组织，加入胶原酶等酶类消化物进行消化，离心分离细胞； 5. 通过细胞培养等方式扩增细胞数量。
细胞培养在分离得到WJ-MSCs之后，需要进行相关的细胞培养。
具体培养步骤如下：1. 将分离得到的WJ-MSCs转移至新的培养皿中； 2. 加入含有10% FBS的DMEM低糖培养基； 3. 定期更换培养基，并记录生长状况。
鉴定方法确定分离的细胞为WJ-MSCs的方法很多，常用的方法如下： #### 形态学鉴定通过显微镜观察细胞形态、吸附能力等，判断细胞是否符合WJ-MSCs的特征。
免疫学鉴定通过使用针对WJ-MSCs标记的分子抗体（如CD73、CD90等）对细胞进行标记，并使用流式细胞仪等方法进行检测。
活力检测通过MTT法、细胞增殖实验等，检测WJ-MSCs是否具备较强的增殖能力。
多向分化鉴定通过对WJ-MSCs进行分化培养，如脂肪细胞培养、软骨细胞培养等，检测WJ-MSCs是否显示多向分化的潜能。
结论通过脐带血样的分离，可以获得WJ-MSCs，并通过相关的培养和鉴定方法，确定其为WJ-MSCs，并进一步应用于生物医学实验中，具有潜在的临床应用前景。
脐带间充质干细胞-是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞,具有来源丰富、免疫原性低等诸多特性
脐带间充质干细胞-是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有来源丰富、免疫原性低、移植后不需应用免疫抑制剂的情况下长期存活等诸多特性脐带间充质干细胞-是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有来源丰富、免疫原性低、移植后不需应用免疫抑制剂的情况下长期存活等诸多特性，为其应用于临床开阔了更好的前景。
学术术语来源---人脐带间充质干细胞生物特性比较：胰酶冷消化和组织块法体外培养文章亮点：1实验创新性地采用胰酶冷消化法培养人脐带间充质干细胞，从细胞形态、生长曲线、细胞表面标记物及诱导分化能力4个方面与传统组织块法比较，为不同需求的科研工作者获得较多的脐带间充质干细胞、更完整的细胞结构及其功能以满足实验要求提供一些资料。
2结果显示组织块法培养原代细胞形态优于胰酶冷消化法，第3代细胞增殖速率显著快于胰酶冷消化法，两种方法获得的脐带间充质干细胞具有相同的表面标志，经诱导后均表达神经干细胞特征性标志物nestin，说明组织块法更适合用于培养脐带间充质干细胞。
关键词：干细胞；脐带脐血干细胞；胰酶冷消化法；组织块法；脐带间充质干细胞；组织工程；生物学特性主题词：脐带；间质干细胞；细胞培养技术；细胞，培养的摘要背景：以往采用胰酶冷消化法培养脐带间充质干细胞的研究较少。
目的：比较两种方法体外培养人脐带间充质干细胞的生物学特性。
方法：采用胰酶冷消化法和组织块法从人脐带中分离、纯化和传代培养人脐带间充质干细胞，记录首次出现贴壁细胞时间及原代培养周期，倒置相差显微镜观察脐带间充质干细胞的形态及生长情况，制作第3代脐带间充质干细胞生长曲线，流式细胞仪分析检测第3代脐带间充质干细胞表面标志的表达，第3代脐带间充质干细胞加入成神经诱导培养基诱导分化第3天行荧光免疫化学染色检测Nestin的表达。
结果与结论：使用上述两种方法均可获得脐带间充质干细胞，胰酶冷消化法首次出现贴壁细胞时间早于组织块法(P < 0.05)；原代培养周期差异无显著性意义(P > 0.05)。
脐带间充质干细胞制备操作规程
1.制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。
去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。
充分剪碎后平分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。
静置培养7天。
第8天根据生长情况，进行换液、传代。
2.换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。
用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。
3.传代：每瓶加0.25%胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液（2％FBS+a-MEM）10ml，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml 生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中。
