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不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。
应用
Regenerative ability
Cell differentiation
Ontogenic processes
Organogenesis
Somatic genetics
Protoplast system
Cell physiology
Cell fusion
❖ 亚原生质体(subprotoplast)
在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的减少而形成的一 些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。
❖ 核质体(nuclearplast)
由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微 小原生质体。
❖ 胞质体(cytoplast)
0.6mL 0.45M蔗糖
含原生 ❖ 优点：可以收集到数 质体带 量较大的纯净原生质
体，同时避免收集过
不连续梯度法
程中原生质体因相互 挤压而破碎。
原生质体鉴定
❖ 低渗爆破法 ❖ 荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%)
原生质体活力测定
❖ 形态识别
形态完整、富含 细胞质、颜色新 鲜的正常球形， 放入低渗溶液中， 可正常膨大。
❖ 渗透压稳定剂 ❖ 质膜稳定剂 ❖ 分离条件：
Protoplast
飘浮法
❖ 采用比原生质体密度大的高渗溶液 （蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生 质体漂浮在液体表层的纯化方法。
❖ 优点：
可以避免分离的原生质体因震荡被 组织碎片撞击而破损。
所用药品简单，成本低。
❖ 缺点及补救措施：
对离心力要求比较严格，掌握不好， 原生质体则不易漂浮。可采用不同浓 度和不同离心速度分次漂浮的方法。
酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁的混合
等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞 壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。
❖ 常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、 崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶 [Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。
酶
用于分离原生质体的材料
材料预处理
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某 些材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4℃处理较好。 ☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才 能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体， 才能获得高产量。
原生质体分离的方法
Ltd., Tokyo, Japan
黑曲霉 Rohm and Hass Co.,
Rhiladelphia, UAS
酶解法的优缺点
❖ 优点：获得量大，适用广泛。 ❖ 缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、
过氧化物酶以及酚类物质。 会影响所获原生质体的活力。
原生质体纯化的方法
漂浮法 沉降法 不连续梯度法
来源
生ห้องสมุดไป่ตู้厂家
纤维素酶类
Onozuka R-10 Cellulysin
绿色木霉 绿色木霉
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
Calbiochem.,San Diego,CA 92037, USA
Driselase
Irpex lutens
Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo,Japan
沉降法
❖ 利用比重原理，在具有一定渗透压的溶 液中，先进行过滤然后低速离心，使纯 净完整的原生质体沉积于试管底部。
❖ 优缺点：
纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互
挤压，常引起原生质体的破碎。
12mL
0.45M 甘露醇
碎片带
❖ 又称界面法，采用两 种密度不同的溶液形 成不连续梯度，通过 离心使原生质体与破 损细胞分别处于不同 液相中，从而纯化原 生质体的方法。
Organelle, DNA uptake
Cell cloning
意义
❖ 植物细胞育种中的核质替换 ❖ 细胞质杂种的获得 ❖ 远缘杂交创造新物种细胞 ❖ 细胞器的互作研究
植物原生质体的分离和培养
Flash
❖ 材料预处理 ❖ 原生质体分离的方法 ❖ 原生质体纯化 ❖ 原生质体活力测定 ❖ 影响原生质体数量和活力的因素 ❖ 原生质体培养方法 ❖ 影响原生质体培养的因素 ❖ 原生质体再生过程
第七章 植物原生质体的分离与培 养
• 7.1原生质体培养的意义及分离技术—原生质体制备 • 7.2原生质体的培养与植株再生，原生质体的融合及体细 • 胞杂种的鉴定与筛选
植物原生质体培养和细胞融合
概念及研究进展 原生质体的分离与培养
原生质体融合
第一节 原生质体培养的意义及分离技术
原生质体(protoplast)： 脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球 原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。
酶
来源
生产厂家
果胶酶类
Macerozyme R-10
Pectinase Pectolyase Y-23
半纤维素酶 RhozymeHP-150
根霉
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
黑曲霉 Sigma Chemical Co.
黑曲霉 Seishin Pharm. Co.
