植物原生质体组织培养精品PPT课件
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植物原生质体培养(PPT)
杨树原生质体培养植株再生
Liquid MS+5 M 2,4-D;
MS+10 M KT or 1 M TDZ.
杨树原生质体培养植株再生
1/2 MS
原生质体的培养方法
•1. 液体浅层培养
将含原生质体的培养液倒入培养皿底部， 使其成一薄层，封口后进行培养。
含原生质体的液体 培养基
特点： 操作简单，对原生质体的损伤小； 容易添加新鲜培养基和转移培养物；
材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶 解液。
一般在25±2℃、黑暗中酶解，期间轻 轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。 酶解时间因材料而异，2小时~十几小时。
苜蓿叶片的酶解法分 离原生质体
三、原生质体的收集与纯化
1. 过滤：酶解结束后，将酶解物通过孔径为2080µm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组 织块和细胞团。
苜蓿叶片原 生质体的纯 化
完整的原生质体
5. 收集原生质体：
完整的原生质体
四、原生质体活力的测定
原生质体活力的高低对后来的原生质 体培养和融合影响极大。原生质体分离 过程中的任何一个步骤都会影响到原生 质体的活力，因此，必须十分小心。测 定原生质体活力的方法常用荧光素双醋 酸酯（FDA）染色法。
2. 离 心 ： 滤 液 转 到 离 心 管 中 在 50×g 下 离 心 5min。
3. 反复洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培 养基和原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质 体，再离心。如此反复2-4次，就可以将残留 的酶液去掉。
4. 纯化：用含高浓度（21%）蔗糖的培养基进 行离心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清 液的上部。
一、 材料的选择
用于分离原生质体的植物材料应是细胞分 裂旺盛的材料，如幼嫩小苗的根、胚轴、子
《植物组织培养》课件PPT第1章植物组织培养基本知识
②生长周期短，繁殖率高
由于人为控制培养条件，因此生长较快，一般20—30d为一个周期。植物 材料按几何级数繁殖生产，总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致 的优质种苗或脱病毒种苗。
③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制
植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿 度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利 于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、 田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂 劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。
愈伤组织（callus）:在人工培养基上由外植体上形成的一
团无序生长状态的薄壁细胞。
愈伤组织
二、植物组织培养的类型
• 按培养方法分为 固体培养 液体培养 看护培养 微室培养 包埋培养
二、植物组织培养的类型
3.按培养过程分为：
• 初代培养（Primary culture）(无菌培养物)
将从植物体上分离下来的第一次培养。
4.4 组织及细胞培养生产有用物质
Arregnin和bonner在1950年首先进行了培养橡胶茎愈伤组织获 取橡胶的尝试。
近50年来飞速的发展。从400多种植物培养细胞中分离到600多种 次级代谢产物，其中60多种在含量上超过或等于其原植物，20种 以上干重超过1％。 在日本，人参细胞培养已达130600L发酵罐；德国用1000L发酵罐 培养毛地黄细胞；在我国，人参细胞培养技术也已实现产业化。 利用培养细胞的生物转化能力生产高值化合物，德国科学家进行 了出色的研究。他们在毛地黄细胞的培养中加入生物合成途径的 中间化合物毛地黄毒素和一甲基毛地黄毒素，培养细胞以几乎 100％的转化速率使之羟基化，变为医药强心剂地高辛。
《原生质体育种》课件
化学诱变
使用化学诱变剂处理原生 质体，诱发基因突变，筛 选具有优良性状的新品种 。
细胞融合
将不同物种或同一物种不 同品系的原生质体进行融 合，以获得具有杂种优势 的新品种。
原生质体育种的应用
培育抗逆性强的新品种
改良作物的品质
通过原生质体育种技术，可以筛选出具有 较强抗逆性的新品种，如抗旱、抗寒、抗 盐碱等。
详细描述
物理法包括电融合、激光融合等，这些方法利用物理能量来诱导原生质体的融 合。化学法则是利用化学物质如聚乙二醇等诱导原生质体的融合。这些方法的 选择取决于实验条件和目的。
原生质体融合的应用
总结词
原生质体融合在植物育种、基因工程和生物技术等领 域有广泛的应用。
详细描述
在植物育种方面，原生质体融合可以用于创造新的植物 品种，通过将不同亲本的原生质体融合，可以产生具有 优良性状的杂种细胞，进而培育出新的植物品种。在基 因工程领域，原生质体融合可以用于基因转移和基因编 辑，通过将外源基因导入原生质体，可以实现基因的转 移和表达。此外，原生质体融合还可以用于研究细胞融 合的机制和细胞生物学特性，为生物技术的发展提供重 要的理论支持和实践经验。
现植物的遗传改良。
细胞融合
02
将不同植物的原生质体进行融合，创造新的植物品种或改良现
有品种。
细胞培养生产有用次生代谢产物
03
利用原生质体培养生产具有药用、工业或其他用途的次生代谢
产物。
02
原生质体融合
原生质体融合的定义
总结词
原生质体融合是将两种或多种植物细胞原生质体通过物理或化学方法融合，形成一个杂种细胞的技术 。
原生质体育种
目录
• 原生质体培养 • 原生质体融合 • 原生质体育种技术 • 原生质体育种的优势与挑战 • 原生质体育种案例分析
植物组织培养ppt课件
1946年：罗士韦在菟丝子茎尖培养地观察到花的形成，为试管 受精奠定了基础
1948年：Skoog和崔真培养烟草茎段时，发现腺嘌呤或腺苷可解 除生长素对芽生长的抑制作用。
ppt精选版
42
1952-1953年：美国科学家Steward F.C. 用胡萝卜根的细胞悬浮 培养，发现单个细胞能象受精卵发育成胚一样的途径，发育成完 整植抹，证实了植物细胞全能性学说。