1200rpm，离心6min，弃上清。
合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数。
根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2×104/ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养。
4.收获：每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。
1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。
加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。
弃上清，离心沉淀用2.5mlFBS悬浮，再缓慢加入2.5ml 冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。
冻存细胞数应控制在2~5×106/ml 范围内。
利用程序降温盒放置-80℃医用冰箱中过夜后转至液氮罐。
人脐带间充质干细胞国际细胞治疗协会定义的标准
人脐带间充质干细胞国际细胞治疗协会定义的标准人脐带间充质干细胞国际细胞治疗协会定义的标准1. 引言人脐带间充质干细胞（Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells，WJ-MSCs）是一种被广泛研究和应用的干细胞资源。
作为这个领域的重要组成部分，人脐带间充质干细胞国际细胞治疗协会（International Society for Cell & Gene Therapy）制定了一系列标准来定义人脐带间充质干细胞，这些标准不仅对于科学研究具有重要意义，同时也对于临床应用和治疗效果的评估至关重要。
2. WHO 推行的初衷和原则人脐带间充质干细胞国际细胞治疗协会的标准旨在确保干细胞的质量和安全性，以便更好地应用于细胞治疗领域。
这些标准不仅限定了干细胞的来源和特性，还包括细胞处理和存储的要求等。
通过制定这些标准，国际细胞治疗协会为临床研究和细胞治疗的发展提供了指导。
3. 人脐带间充质干细胞定义的关键指标根据国际细胞治疗协会的定义，人脐带间充质干细胞可以通过以下几个关键指标来判断：a. 来源：主要来源于脐带的Wharton's jelly组织，这是一种丰富而易获得的干细胞来源。
b. 表面标记：表达特定的免疫表面标记，如CD73、CD90、CD105等，并且不表达CD34、CD45等造血干细胞标记。
c. 多向分化潜能：具有分化为多种细胞类型的潜能，如骨、脂肪、软骨等。
d. 免疫抑制能力：具有调节免疫功能，可以抑制免疫反应和自身免疫性疾病等。
e. 活力和增殖能力：繁殖能力强，能够长时间维持干细胞特性。
4. 临床应用和治疗效果评估根据人脐带间充质干细胞的定义标准，科研人员和临床医生可以更好地评估细胞治疗的效果和潜在风险。
这些标准也为细胞治疗产品的质量控制和监管提供了依据，确保细胞治疗的安全性和可行性。
5. 对于干细胞研究和应用的启示人脐带间充质干细胞国际细胞治疗协会定义的标准，不仅适用于人脐带间充质干细胞，也为其他干细胞类型的研究和应用提供了借鉴。
脐带间充质干细胞制备存储标准
脐带间充质干细胞制备存储标准脐带间充质干细胞（Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells，WJ-MSCs）是一种来源于脐带的多潜能干细胞，具有广泛的临床应用前景。
为了确保脐带间充质干细胞的制备和存储质量，制定脐带间充质干细胞制备存储标准非常重要。
脐带间充质干细胞的制备和存储标准应包括以下几个方面：1.取材标准：脐带是脐带间充质干细胞的主要来源，因此在制备和存储过程中需要确保脐带的质量。
取材时，应确保脐带来自经过筛选和检测的健康母亲，脐带的无菌处理应符合相关规定。
2.分离和培养标准：脐带间充质干细胞的分离和培养是制备过程中的关键步骤。
应采用符合相关规定的分离和培养方法，确保脐带间充质干细胞能够获得最佳生长和增殖环境。
3.鉴定标准：在制备过程中，需要对脐带间充质干细胞进行鉴定。
鉴定标准可以包括表面标记物的检测、多向分化潜能的检测等指标，以确保制备的细胞具有干细胞的特性。
4.冻存标准：为了确保脐带间充质干细胞的长期保存，应采用合适的冻存方法和条件。
冻存标准可以包括冷冻液的选择、冷冻速率的控制、冷冻样品的保存温度等指标。