酶解分离法 机械分 离 法
机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预
处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体 收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤 口处可释放出完整的原生质体。
❖ 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少， 能够用此法产生原生质体的植物种类受到 限制。
❖ 优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的 破坏作用。
原生质体活力测定
❖ 荧光显微镜识别(FDA法)
FDA (fluorescein diacetate) 本身不发荧光也不具有 极性，能自由穿过细胞 质膜。活细胞内FDA可 以被酯酶裂解，将能发 荧光的极性部分释放出 来。荧光素则不能自由 穿越质膜，在完整的活 细胞内积累。
使用浓度： 0.01%
原生质体活力测定
❖ 酚藏花红染色法（0.1%) 酚藏花红能使无活力的原 生质体染成红色，有活力 的原生质体不着色。
❖ 伊凡蓝(Evan’s blue)染色法(0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能 够摄取这种染料，活细胞不摄取。
影响原生质体数量和活力的因素
❖ 供试材料及预处理方法 ❖ 酶解条件：
酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度
应用
Regenerative ability
Cell differentiation
Ontogenic processes
Organogenesis
Somatic genetics
Protoplast system
Cell physiology
Cell fusion
❖ 亚原生质体(subprotoplast)
在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的减少而形成的一 些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。
❖ 核质体(nuclearplast)
由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微 小原生质体。
❖ 胞质体(cytoplast)
0.6mL 0.45M蔗糖
含原生 ❖ 优点：可以收集到数 质体带 量较大的纯净原生质
体，同时避免收集过
不连续梯度法
程中原生质体因相互 挤压而破碎。
原生质体鉴定
❖ 低渗爆破法 ❖ 荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%)
原生质体活力测定
❖ 形态识别
形态完整、富含 细胞质、颜色新 鲜的正常球形， 放入低渗溶液中， 可正常膨大。
❖ 渗透压稳定剂 ❖ 质膜稳定剂 ❖ 分离条件：
Protoplast
飘浮法
❖ 采用比原生质体密度大的高渗溶液 （蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生 质体漂浮在液体表层的纯化方法。
❖ 优点：
可以避免分离的原生质体因震荡被 组织碎片撞击而破损。
所用药品简单，成本低。
❖ 缺点及补救措施：
对离心力要求比较严格，掌握不好， 原生质体则不易漂浮。可采用不同浓 度和不同离心速度分次漂浮的方法。
酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁的混合
等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞 壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。
❖ 常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、 崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶 [Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。
酶
用于分离原生质体的材料
材料预处理
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某 些材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4℃处理较好。 ☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才 能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体， 才能获得高产量。
原生质体分离的方法
Ltd., Tokyo, Japan
黑曲霉 Rohm and Hass Co.,
Rhiladelphia, UAS
酶解法的优缺点
❖ 优点：获得量大，适用广泛。 ❖ 缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、
过氧化物酶以及酚类物质。 会影响所获原生质体的活力。
原生质体纯化的方法
漂浮法 沉降法 不连续梯度法
来源
生ห้องสมุดไป่ตู้厂家
纤维素酶类
Onozuka R-10 Cellulysin
绿色木霉 绿色木霉
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
Calbiochem.,San Diego,CA 92037, USA
Driselase
Irpex lutens
Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo,Japan
沉降法
❖ 利用比重原理，在具有一定渗透压的溶 液中，先进行过滤然后低速离心，使纯 净完整的原生质体沉积于试管底部。
❖ 优缺点：
纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互
挤压，常引起原生质体的破碎。
12mL
0.45M 甘露醇
碎片带
❖ 又称界面法，采用两 种密度不同的溶液形 成不连续梯度，通过 离心使原生质体与破 损细胞分别处于不同 液相中，从而纯化原 生质体的方法。
Organelle, DNA uptake
Cell cloning
意义
❖ 植物细胞育种中的核质替换 ❖ 细胞质杂种的获得 ❖ 远缘杂交创造新物种细胞 ❖ 细胞器的互作研究
植物原生质体的分离和培养
Flash
❖ 材料预处理 ❖ 原生质体分离的方法 ❖ 原生质体纯化 ❖ 原生质体活力测定 ❖ 影响原生质体数量和活力的因素 ❖ 原生质体培养方法 ❖ 影响原生质体培养的因素 ❖ 原生质体再生过程
第七章 植物原生质体的分离与培 养
• 7.1原生质体培养的意义及分离技术—原生质体制备 • 7.2原生质体的培养与植株再生，原生质体的融合及体细 • 胞杂种的鉴定与筛选
植物原生质体培养和细胞融合
概念及研究进展 原生质体的分离与培养
原生质体融合
第一节 原生质体培养的意义及分离技术
原生质体(protoplast)： 脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球 原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。
酶
来源
生产厂家
果胶酶类
Macerozyme R-10
Pectinase Pectolyase Y-23
半纤维素酶 RhozymeHP-150
根霉
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
黑曲霉 Sigma Chemical Co.
黑曲霉 Seishin Pharm. Co.
酶解分离法 机械分 离 法
机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预
处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体 收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤 口处可释放出完整的原生质体。
❖ 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少， 能够用此法产生原生质体的植物种类受到 限制。
❖ 优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的 破坏作用。
原生质体活力测定
❖ 荧光显微镜识别(FDA法)
FDA (fluorescein diacetate) 本身不发荧光也不具有 极性，能自由穿过细胞 质膜。活细胞内FDA可 以被酯酶裂解，将能发 荧光的极性部分释放出 来。荧光素则不能自由 穿越质膜，在完整的活 细胞内积累。
使用浓度： 0.01%
原生质体活力测定
❖ 酚藏花红染色法（0.1%) 酚藏花红能使无活力的原 生质体染成红色，有活力 的原生质体不着色。
❖ 伊凡蓝(Evan’s blue)染色法(0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能 够摄取这种染料，活细胞不摄取。
影响原生质体数量和活力的因素
❖ 供试材料及预处理方法 ❖ 酶解条件：
酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度