1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获 得无病毒大丽花植株。
1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一 片滤纸，再在滤纸片上放上一 个烟草体细胞，单细胞培养成功。
1956年：Miller分离出Kinetin，Kinetin/激动素
ppt精选版
43
组织培养的奠基人
植物组织培养是由于人为控制培养条件，
根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同
的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比
较小，往往20-30天为一个周期。所以，虽然植 物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于 植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说
成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗
或脱病毒种苗。
细胞全能性的高低：
受精卵>生殖细胞>体细胞
植物细胞>动物细胞
分化程度低的细胞>分化程度高的细胞
细胞分化的实质：基因的选择性表达。
ppt精选版
16
②全能性的表达
少数体细胞在发育过程中可能丢失一部分遗传物质, 因而失去全能性。如筛管细胞,它在发育过程中失去细胞 核,因而没有全能性。
目前还无法使所有的离体植物细胞都实现其全能性。
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3、 迅速发展阶段（1960-1980）
1948年：Skoog和崔真培养烟草茎段时，发现腺嘌呤或腺苷可解 除生长素对芽生长的抑制作用。
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1952-1953年：美国科学家Steward F.C. 用胡萝卜根的细胞悬浮 培养，发现单个细胞能象受精卵发育成胚一样的途径，发育成完 整植抹，证实了植物细胞全能性学说。
1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获 得无病毒大丽花植株。
1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一 片滤纸，再在滤纸片上放上一 个烟草体细胞，单细胞培养成功。
1956年：Miller分离出Kinetin，Kinetin/激动素
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组织培养的奠基人
植物组织培养是由于人为控制培养条件，
根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同
的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比
较小，往往20-30天为一个周期。所以，虽然植 物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于 植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说
成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗
或脱病毒种苗。
细胞全能性的高低：
受精卵>生殖细胞>体细胞
植物细胞>动物细胞
分化程度低的细胞>分化程度高的细胞
细胞分化的实质：基因的选择性表达。
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②全能性的表达
少数体细胞在发育过程中可能丢失一部分遗传物质, 因而失去全能性。如筛管细胞,它在发育过程中失去细胞 核,因而没有全能性。
目前还无法使所有的离体植物细胞都实现其全能性。
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3、 迅速发展阶段（1960-1980）
原生质体培养PPT课件
生质体易受热伤害，易破碎。
5、饲喂培养法 将饲喂的细胞用培养基作平板，此平板称饲喂层，用X
射线或紫外线照射，使核失活但细胞存活，然后将原生质
体以液体浅层培养或平板技术铺在饲喂层上。 特点：以一种植物细胞制成的平板，支持另一种植物 原生质体的生长。饲喂层没有种的特异性。
原 生 质 体 培 养 程 序 示 意 图
原生质体5次。
（6）在载玻片上的材料上，加上一层原生质体生
长所须的培养基
（7）融合百分率计算 融合百分率=融合数目/两亲本原生质体总数 ×100%
完整洋葱原生质体（40×） 完整烟草原生质体 （40×）
PEG PEG法原生质体的融合图示 法原生质体的融合图示
图一烟草叶肉细胞和洋葱根尖 图一烟草叶肉细胞和洋葱根尖 细胞原生质体融合（40×） 细胞原生质体融合（40×）
三、原生质体存活率、密度及产量的测定
（一）双醋酸盐荧光素染色法测定存活率 存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100 （二）测定原生质体的密度
原生质体的密度（个/ml）=（原生质体数/1区域）
×104×稀释倍数
（三）原生质体产量的测定 Y=DV / FW
Y（个/g）——原生质体产量
D（个/ml）——存活原生质体密度 V（ml）——制备所得原生质体悬液的总体积
电融合法原生质体的融合结果
原生质体成串（40×）
原生质体融合（图1）
电融合法原生质体的融合结果
原生质体融合（图2） 原生质体融合（图3）
三、杂种细胞的筛选与鉴定 （一）互补筛选 1、白化互补选择法
2、营养缺陷型互补选择
3、抗性互补选择
4、代谢互补仰制选择
（二）机械分离杂种细胞法法 （三）双荧光标记选择法
植物原生质体组织培养PPT课件
Organogenesis
Somatic genetics
Protoplast system
Cell physiology
Cell fusion
Organelle, DNA uptake
第3页/共83页
Cell cloning
意义
• 植物细胞育种中的核质替换 • 细胞质杂种的获得 • 远缘杂交创造新物种细胞 • 细胞器的互作研究
• 酚藏花红染色法（0.1%)
• 酚藏花红能使无活力的原 生质体染成红色，有活力 的原生质体不着色。
❖ 伊凡蓝(Evan’s blue)染色法(0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能 够摄取这种染料，活细胞不摄取。
第23页/共83页