5.质量控制标准：脐带间充质干细胞的制备和存储过程中应进行严格的质量控制。
质量控制标准可以包括细胞数目的检测、细胞活力的检测、无菌检测等项目，以确保制备的细胞符合质量要求。
在制定脐带间充质干细胞制备存储标准时，需要参考国内外相关的法规和标准。
同时，制定标准时需要考虑到国内的实际情况和相关研究的最新进展。
制定标准应充分结合实际情况和科学研究，确保标准的可行性和科学性。
脐带间充质干细胞的制备和存储标准对于保证脐带间充质干细胞的质量和应用的安全性具有重要意义。
符合标准的脐带间充质干细胞可以应用于临床医学领域，对于治疗一些疾病和促进组织再生具有重要的作用。
因此，制定脐带间充质干细胞制备存储标准是当务之急，对于推动相关领域的研究和应用具有重要的意义。
小鼠脐间带充质干细胞培养方法
小鼠脐间带充质干细胞培养方法引言充质干细胞（me se nc h ym al st em ce ll s，M SC s）是一类具有多向分化潜能的多能干细胞，具有广泛的应用前景。
在生物医学领域，小鼠脐间带充质干细胞是一种重要的来源之一。
本文将介绍小鼠脐间带充质干细胞的培养方法，帮助研究人员更好地利用这一珍贵的细胞资源。
原料与试剂准备1.小鼠脐带组织2.DM EM/F12培养基3.胎牛血清（F BS）4.细胞培养袋5.1×PB S缓冲液步骤1.小鼠脐带的处理（1）准备一个无菌操作台，并在工作区上喷洒酒精消毒剂，手套等工具也需要经过灭菌处理。
（2）取出小鼠脐带组织，置于无菌的1×P BS缓冲液中，用剪刀剪碎细胞片段。
（3）将小鼠脐带组织片段转移到细胞培养袋中。
（4）加入适量的DME M/F12培养基，保证组织片段被完全浸润。
（5）将细胞培养袋密封，并置于37°C恒温培养箱中，进行消化和悬浮培养，时间约为4-6小时。
2.细胞的收获和培养（1）将消化后的细胞悬液通过100μm的细胞滤网过滤，去除大颗粒残渣。
（2）将滤液离心，去除上清液，沉淀的细胞用DM EM/F12培养基洗涤。
（3）将洗涤后的细胞沉淀用适量的D MEM/F12培养基重新悬浮。
（4）将细胞悬液转移到细胞培养瓶中，每瓶加入适量的培养基和10%的F BS。
（5）将细胞培养瓶放置于37°C恒温培养箱中，进行培养。
（6）每2-3天更换一次培养基，保持细胞的健康生长。
3.细胞的传代与冻存（1）当细胞达到80-90%的密度时，将培养瓶内的细胞用1×P BS缓冲液洗涤。
（2）用胰酶对细胞进行消化，停止细胞的生长。
（3）加入适量的DME M/F12培养基，将细胞悬液转移到新的细胞培养瓶中。
（4）将细胞培养瓶放置于恒温培养箱中继续培养。
4.脐带间充质干细胞的鉴定（1）使用流式细胞仪对培养的小鼠脐带间充质干细胞进行免疫鉴定。
人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取、鉴定和蛋白组学分析
人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取、鉴定和蛋白组学分析摘要：目的：探讨人脐带间充质干细胞来源外泌体进行提取鉴定和蛋白组学。
方法：培养人脐带间充质干细胞并采用超滤序贯超离法提取外泌体，通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、蛋白质定量、蛋白质印迹法及蛋白组学分析等技术鉴定。
结果①所抽取的外泌体分散度比较好，而且均匀。
②，外泌体粒径分布的高峰为（129.5+8.7) nm，它的膜表面是带有负电荷的，其浓度为8.375>109颗粒/ml，平均 zeta电位为（-28.1+3.6) mV。
③ 外泌体中存在着一类特殊的膜蛋白，即CD9,CD63等。
④蛋白质组学研究发现外泌体中的大部分蛋白都具有较高的活性，它们涉及到 RNA剪接、 mRNA加工、蛋白质折叠等生物学过程，涉及到 RNA/DNA等基因材料的合成、加工、降解等过程。
结论：经研究发现，人脐带间充质干细胞外泌体与其母系细胞存在某种“同质”、“差别”，且这些“差别”的蛋白质功能与其自身的免疫学特性都不相关，从而证实人脐带间充质干细胞外泌体具有较小的免疫学活性及较高的安全性。
关键词：人脐带间充质干细胞；外泌体;蛋白组学:免疫原性引言：间充质干细胞起源于中胚层，它是一种能够在各种组织中进行定向分裂并进行自身增生的干细胞，它可以从各种组织中被提取，比如脐带、子宫内膜息肉、月经期血液、骨髓、脂肪组织等，由于它的来源多样化，并且可以大规模地获取，所以它在实验和临床上都有着非常重要的研究价值。
本课题拟通过分离人脐带间充质干细胞源性外泌体，并通过比较两者的蛋白质组水平上的差别，验证其在体外的免疫活性，进而验证其在临床上的应用前景，并评估其在临床应用中的应用前景。
一、资料与方法1.1一般资料选取本企业2021年8月至2022年8月该时间段接受人脐带充质干细胞来源外泌体进行提取鉴定和蛋白组学分析的足月产新生儿脐带50例。
1.2方法1．2.1人脐带间充质干细胞培养及鉴定(1)人脐带充质干细胞的原代培养法：6小时之内，对所收集的脐带进行清洗，并将其两侧有瘀斑或瘀斑的部位，用 PBS对其周边及脐静脉进行彻底的清洗，并将其切割为1毫米×1毫米×1毫米的小段，并将其放置在18 wt的 DMEM全培养剂（Rh)+1 wt青链霉索 V+ DMEN （DMEM）浸润的T75玻璃瓶底部，底部向上，放置在37℃，5%体积分数的 DMEM全培养剂（DMEM）浸润的玻璃瓶中，2小时后将玻璃杯倒置，倒入5 mL DMEM全培养剂，第2日再更换玻璃杯，并用2 mL TrypL酶解，使其达到70%-80%的水平，按1:4的比例进行传代，获取生长良好3-6代细胞。
脐带间充质干细胞PPT
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6
工艺流程简介
供者筛选
采集
接收
制备
发培放养
复苏
冻存
培养
制剂运与输发放
临床应用
信息反馈
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7
如何对脐带干细胞进行质量控制的？
❖ 1）严格控制脐带运输条件； ❖ 2）脐带采集液进行病原微生物检测； ❖ 3）细胞冷冻前进行病原微生物检测和细胞生物学
功能检测； ❖ 4）细胞储存过程中定期对储存环境进行监测； ❖ 5）临床使用前对细胞进行严格检测； ❖ 6）对与细胞制造有关的人员、设备、原材料、方
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间充质干细胞质量要求
❖ 细菌检测 ❖ 内毒素检测 ❖ 革兰氏检测 ❖ 支原体检测 ❖ 流式检测 ❖ 活性检测≥90%
阴性
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细胞发放
❖ 1.细胞的保存：生理盐水（含人血白蛋白） ❖ 2.运输要求：时间、温度 ❖ 3.病人信息填写完整 ❖ 4.样本检测合格
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间充质干细胞移植途径
❖ 腰穿途径 ❖ 静脉途径 ❖ 局部种植 ❖ 介入途径
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前景
❖ 干细胞治疗是继药物治疗、手术治疗之后的又一场 医疗革命。目前，发达国家已经开始将干细胞治疗 技术用于临床治疗自身免疫性疾病、心肌梗死、脊 髓损伤、心力衰竭等疾病。
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谢谢
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法和环境按照相应的标准进行严格控制。
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供者筛选
❖ 供者需要提供供者的既往病史、 现病史、家族史等资料。
❖ 经过一系列病原微生物检测，检 测合格后进入制备程序。
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绵羊脐带间充质干细胞的分离、体外培养及诱导分化
绵 羊脐 带 问充 质 干细 胞 的分 离 、 外培 养及 诱 导 分化 体
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脐带间充质干细胞
脐带间充质干细胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。
目录
1概念
2优势
3分离培养
4用途
5干细胞研究
▪期刊简介
▪研究对象
▪研究内容
1概念
脐带间充质干细胞是以人脐带血血清为主体的培养体系的脐带间充质干细胞培养扩增的方法：流式细胞仪检测结果显示，贴壁细胞均表达CD44、CD29，低表达CD106，不表达造血细胞表型CD14、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31，