影响原生质体数量和活力的因素
• 供试材料及预处理方法 • 酶解条件：
第6页/共83页
原生质体分离的方法
酶解分离法 机械分 离 法
第7页/共83页
机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液
中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原 生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组 织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
• 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种 类受到限制。
第4页/共83页
植物原生质体的分离和培养
Flash
❖ 材料预处理 ❖ 原生质体分离的方法 ❖ 原生质体纯化 ❖ 原生质体活力测定 ❖ 影响原生质体数量和活力的因素 ❖ 原生质体培养方法 ❖ 影响原生质体培养的因素 ❖ 原生质体再生过程
第5页/共83页
用于分离原生质体的材料
材料预处理
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某 些材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4℃处理较好。 ☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才 能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体， 才能获得高产量。
植物原生质体培养与体细胞杂交 PPT
常用得 PEG 和高 pH高Ca 相结合诱导融合得 具体操作程序:
混合双亲原生质体悬液,吸一小滴悬液于小 培养皿中,5~15min后原生质体沉到底面形成薄层;
每一小滴悬液慢慢加3小滴PEG溶液。PEG 溶液得组成:2难度ml 溶液(内含0、1 mol 葡萄糖、 10、5 mmol CaCI2、0、7 mol KH2PO4,KOH调节 pH到 5、5)加1g PEG-1560(或4000、6000,其她浓度)
45%,温度为19-21 度条件下生长得叶片可得到理想得原生
质体。
2、酶得种类
植物细胞壁就是由纤维素(25%~50%)、半纤维 素(50%左右)、果胶质(5%)组成。因此常用三种相 应得酶来降解细胞壁。一般认为纤维素酶和果胶 酶就是必需得,有些材料要加半纤维素酶。
商品酶制剂常含有杂质,对原生质体有不良影响, 有时要纯化。常用得方法就是将酶液在4 oC下过 Bio-Gel P6 或 Sephadex G-25。
3、渗透压得调控
如果溶液得渗透压和细胞内得渗透压不同,原生 质体有可能被涨破或收缩。因此在酶液、洗涤液和 培养液中渗透压应和原生质体内得相等或略大一些。 广泛使用得渗透压调节剂就是山梨醇和甘露醇,此 外还有蔗糖、葡萄糖、和麦芽糖,浓度约在0、40~0、 80mol/L。加入CaCl2、KH2PO4等能够提高原生质 膜得稳定性,增加完整原生质体得数目和活力。
6、原生质体得活力鉴定
(1)细胞壁染色法:
荧光增白剂——细胞壁染色剂,既可以鉴定细 胞壁就是否除净,也可检查原生质体细胞壁得再生 情况。染色后在荧光显微镜下观察(360~440nm), 染料与细胞壁形成显眼得绿色荧光,无细胞壁处则 无荧光反应,略带红色。
(2) 原生质体活力得测定:
植物细胞组织培养(PPT)
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06.10.2020
主要有:
➢ 原生质体（Protoplast）培养 ➢ 悬浮细胞培养 ➢ 组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织）培
养 ➢ 器官（胚，花药，子房，根和茎）培养
其中最常见的是愈伤组织培养。
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植物细胞组织培养范畴：
（广义）又叫离体培养：指从植物体分离出 符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等， 通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养 以获得再生的完整植株或生产具有经济价值 的其他产品的技术。
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三、植物组织培养的生理依据
植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具 有关键性作用。它包括：生长素类、细胞分裂素类、 赤霉素、脱落酸、乙烯等
生长素类主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管 苗的生根。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA等。其作用强 弱为2,4-D>NAA>IBA>IAA。
细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老， 促进芽的产生等作用。常用的有Zip(异戊烯腺嘌呤)、KT、6BA、ZT等作用强弱顺序为。Zip>KT>6-BA>ZT。
赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。 常用的为GA3。
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四、植物组织培养的原理
★植物细胞全能性（Cellular totipotency）： 任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成
种子培养
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3. 组织或愈伤组织培养(tissue， callus culture) ：是对植物体的各部分
组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、 木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄 壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈 伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形 成植株.
第八章第九章植物原生质体培养与体细胞杂交ppt课件
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
第二节 植物原生质体培养的发展与意义
原生质体的培养技术，近年来也有很大改进，特别 值得指出的是单个原生质体培养再生植株的成功 （Spangenberg等，1986）。
利用这一技术，可以在单细胞水平上研究不同类型原 生质体的生理特性，相互之间的作用以及单个原生质体 的遗传操作。对不同亲本单个原生质体进行融合的研究 也是有利的（Schweigo等，1987）。
饲养层培养法可大大提高水稻（Kyozu等，1987）、 玉米（Rhodes等，1988）等作物原生质体的植板率。 已有不少报道说明，琼脂糖能促进原生质体的分裂 （Shillto等，1983），并有利于对原生质体生长过程 的观察。
第一节
植物原生质体的定义及特点
（5）能摄取外来物质，可作遗传转化工具。
外来物质如核酸、蛋白质等高分子物质乃至病毒、 叶绿体、细胞核和细菌等，是进行遗传转化研究的 理想工具。
（6）变异为单细胞，变异性状易纯。
原生质体在培养中会发生变异，由于其是纯粹单 细胞，因此变异原生质体再生植株的变异性状会更 纯。
第三节 植物原生质体培养方法
2、酶法分离原生质体： 即用细胞壁降解酶，脱除植物细胞壁，获得原生
质体的方法（Cocking,1960）。目前多用此法。 常用的细胞壁降解酶种类有：纤维素酶、半纤维
素酶、果胶酶、R-10（日本纤维素酶）、蜗牛酶 胼胝质酶、EA3-867酶等。 国内常用EA3-867酶是一种复合酶，其成分含 纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶（上海植物生化研 究所产）。
特别是一直认为难以培养的禾谷类作物，例如，水 稻（Fujimura等，1985）、玉米（蔡起贵等，1987； Rhodes等，1988）、小麦（Harris等，1988；王海 波等，1989）、谷子（夏镇澳等，1989），以及高粱 的原生质体培养都已相继成功。
植物原生质体培养ppt课件
界面法：利用比重不同的溶液，经离心后使完整无 损的原生质体处在两液相的界面之间，而细胞碎片 等杂质沉于管底。
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苜蓿叶片原生 质体的纯化
完整的原生 质体
21
苜蓿叶 片的原 生质体
22
4、原生质体活力的测定
荧光素双醋酸酯（fluorescein diacetate，FDA） 染色法
活细胞
FDA
紫外光照射
分离植物原生质体的酶根据作用分为:纤维素酶、 半纤维素酶和果胶酶
12
② 酶溶剂 无机离子：提高质膜的稳定性；也可以提高原生质
体活力
牛血清白蛋白：防止酶解过程对细胞膜和细胞器的 破坏
pH缓冲剂：保持酶解液的酸碱环境的稳定，增加原 生质体的释放量和原生质体的稳定性。
13
③ 渗透压调节剂 目的：维持等渗环境，保证释放出来的原生质
植物原生质体培养
1
01 植物原生质体培养的 定义及其应用 2
原生质体概况
植物原生质体 (protoplast)：植 物细胞除去细胞 壁后所剩下的部 分。即是没有细 胞壁的裸露细胞
3
• 植物原生质体研究进展
➢ 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获 得成功。
➢ 1968年，Takebe et al.首次获得烟草叶肉原生质体培 养再生植株。
质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。 特点：固体培养基中的营养可以缓慢释放到液体培
养基中 如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养
物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂
34
（4）琼脂糖珠培养： 用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基，
滴在三角瓶中，待其凝固后，再加入适量 的液体培养基进行振荡培养。 特点：改进了培养物的通气和营养环境，从 而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团 的形成。
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苜蓿叶片原生 质体的纯化
完整的原生 质体
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苜蓿叶 片的原 生质体
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4、原生质体活力的测定
荧光素双醋酸酯（fluorescein diacetate，FDA） 染色法
活细胞
FDA
紫外光照射
分离植物原生质体的酶根据作用分为:纤维素酶、 半纤维素酶和果胶酶
12
② 酶溶剂 无机离子：提高质膜的稳定性；也可以提高原生质
体活力
牛血清白蛋白：防止酶解过程对细胞膜和细胞器的 破坏
pH缓冲剂：保持酶解液的酸碱环境的稳定，增加原 生质体的释放量和原生质体的稳定性。
13
③ 渗透压调节剂 目的：维持等渗环境，保证释放出来的原生质
植物原生质体培养
1
01 植物原生质体培养的 定义及其应用 2
原生质体概况
植物原生质体 (protoplast)：植 物细胞除去细胞 壁后所剩下的部 分。即是没有细 胞壁的裸露细胞
3
• 植物原生质体研究进展
➢ 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获 得成功。
➢ 1968年，Takebe et al.首次获得烟草叶肉原生质体培 养再生植株。
质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。 特点：固体培养基中的营养可以缓慢释放到液体培
养基中 如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养
物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂
34
（4）琼脂糖珠培养： 用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基，
滴在三角瓶中，待其凝固后，再加入适量 的液体培养基进行振荡培养。 特点：改进了培养物的通气和营养环境，从 而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团 的形成。
《植物组织培养》PPT课件 (2)
精选PPT
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三、原生质体培养方法
精选PPT
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1.液体浅层培养
1、材料的来源 2、前处理 3、酶处理 4、渗透压
精选PPT
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1、材料的来源
无菌试管苗叶片、上胚轴和 子叶
温室或生长室栽种的植物 培养细胞
精选PPT
12
温室或生长室栽种的植物
一般生长在下述条件下的植株能产生较好的效 果:低光照强度1000lx,短日照,温度范围20-25度, 相对湿度60%-80%,以及充足的氮肥供应.