也不表达HLA-DR：细胞倍增时间为30h，细胞周期分析表明，G0～G1期和+G2+M期所占比例分别为78.84%和11.16%。
结论：应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞，培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性，为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据。
2优势
脐带间充质干细胞（MSCs）具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。
它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。
有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低[1]，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。
干细胞的培养体系主要应用含动物血清（如胎牛血清）的培养基，在此种环境下生长的干细胞，其内部结构会发生何种变化尚未可知，为避免含动物血清培养中病毒等病原体污染和异种血清所致的过敏反应，课题组进行了以人脐带血血清为主体的培养体系体外培养扩增脐带间充质干细胞的实验研究。
以探讨人脐带血血清替代动物血清用于培养临床组织工程用干细胞的可行性。
同时研究脐带间充质干细胞形态学、生长特性、细胞周期、免疫表型等特性，旨在建立脐带间充质干细胞的富集方法，为建立脐带间充质干细胞库和临床应用提供有力的理论依据。
[2]
3分离培养
脐带间充质干细胞的获取主要有组织块贴壁法与酶消化法，由于酶对细胞的损伤较大，且细胞得率较低，费用昂贵，因此大多数实验室采取了组织块贴壁法进行培养。
取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净后，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1 mm3大小，加入α-MEM培养液置于37℃，5%的CO2培养箱培养，培养液中含10% FBS，100U/ml青霉素，100U/ml 链霉素。
脐带组织培养5-7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，一周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。
脐带间充质干细胞
4用途
脐带间充质干细胞的主要用途包括：
一、能具有较强的免疫调节作用，可用于治疗红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率；
二、能促进造血恢复功能，与单一造血干细胞移植比较，间充质干细胞和造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等疾病的治疗效果；
三、能修复损伤或病变的组织器官，用于治疗骨和肌肉衰退性疾病、心脑血管疾病、肝病、脑及脊髓神经损伤和老年痴呆等。
四、能在体内或体外通过生物因子定向诱导分化为神经细胞、胰岛素分泌细胞等，从而为帕金森、糖尿病等治疗提供新的治疗方式，是目前干细胞研究的热点之一。
5干细胞研究
期刊简介
《中国组织工程研究》杂志（原《中国组织工程研究与临床康复》）由中华人民共和国卫生部主管，中国康复医学会与《中国组织工程研究与临床康复》杂志社主办。
杂志发表关于干细胞；组织构建；生物材料；骨关节植入物；组织器官细胞移植以及计算机辅助数字化技术的应用基础及临床研究，转化医学和偱证医学研究，发表中国组织工程研究领域一流水平的学术、技术创新成果。
研究对象
胚胎干细胞，脐带干细胞，软骨干细胞，脐血干细胞，羊膜干细胞，羊水干细胞，骨髓间充质干细胞，造血干细胞，肿瘤干细胞，精原干细胞，生殖干细胞，成骨干细胞，肌肉干细胞，神经干细胞，脂肪干细胞，心脏干细胞，气管干细胞，肝脏干细胞，胰腺干细胞，胃肠干细胞，内皮干细胞，角膜干细胞，皮肤干细胞，毛囊干细胞，乳腺干细胞，前列腺干细胞，涎腺干细胞等干细胞相关基础与临床研究成果，以及血液疾病的造血干细胞移植相关问题……
研究内容
干细胞研究的生物学特性、培养与分化、诱导技术、干细胞与微环境、干细胞与微小RNA调节、干细胞因子及相关因子、干细胞表型与鉴定、干细胞移植与免疫耐受、细胞移植与基因表达、细胞编程与表观遗传、干细胞保存与质量、干细胞实验动物模型等学术和技术的热点问题。