甘蔗植株只有现在黑暗条件下培养12小时后分离 的原生质体才能原生质体，才会获得较精高选P的PT 原生质体产量。
14
B、消毒
C、保证酶解充分进行，促使酶溶液渗入到叶 片的细胞间隙中。
方法：
1.撕去叶片的下表皮，然后以无表皮的一面向下， 使叶片漂浮在酶溶液中；
Pectinase 黑曲霉 Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA Pectolyase Y-23 黑曲霉 Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan
半纤维素酶
Rhozyme HP-150 黑曲酶 Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA
–高活性低
–低原生质体损坏多
–纤维素酶，p H5.4，果胶酶5.8，两种混合5.4~5.6
–
精选PPT
23
4.渗透剂
植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之后如 果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能 涨破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和 原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大 些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。
植物的原生质体培养PPT课件
其它
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
.
19
3）原生质体分离过程：一步法 （以烟草叶片为例）
▪ 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
▪ 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块
▪ 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol
5、稳定性较差: 失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易
于受到渗透压等条件变化的影.响。
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原生质体用途
信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 膜的结构与功能 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理
融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器 引入各种细胞器 导入外源基因 诱发突变体
.
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2）酶解法
1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番 茄幼苗根尖中大量制备出原生质体；
常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗 牛酶等；
优点：条件温和、原生质体完整性好、活力 高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器 官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。
缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过 氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的 活力。
.
8
二、 原生质体的制备
不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结 构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不 一样。
1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛 的细胞，幼嫩的组织。
无菌试管苗叶片
上胚轴和子叶
培养细胞（愈伤组织）
.
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2、原生质体的分离 1）、机械法：利刃机械切割 2）、酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
.
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3）原生质体分离过程：一步法 （以烟草叶片为例）
▪ 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
▪ 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块
▪ 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol
5、稳定性较差: 失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易
于受到渗透压等条件变化的影.响。
6
原生质体用途
信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 膜的结构与功能 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理
融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器 引入各种细胞器 导入外源基因 诱发突变体
.
12
2）酶解法
1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番 茄幼苗根尖中大量制备出原生质体；
常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗 牛酶等；
优点：条件温和、原生质体完整性好、活力 高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器 官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。
缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过 氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的 活力。
.
8
二、 原生质体的制备
不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结 构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不 一样。
1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛 的细胞，幼嫩的组织。
无菌试管苗叶片
上胚轴和子叶
培养细胞（愈伤组织）
.
9
2、原生质体的分离 1）、机械法：利刃机械切割 2）、酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
第四章植物原生质体培养及细胞融合PPT演示课件
10
(3) 界面法
原理：利用两种比重不同的溶液，使完整的原生质体处 于两液相的界面之中。
在离心管中依次加入一层溶于培养基中的500 mmol/L蔗糖，一层溶于培养基中的140 mmol/L蔗糖和360 mmol/L山梨醇，最后一层加入悬浮于酶溶液中的原生质 体（含有300 mmol/L山梨醇、100 mmol/L CaCl2）,轻轻 混合，经5℃, 400g条件下，离心5min，完整的原生质体 悬浮在两层液体之间，叶绿体和破碎原生质体均在下面 液体中，取出界面中的原生质体，按上述方法再重复进 行一次。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。 缺点：获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。 但可避免酶制剂对原生质体的某些破坏作用（优点）。
5
液 泡
细胞溶质 质膜
植物细胞壁
胞间层 初生壁 次生壁
6
（2）酶解法 采用多糖水解酶将细胞壁降解而获得原生质的一种方法。 常用于降解细胞壁的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、 蜗牛酶和胼胝质酶（成熟花粉粒、四分体小孢子）等。 1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分 离原生质体的可能性。
原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便 于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍 可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
原生质培养首先在烟草上获得成功Nagata&Takebe（1971），到1993 有49个科，146个属的320多种植物培养成功，得到再生植株。
预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、 和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。
4
(3) 界面法
原理：利用两种比重不同的溶液，使完整的原生质体处 于两液相的界面之中。
在离心管中依次加入一层溶于培养基中的500 mmol/L蔗糖，一层溶于培养基中的140 mmol/L蔗糖和360 mmol/L山梨醇，最后一层加入悬浮于酶溶液中的原生质 体（含有300 mmol/L山梨醇、100 mmol/L CaCl2）,轻轻 混合，经5℃, 400g条件下，离心5min，完整的原生质体 悬浮在两层液体之间，叶绿体和破碎原生质体均在下面 液体中，取出界面中的原生质体，按上述方法再重复进 行一次。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。 缺点：获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。 但可避免酶制剂对原生质体的某些破坏作用（优点）。
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液 泡
细胞溶质 质膜
植物细胞壁
胞间层 初生壁 次生壁
6
（2）酶解法 采用多糖水解酶将细胞壁降解而获得原生质的一种方法。 常用于降解细胞壁的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、 蜗牛酶和胼胝质酶（成熟花粉粒、四分体小孢子）等。 1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分 离原生质体的可能性。
原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便 于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍 可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
原生质培养首先在烟草上获得成功Nagata&Takebe（1971），到1993 有49个科，146个属的320多种植物培养成功，得到再生植株。
预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、 和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。
4
植物组织培养PPT课件
1978年，Melchers等进行了番茄和马铃薯的体细胞杂交。
1979年，Marton提出了利用植物原生质体和土壤农杆菌共培养的方法进行转化。 1981年，Larkin和Scowcroft引入“体细胞无性系变异（Somaclonal variation）”这一术语。 1982年，Krens等的工作证明，原生质体可以摄入裸露的DNA，表明可以用外源DNA对原生 质体进行遗传转化。 1982年，Zimmermann利用电刺激进行原生质体融合。 1985年，Horsch等用土壤农杆菌对叶盘进行感染和转化，并得到再生的转化植株。
1948年，Skoog等通过对烟草茎段和髓培养发现，不定芽和不定根的发生由生长素/腺嘌呤的比例决 定。
1950年，Ball从红杉愈伤组织培养中再生获得器官。
1952年，Morel和Martin通过分生组织培养获得大丽花的脱毒植株，同年，首次应用微型嫁接技 术。
1953年，Tuleche首次从花粉培养中获得银杏的单倍体愈伤组织。
蒜等。
茎尖培养脱毒
virus-free tissue
脱毒马铃薯种薯生物反应器液体培养
2、用于植物遗传育种
包括种质资源离体保存；花粉花药培养产生单倍体；胚乳培 养产生三倍体；胚培养拯救杂种胚克服远缘杂交障碍；原生质 体培养进行体细胞杂交；植物体细胞无性系变异诱导和筛选； 用于植物基因转移操作等。
2、植物组织培养技术的初步形成（1930-1960年）
1933年，我国植物生理学家李继侗培养银杏胚胎，并发现银杏胚乳提取液可促进离体胚的生长。
1937年，White发现B族维生素对离体根培养的重要性。并指出IAA对植物生长发育的控制起重要 作用。
1937,1938年，Gantheret在培养基中加入上述生长因子，使得柳树形成层诱导形成的愈伤组织连续 生长。Nobecomt对烟草种间杂种茎段的形成层细胞培养也得到了类似的结果。
1979年，Marton提出了利用植物原生质体和土壤农杆菌共培养的方法进行转化。 1981年，Larkin和Scowcroft引入“体细胞无性系变异（Somaclonal variation）”这一术语。 1982年，Krens等的工作证明，原生质体可以摄入裸露的DNA，表明可以用外源DNA对原生 质体进行遗传转化。 1982年，Zimmermann利用电刺激进行原生质体融合。 1985年，Horsch等用土壤农杆菌对叶盘进行感染和转化，并得到再生的转化植株。
1948年，Skoog等通过对烟草茎段和髓培养发现，不定芽和不定根的发生由生长素/腺嘌呤的比例决 定。
1950年，Ball从红杉愈伤组织培养中再生获得器官。
1952年，Morel和Martin通过分生组织培养获得大丽花的脱毒植株，同年，首次应用微型嫁接技 术。
1953年，Tuleche首次从花粉培养中获得银杏的单倍体愈伤组织。
蒜等。
茎尖培养脱毒
virus-free tissue
脱毒马铃薯种薯生物反应器液体培养
2、用于植物遗传育种
包括种质资源离体保存；花粉花药培养产生单倍体；胚乳培 养产生三倍体；胚培养拯救杂种胚克服远缘杂交障碍；原生质 体培养进行体细胞杂交；植物体细胞无性系变异诱导和筛选； 用于植物基因转移操作等。
2、植物组织培养技术的初步形成（1930-1960年）
1933年，我国植物生理学家李继侗培养银杏胚胎，并发现银杏胚乳提取液可促进离体胚的生长。
1937年，White发现B族维生素对离体根培养的重要性。并指出IAA对植物生长发育的控制起重要 作用。
1937,1938年，Gantheret在培养基中加入上述生长因子，使得柳树形成层诱导形成的愈伤组织连续 生长。Nobecomt对烟草种间杂种茎段的形成层细胞培养也得到了类似的结果。
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第七章 植物原生质体的分离与培 养
• 7.1原生质体培养的意义及分离技术—原生质体制备 • 7.2原生质体的培养与植株再生，原生质体的融合及体细 • 胞杂种的鉴定与筛选
植物原生质体培养和细胞融合
概念及研究进展 原生质体的分离与培养
原生质体融合
第一节 原生质体培养的意义及分离技术
原生质体(protoplast)： 脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球 原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。
0.6mL 0.45M蔗糖
含原生 ❖ 优点：可以收集到数 质体带 量较大的纯净原生质
体，同时避免收集过
不连续梯度法
程中原生质体因相互 挤压而破碎。
原生质体鉴定
❖ 低渗爆破法 ❖ 荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%)
原生质体活力测定
❖ 形态识别
形态完整、富含 细胞质、颜色新 鲜的正常球形， 放入低渗溶液中， 可正常膨大。
Protoplast
飘浮法
❖ 采用比原生质体密度大的高渗溶液 （蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生 质体漂浮在液体表层的纯化方法。
❖ 优点：
可以避免分离的原生质体因震荡被 组织碎片撞击而破损。
所用药品简单，成本低。
❖ 缺点及补救措施：
对离心力要求比较严格，掌握不好， 原生质体则不易漂浮。可采用不同浓 度和不同离心速度分次漂浮的方法。
❖ 酚藏花红染色法（0.1%) 酚藏花红能使无活力的原 生质体染成红色，有活力 的原生质体不着色。
❖ 伊凡蓝(Evan’s blue)ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ色法(0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能 够摄取这种染料，活细胞不摄取。
影响原生质体数量和活力的因素
❖ 供试材料及预处理方法 ❖ 酶解条件：
酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度
酶解分离法 机械分 离 法
机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预
处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体 收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤 口处可释放出完整的原生质体。
❖ 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少， 能够用此法产生原生质体的植物种类受到 限制。
❖ 优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的 破坏作用。
❖ 渗透压稳定剂 ❖ 质膜稳定剂 ❖ 分离条件：
Organelle, DNA uptake
Cell cloning
意义
❖ 植物细胞育种中的核质替换 ❖ 细胞质杂种的获得 ❖ 远缘杂交创造新物种细胞 ❖ 细胞器的互作研究
植物原生质体的分离和培养
Flash
❖ 材料预处理 ❖ 原生质体分离的方法 ❖ 原生质体纯化 ❖ 原生质体活力测定 ❖ 影响原生质体数量和活力的因素 ❖ 原生质体培养方法 ❖ 影响原生质体培养的因素 ❖ 原生质体再生过程
来源
生产厂家
纤维素酶类
Onozuka R-10 Cellulysin
绿色木霉 绿色木霉
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
Calbiochem.,San Diego,CA 92037, USA
Driselase
Irpex lutens
Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo,Japan
不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。
应用
Regenerative ability
Cell differentiation
Ontogenic processes
Organogenesis
Somatic genetics
Protoplast system
Cell physiology
Cell fusion
用于分离原生质体的材料
材料预处理
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某 些材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4℃处理较好。 ☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才 能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体， 才能获得高产量。
原生质体分离的方法
酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁的混合
等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞 壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。
❖ 常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、 崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶 [Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。
酶
❖ 亚原生质体(subprotoplast)
在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的减少而形成的一 些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。
❖ 核质体(nuclearplast)
由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微 小原生质体。
❖ 胞质体(cytoplast)
酶
来源
生产厂家
果胶酶类
Macerozyme R-10
Pectinase Pectolyase Y-23
半纤维素酶 RhozymeHP-150
根霉
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
黑曲霉 Sigma Chemical Co.
黑曲霉 Seishin Pharm. Co.
原生质体活力测定
❖ 荧光显微镜识别(FDA法)
FDA (fluorescein diacetate) 本身不发荧光也不具有 极性，能自由穿过细胞 质膜。活细胞内FDA可 以被酯酶裂解，将能发 荧光的极性部分释放出 来。荧光素则不能自由 穿越质膜，在完整的活 细胞内积累。
使用浓度： 0.01%
原生质体活力测定
沉降法
❖ 利用比重原理，在具有一定渗透压的溶 液中，先进行过滤然后低速离心，使纯 净完整的原生质体沉积于试管底部。
❖ 优缺点：
纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互
挤压，常引起原生质体的破碎。
12mL
0.45M 甘露醇
碎片带
❖ 又称界面法，采用两 种密度不同的溶液形 成不连续梯度，通过 离心使原生质体与破 损细胞分别处于不同 液相中，从而纯化原 生质体的方法。
Ltd., Tokyo, Japan
黑曲霉 Rohm and Hass Co.,
Rhiladelphia, UAS
酶解法的优缺点
❖ 优点：获得量大，适用广泛。 ❖ 缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、
过氧化物酶以及酚类物质。 会影响所获原生质体的活力。
原生质体纯化的方法
漂浮法 沉降法 不连续梯度法
• 7.1原生质体培养的意义及分离技术—原生质体制备 • 7.2原生质体的培养与植株再生，原生质体的融合及体细 • 胞杂种的鉴定与筛选
植物原生质体培养和细胞融合
概念及研究进展 原生质体的分离与培养
原生质体融合
第一节 原生质体培养的意义及分离技术
原生质体(protoplast)： 脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球 原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。
0.6mL 0.45M蔗糖
含原生 ❖ 优点：可以收集到数 质体带 量较大的纯净原生质
体，同时避免收集过
不连续梯度法
程中原生质体因相互 挤压而破碎。
原生质体鉴定
❖ 低渗爆破法 ❖ 荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%)
原生质体活力测定
❖ 形态识别
形态完整、富含 细胞质、颜色新 鲜的正常球形， 放入低渗溶液中， 可正常膨大。
Protoplast
飘浮法
❖ 采用比原生质体密度大的高渗溶液 （蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生 质体漂浮在液体表层的纯化方法。
❖ 优点：
可以避免分离的原生质体因震荡被 组织碎片撞击而破损。
所用药品简单，成本低。
❖ 缺点及补救措施：
对离心力要求比较严格，掌握不好， 原生质体则不易漂浮。可采用不同浓 度和不同离心速度分次漂浮的方法。
❖ 酚藏花红染色法（0.1%) 酚藏花红能使无活力的原 生质体染成红色，有活力 的原生质体不着色。
❖ 伊凡蓝(Evan’s blue)ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ色法(0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能 够摄取这种染料，活细胞不摄取。
影响原生质体数量和活力的因素
❖ 供试材料及预处理方法 ❖ 酶解条件：
酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度
酶解分离法 机械分 离 法
机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预
处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体 收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤 口处可释放出完整的原生质体。
❖ 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少， 能够用此法产生原生质体的植物种类受到 限制。
❖ 优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的 破坏作用。
❖ 渗透压稳定剂 ❖ 质膜稳定剂 ❖ 分离条件：
Organelle, DNA uptake
Cell cloning
意义
❖ 植物细胞育种中的核质替换 ❖ 细胞质杂种的获得 ❖ 远缘杂交创造新物种细胞 ❖ 细胞器的互作研究
植物原生质体的分离和培养
Flash
❖ 材料预处理 ❖ 原生质体分离的方法 ❖ 原生质体纯化 ❖ 原生质体活力测定 ❖ 影响原生质体数量和活力的因素 ❖ 原生质体培养方法 ❖ 影响原生质体培养的因素 ❖ 原生质体再生过程
来源
生产厂家
纤维素酶类
Onozuka R-10 Cellulysin
绿色木霉 绿色木霉
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
Calbiochem.,San Diego,CA 92037, USA
Driselase
Irpex lutens
Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo,Japan
不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。
应用
Regenerative ability
Cell differentiation
Ontogenic processes
Organogenesis
Somatic genetics
Protoplast system
Cell physiology
Cell fusion
用于分离原生质体的材料
材料预处理
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某 些材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4℃处理较好。 ☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才 能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体， 才能获得高产量。
原生质体分离的方法
酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁的混合
等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞 壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。
❖ 常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、 崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶 [Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。
酶
❖ 亚原生质体(subprotoplast)
在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的减少而形成的一 些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。
❖ 核质体(nuclearplast)
由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微 小原生质体。
❖ 胞质体(cytoplast)
酶
来源
生产厂家
果胶酶类
Macerozyme R-10
Pectinase Pectolyase Y-23
半纤维素酶 RhozymeHP-150
根霉
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
黑曲霉 Sigma Chemical Co.
黑曲霉 Seishin Pharm. Co.
原生质体活力测定
❖ 荧光显微镜识别(FDA法)
FDA (fluorescein diacetate) 本身不发荧光也不具有 极性，能自由穿过细胞 质膜。活细胞内FDA可 以被酯酶裂解，将能发 荧光的极性部分释放出 来。荧光素则不能自由 穿越质膜，在完整的活 细胞内积累。
使用浓度： 0.01%
原生质体活力测定
沉降法
❖ 利用比重原理，在具有一定渗透压的溶 液中，先进行过滤然后低速离心，使纯 净完整的原生质体沉积于试管底部。
❖ 优缺点：
纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互
挤压，常引起原生质体的破碎。
12mL
0.45M 甘露醇
碎片带
❖ 又称界面法，采用两 种密度不同的溶液形 成不连续梯度，通过 离心使原生质体与破 损细胞分别处于不同 液相中，从而纯化原 生质体的方法。
Ltd., Tokyo, Japan
黑曲霉 Rohm and Hass Co.,
Rhiladelphia, UAS
酶解法的优缺点
❖ 优点：获得量大，适用广泛。 ❖ 缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、
过氧化物酶以及酚类物质。 会影响所获原生质体的活力。
原生质体纯化的方法
漂浮法 沉降法 不连续梯度法